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目前全球尚无预防和治疗新冠肺炎（COVID-19）确认的特效药物。有学者试图遴选已有的抗病毒药物，以期尽快开发“老药新用”的治疗方案。国家卫生健康委员会陆续发布了7版试行《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，其中，广谱抗病毒药物利巴韦林被作为可试用的临床治疗药物。
利巴韦林（ribavirin）常用剂型有注射剂、片剂、口服液、气雾剂等，国外临床上多以雾化剂用于成人和儿童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治疗[1]。体外研究表明[2]，利巴韦林可增强干扰素的体外活性，在治疗SARS-CoV感染者中，诊断后立即使用利巴韦林时治疗效果较好[3]。利巴韦林对DNA和RNA病毒均具有抑制作用，通常以雾化剂用于成人和儿童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治疗。美国食品药品管理局（FDA）于1986年首次批准利巴韦林吸入溶液气雾剂（Virazole®，USP）[4]，于1992年上市，而说明书中明确规定用于严重下呼吸道感染的住院患儿，且全程气雾治疗3～7 d，可见其应用的严格限制。根据国内多家临床中心的试验数据表明，与利巴韦林颗粒剂相比，国内的利巴韦林气雾剂（信韦林）达到同等的治疗效果时，虽然用药剂量大幅下降，但不良反应率无明显差异[5-8]，表明利巴韦林吸入溶液气雾剂（Virazole®，USP）和利巴韦林气雾剂（信韦林）可能存在不良反应较大的缺陷，临床应用受到一定的限制。
脂质体定量吸入粉雾剂（DPI）是肺部给药系统的研究热点之一。脂质体由于类似细胞结构而具有被动靶向性，作为药物载体常用于肺部给药，有利于抗病毒药物直接递送并作用于肺部细胞，抑制病毒的繁殖，特定粒径的脂质体粉雾剂可使药物不同程度地的分布于人体上、下呼吸道，从而发挥更好的临床治疗效果[9-10]。利巴韦林水溶性较好，亲脂性较差，如图1的结构式所示，不易被细胞渗透吸收，采用脂质体包裹，并制成粉雾剂给药至呼吸道或肺泡组织，可实现肺部沉积增强的作用效果，同时降低不良反应。本文根据临床急需及利巴韦林的药物理化性质，结合吸入制剂肺部给药方面的治疗优势，设计研制了一种利巴韦林脂质体吸入粉雾剂。以此开展设计研究，尝试开发抗病毒药物新型给药系统，以期为扩大利巴韦林临床使用范围，也为制剂学基础研究提供参考。
图 1 利巴韦林化合物的结构式
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高效液相色谱仪（Agilent 1200）；ME104E电子天平（METTLER TOLEDO）；EYELA N-1000旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；Niro NS2006L高压匀质机（意大利GEA Niro Soavi公司）；Nano NS90粒度检测仪（英国马尔文仪器有限公司）；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜（日本日立公司）。
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利巴韦林原料药（纯度>98%，西安康诺化工有限公司）；利巴韦林对照品（629-200202，中国食品药品检定研究院）；大豆卵磷脂（SPC）、脱氧胆酸钠（SDC）（北京化学试剂公司）；N，N-二甲基甲酰胺、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯，北京化学试剂公司）；蒸馏水。
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参照美国药典第40版中“利巴韦林”含量测定方法[11]，采用高效液相色谱法测定。色谱条件：色谱柱为Carbomix H-NP5（7.8 mm×100 mm，5 μm）；流动相硫酸溶液调整pH至2.5±0.1；流速：0.6 ml/min；柱温：60 ℃；检测波长UV 207 nm；进样量10 μl，取利巴韦林对照品适量，流动相溶解稀释至浓度为0.025 mg/ml，过滤，进样检测。取利巴韦林脂质体冻干粉适量，加入无水乙醇少量破乳，呈透明溶液后流动相稀释，制成浓度0.025 mg/ml供试品溶液；同样方式处理阴性样品溶液。在该色谱条件下得到图2的色谱图，图中利巴韦林峰型较佳，出峰时间适宜，阴性对照无干扰。
图 2 利巴韦林高效液相色谱图（依次为空白样品、对照品溶液、供试品溶液）
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取大豆卵磷脂（5 mmol/L），脱氧胆酸钠（5 mmol/L），为制备具有高稳定性的双分子膜，在处方中加入适量维生素E置于250 ml的茄形瓶中，加入无水乙醇溶解，超声，至呈透明黄色溶液；将此溶液置旋转蒸发仪上旋转蒸发除去溶剂成膜；另取利巴韦林原料药溶解于磷酸盐缓冲液中（20 mg/ml），溶解完全后匀速加入至茄形瓶内，并于40 ℃水浴温度水化薄膜，直到完全水化呈近均一透明的乳白色溶液；高压均质机下将上述溶液均质，即得到粒径100~200 nm的利巴韦林脂质体溶液。加入冻干保护剂乳糖, 溶解摇匀后置西林瓶中，启动冷冻干燥程序，即得疏松利巴韦林脂质体冻干粉。
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取载药脂质体经处理后于透射电镜下观察，呈类圆形球状物，直径约200 nm，见图3。
图 3 自制利巴韦林脂质体（左）透射电镜图与脂质体冻干粉（右）高倍镜图
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将粉末通过下孔径为5 mm 的玻璃漏斗，从10 cm的高度缓慢、均匀地落入平板上，形成圆锥体。测量圆锥体的高度（h）和基底的半径（r），按公式计算休止角（θ，tanθ＝h/r）。粉末休止角为37～40°，流动性较好。取量筒，自由落体方式装入脂质体冻干粉，记录质量与体积，计算松密度约0.25 g/ml。
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取利巴韦林脂质体冻干粉适量，纯化水溶解得脂质体复溶物，取复溶物适量加入无水乙醇少量破乳，呈透明溶液后用流动相稀释，制成0.025 mg/ml供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测冻干粉含量。
