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成纤维细胞的增殖和活化引起的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的累积是肺纤维化的主要病理基础[1]。肺纤维化治疗难度大，且发展到晚期纤维化过程不可逆转，而一些药物的长期使用会提高肺纤维化的发生风险，对于这临床的一类并发症应格外重视。来氟米特（leflunomide，LEF）是治疗类风湿性关节炎的常用药物，但是有临床报道称，长期服用LEF可能提高肺纤维化的发生风险，但是也有研究认为LEF对肺纤维化影响不大[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）长度约为18~22个核苷酸，虽然不具备编码功能，但是可通过识别和碱基配对的方式与靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的3'非翻译区（3'UTR）结合，从而参与基因表达的调控[3]。miR-449a具有抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡的作用[4]，并且最新研究发现miR-449a可能与肺纤维化有关，在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中，miR-449a可通过调节自噬缓解纤维化[5]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是调节细胞增殖、凋亡和分化的重要蛋白，其磷酸化后可通过信号转导调控细胞生物学行为[6]。本文发现了miR-449a的过表达会显著缓解由LEF引起的肺成纤维细胞的增殖，而沉默miR-449a对细胞的影响相反，这可能是LEF引起肺纤维化的机制之一，报道如下。
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人肺成纤维细胞MRC-5购自美国ATCC；LEF（苏州长征-欣凯制药有限公司，国药准字H20000550）；RPMI-1640培养基以及血清购自美国Gibco公司；miR-449a mimic和inhibitor质粒由Genepharma公司构建；
LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；荧光显微镜（Olympus BX51）；Model 680酶标仪（Bio-Rad，美国）；流式细胞仪（BD FACScanto II，Becton Dickinson，美国）。CCK-8试剂盒（武汉华美公司）；凋亡试剂盒（美国Thermo Fisher）；PVDF膜（美国Bio-Rad公司）；抗体购自美国Abcam公司，逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa（日本）。
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MRC-5细胞在RPMI-1640培养基中培养，温度为37 ℃，CO2浓度为5%。细胞被分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。其中LEF+mimic组和mimic组通过转染miR-449a mimic质粒过表达miR-449a的水平，LEF+inhibitor组和inhibitor组通过转染miR-449a inhibitor质粒使miR-449a的水平降低。对照组转染空载质粒。LEF组、LEF+mimic组和LEF+inhibitor组分别在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。
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将细胞裂解后收集总RNA并检测纯度，通过逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行PCR反应，步骤如下：95 ℃下2 min，95 ℃下15 s，60 ℃下25 s和72 ℃下60 s，共进行40个循环。以U6作为内参，使用2-ΔΔCT法分析miR-449a水平。引物序列如下（5′-3′），miR-449a上游引物：TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC，下游引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT，下游引物：TATGGCTAGCATGACTGGT。
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将细胞调节至2×104个细胞/ml的密度，接种于96孔板中，100 μl/孔。再培养24、48和72 h后将10 μl的CCK-8试剂加入至每孔中，37 ℃下培养2 h。在酶标仪上测量450 nm处的吸光度（A），计算相对细胞活力。
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分别将各组细胞200个细胞在6孔板中培养，每3天补充一次培养基，培养2周。用PBS洗涤细胞并加入甲醇固定15 min，加入使用结晶紫染色30 min，在显微镜下观察克隆形成的数目，≥50个细胞的集落为一个克隆形成。
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将细胞洗涤后重悬于结合缓冲液中，使细胞浓度为2.5×105个/ml。根据试剂盒说明书将试剂加入细胞中，并通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。
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通过免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）和胶质蛋白I（collagen I，Col I）的表达情况分析细胞的表型和细胞外基质。然后将细胞在4 ℃下使用α-SMA的抗体染色过夜，用异硫氰酸四甲基罗丹明的山羊抗兔抗体染色30 min。然后再于避光条件下利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对细胞核染色10 min，通过荧光显微镜观察。
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通过Western blot检测JNK和磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的水平。将细胞裂解、离心收集总蛋白并检测蛋白浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳分离蛋白，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。分别加入一抗（稀释1:1 000）室温震荡2 h，后在4 ℃孵育过夜，加入二抗（稀释1:5 000），孵育3 h。通过Quantity One软件分析条带的灰度值并以GAPDH为参照计算目标蛋白质的表达量。
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实验数据采用SPSS 19软件进行处理，实验结果以平均值±标准偏差（SD）表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，统计学显著性表示为P<0.05。
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使用qPCR检测各组细胞中miR-449a表达水平。结果显示mimic组miR-449a水平显著高于对照组，inhibitor组的miR-449a表达水平显著低于对照组（P<0.05），说明转染实验成功。LEF组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a显著低于LEF组（P<0.05）。表明LEF可抑制人成纤维细胞中miR-449a的表达，见表1。
表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
使用CCK-8法检测各组细胞的相对细胞活力。结果显示在第48小时和第72小时，LEF组和inhibitor组的细胞活力显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的细胞活力显著低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的细胞活力显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05），过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞的细胞活力的作用，而降低miR-449a的水平会进一步促进细胞活力，见表2。