经过前期实验对比，本研究采用Sephadex G-50柱层析法测定包封率。分别精密量取1 ml脂质体和冻干粉复溶物上柱，用纯化水洗脱，流速0.5 d/s，从洗脱液由澄清变乳白色开始收集至洗脱液再次变澄清（约15 ml），置50 ml容量瓶中，以乙醇定容至刻度，振摇破乳；10 μl进样分析，记录色谱图，计算包封药物含量（W包）；另各取1 ml脂质体溶液及冻干粉复溶物置50 ml容量瓶中，乙醇稀释至刻度，振摇破乳，10μl进样分析，记录色谱图，计算总药量（W总）。以包封率=（W包/W总）×100%，计算结果见表1。
表 1 利巴韦林脂质体冻干粉含量与包封率
项目 样品 No.1 No.2 No.3 平均值 含量（mg/g） 脂质体冻干粉末 9.4 8.6 9.3 9.1 包封率 /% 冻干前脂质体溶液 64.23 63.83 66.34 64.80 脂质体冻干粉复溶液 63.43 61.65 64.10 63.06 结果表明，按照初步拟定方法制得的脂质体包封率约63%，冻干前后数据无明显差别，复溶效果较好，载药量较高，但包封率较低，处方工艺需要进一步优化。
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取本品复溶液适量，纯化水再次稀释100倍，于马尔文粒径仪检测，如表2所示，本品冻干前后溶液粒径约160 nm，聚合物分散指数（PDI）、电位均较好，表明稳定性较好。
表 2 利巴韦林脂质体冻干复溶液粒径、PDI与电位
样品 No.1 No.2 No.3 平均值 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径 电位 冻干前溶液 148.3 nm/0.57 −45.4 mv 163.7 nm/0.63 −41.8 mv 172.6 nm/0.39 −40.5 mv 161.5 nm −42.6 mv 冻干复溶液 147.8 nm/0.58 −42.5 mv 161.8 nm/0.65 −38.6 mv 181.7 nm/0.41 −39.1 mv 163.8 nm −40.1 mv -
脂质体具有优良的两亲性，冻干保护剂亦有很好的亲水性。取本品冻干粉5 g置10 ml容量瓶中，加水10 ml，轻轻振摇即刻溶解完成，形成均一的乳白色胶束溶液，说明本品溶解性较好。
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病毒通过侵入人体呼吸道黏膜上皮细胞而感染，并在细胞内进行复制与表达，再释放至细胞外感染宿主其他细胞，最终导致机体产生过度免疫反应。与一些在下呼吸道的细胞内进行复制繁殖的高致病性病毒类似，COVID-19导致下呼吸道症状较为明显。故若将抗病毒药物递送至下呼吸道，直达病灶，并进入被感染的机体上皮细胞内，可能更好地发挥抑制或清除病毒的作用。通常肺吸入给药后可直接将药物运送至肺组织，在局部起效，与全身给药治疗肺部疾病相比较，可明显减少药物用量，降低药物在其他部位分布与吸收造成的不良反应，加之粉雾剂具备给药剂量准确、无需抛射剂、方便、易用及肺部靶标部位药物沉积量高等优势，是肺部疾病治疗药物较为理想的给药途径。
将利巴韦林通过脂质体包裹技术实现粉雾剂肺部细胞靶向治疗，相比普通口服与常规气雾剂可减少用药剂量和降低不良反应，理论上具有一定的可行性。因而，对轻、中度COVID-19感染患者也许是一种潜在的抗病毒药物治疗方式。
经对利巴韦林脂质体粉雾剂的初步制剂技术探究，结果证明制备的制剂满足粉雾剂的基本要求。由于粉雾剂具有无需抛射剂、药物相对稳定的优势[12]，而且给药装置易于携带，操作简单、给药剂量相对准确等优点，故适合开发研制成利巴韦林脂质体吸入粉雾剂。此外，制备的利巴韦林脂质体冻干粉还可开发为溶液气雾剂，故在药剂开发方面也有较好前景。然而，本实验尚为初步研究，仍需要对制剂处方工艺进一步优化，以进一步提高包封率与改善整体粒径分布等性能。如要进入临床试用，还需对给药装置筛选、体内外药物沉积、药效学等进行深入考察，以满足临床使用的基本要求。
Preparation and preliminary evaluation of ribavirin liposome-powder inhaler
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摘要:
目的 为解决利巴韦林存在的明显不良反应问题，研制利巴韦林脂质体吸入粉雾剂，并初步评价其质量特性。 方法 采用薄膜分散法制备利巴韦林脂质体，再冻干制备成利巴韦林脂质体粉雾剂，并考察制剂的外观形态、流动性、松密度、包封率、复溶液粒径、聚合物分散指数、电位及亲水性。 结果 利巴韦林脂质体粉雾剂形态、粒径、电位、流动性与亲水性均较好，能满足粉雾剂給药的基本要求。 结论 应用该方法制备利巴韦林脂质体粉雾剂的制剂技术是可行的，为后续体内外研究提供制剂学技术依据。 Abstract:Objective In order to solve the obvious adverse reactions of ribavirin, to develop ribavirin liposome inhalation powder and to evaluate its quality characteristics. Methods The ribavirin liposomes were prepared by the thin film dispersion method, and then lyophilized to prepare ribavirin liposome powder. The appearance, fluidity, bulk density, encapsulation efficiency, particle size of the complex solution, PDI, potential and hydrophilicity were examined. Results Ribavirin liposome powder has good morphology, particle size, potential, fluidity and hydrophilicity, which can meet the basic requirements of powder medicine for drug administration. Conclusion The technique of preparing ribavirin liposome powder aerosol preparation by this method is feasible, and it provides the basic technology for future in vivo and in vitro studies. -
Key words:
- ribavirin /
- liposomal /
- lyophilized /
- powder inhalers
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据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。
1.1.2 细胞株
人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。
1.1.3 仪器
AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。
1.2 方法
1.2.1 曲妥珠单抗的表达与纯化
用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。
1.2.2 流式细胞术
细胞按3×104个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。
1.2.3 细胞培养
采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO2，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.4 CCK8检测细胞增殖
将细胞按1×104个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A对照−A实验）/（A对照−A背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。
1.2.5 Western blot检测
根据分组将细胞按5×105个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。
1.2.6 统计学方法
采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度
将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×103）左右（图1）。
2.2 流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性
采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC50值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC50值为1.203 nmol/L，两者EC50值大约一致（图2）。
2.3 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 3 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；*P<0.05，****P<0.0001，与空白组比较；△△△△P<0.0001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.4 用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用
采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。
图 4 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；△△△P<0.001，与IgG组比较；####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较2.5 Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响
图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。
图 5 EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；****P<0.0001，与对照组比较；##P<0.01、###P<0.001、 ####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较3. 讨论
ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×105的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。
曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。
茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长[22]。
为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。
本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。
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表 1 利巴韦林脂质体冻干粉含量与包封率
项目 样品 No.1 No.2 No.3 平均值 含量（mg/g） 脂质体冻干粉末 9.4 8.6 9.3 9.1 包封率 /% 冻干前脂质体溶液 64.23 63.83 66.34 64.80 脂质体冻干粉复溶液 63.43 61.65 64.10 63.06 
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表 2 利巴韦林脂质体冻干复溶液粒径、PDI与电位
样品 No.1 No.2 No.3 平均值 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径 电位 冻干前溶液 148.3 nm/0.57 −45.4 mv 163.7 nm/0.63 −41.8 mv 172.6 nm/0.39 −40.5 mv 161.5 nm −42.6 mv 冻干复溶液 147.8 nm/0.58 −42.5 mv 161.8 nm/0.65 −38.6 mv 181.7 nm/0.41 −39.1 mv 163.8 nm −40.1 mv
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