表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的克隆形成数目显著高于对照组而细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的克隆形成数目显著低于对照组而细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的克隆形成数目显著低于LEF组而细胞凋亡率显著高于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的克隆形成数目在LEF的基础上进一步升高而细胞凋亡率进一步降低（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进肺成纤维细胞增殖和抑制凋亡的作用，而低表达miR-449a会加剧LEF的作用，见表3。
表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
本次研究通过免疫荧光技术检测了各组α-SMA的水平来分析细胞向肌细胞转化情况，检测Col I的水平来分析ECM水平。其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光为α-SMA或Col I蛋白。LEF组和inhibitor组的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），而mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。此外，LEF+mimic组的相对荧光强度显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组的相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可部分逆转LEF对促进人成纤维细胞α-SMA和Col I表达的促进作用，见图1、图2和表4。
图 1 免疫荧光检测各组细胞中α-SMA的表达水平（×400）
图 2 免疫荧光检测各组细胞中Col I的表达水平（×400）
表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组，mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），并且LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组（P<0.05），LEF+inhibitor组中p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。过表达miR-449a可逆转LEF促进JNK蛋白磷酸化的作用，见表5。
表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 -
肺纤维化是一种慢性进行性肺部疾病，但是临床上尚无治疗肺纤维化的特效方法和药物，目前用于进行性肺纤维化的唯一有效治疗方法是肺移植[7]，若患者未接受肺移植，通常在诊断后的3至5年内出现肺功能丧失导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的病理特征包括纤维增生和ECM沉积过多，但是这个过程较为漫长，并且在早期症状不明显，也缺乏相应的诊断手段，在患者确诊为肺纤维化时再采取治疗效果有限。因此虽然LEF是否会引起肺纤维化尚无定论，但是由于肺纤维化的恶性预后和致死率，LEF治疗过程中的肺纤维化风险仍是临床重点关注的问题。研究LEF促进肺纤维化的机制是寻找诊断和治疗肺纤维化新方法的重要途径。
LEF是一种调节免疫的药物，其作用机制通过抑制二氢乳清酸脱氢酶来抑制T淋巴细胞和其他类型细胞的细胞周期进程[8]。LEF引起的肺纤维化并导致患者死亡的病例随着LEF使用时间的增加而升高[9]。一项长期的调查随访报告指出，在5911例使用LEF治疗的患者中，共出现了80例间质性肺病，其中有27例患者死亡，并且结果判定其中有18例患者的死亡是由于LEF直接导致[10-11]。在肺纤维化的过程中，成纤维细胞向成肌纤维细胞转化和ECM的累积是两大特点[12]。因此本文主要分析了LEF对人肺成纤维细胞的影响，结果显示LEF可显著促进成纤维细胞的细胞活力和增殖，抑制其凋亡，并诱导细胞表达大量的α-SMA蛋白和ECM累积。α-SMA是上皮细胞向间质细胞转化的检测指标之一，也是体外研究肺纤维化的最常用指标，而Col I是ECM的主要成分[13]。作者提示了LEF可通过活化成纤维细胞和促进其增殖参与肺纤维化。
为进一步分析LEF调节肺成纤维细胞增殖和表达α-SMA的机制，我们检测了miR-449a在其中的作用。miR-449a是近年来新发现的一种miRNA，研究已经证实了其可通过靶向并诱导靶基因mRNA降解，抑制肺癌细胞的增殖、上皮间充质转化[14-15]。本次研究结果显示LEF可抑制miR-449a的表达水平，并且过表达miR-449a可抑制成纤维细胞的细胞活力、细胞增殖能力，抑制α-SMA和Col I蛋白的表达，并促进其凋亡。过表达miR-449a会逆转由LEF引起的细胞活化、增殖以及α-SMA和Col I蛋白的表达，而抑制miR-449a的水平会进一步加剧LEF的促纤维化作用。Zhang等[16]的研究结果也显示miR-449a具有调节α-SMA蛋白表达的作用。通过进一步的研究我们还发现LEF可促进JNK的磷酸化，过表达miR-449a会抑制JNK磷酸化水平并显著逆转LEF促进JNK磷酸化的作用。JNK的活化在促进肺癌发生和发展中的作用已经被广泛证实，此外，JNK可活化可能通过活化肝星状细胞引起肝纤维化[17]。Yang等[18]的研究结果显示阻断JNK途径可抑制成纤维细胞样滑膜细胞的活性，并抑制迁移和侵袭。Shingyochi等[19]的研究结果也显示了激活JNK通路会促进成纤维细胞的增殖和迁移。这提示LEF可能通过miR-499a促进JNK蛋白的磷酸化，从而促进肺成纤维细胞的活化和增殖，并促进细胞向肌纤维细胞转化和ECM的累积，进而引起肺纤维化。
综上所述，LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，促进α-SMA的表达和ECM的累积，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。但是，关于LEF调节miR-449a的机制和miR-449a在JNK途径中的作用仍需要进一步的研究。
Mechanism of leflunomide in regulating pulmonary fibrosis by regulating miR-449a
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摘要:
目的 探究来氟米特（leflunomide，LEF）通过调节微小RNA（microRNA，miR）-449a在肺纤维化中的机制研究。 方法 将人肺成纤维细胞MRC-5分为6组，即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。通过质粒转染miR-449a mimic或inhibitor来过表达或沉默miR-449a，在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。分别通过CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测各组细胞活力、细胞增殖能力和凋亡率。使用免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）胶质蛋白I（collagen I，col I）。分别使用qPCR和Western blot检测miRNA和蛋白的水平。 结果 mimic组miR-449a水平显著高于对照组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的miR-449a水平显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组，LEF+inhibitor组的miR-449a水平显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞活力和细胞增殖能力显著高于对照组（P<0.05）。mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的细胞凋亡率低于对照组（P<0.05），mimic组的细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的细胞凋亡率显著高于LEF组而LEF+inhibitor组的凋亡率显著低于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白的荧光强度显著高于对照组（P<0.05），mimic组的相对荧光强度低于对照组（P<0.05）。LEF+mimic组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著低于LEF组，LEF+inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著高于LEF组（P<0.05）。LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组（P<0.05），mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组（P<0.05），LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的p-JNK/JNK水平显著高于LEF组（P<0.05）。 结论 LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径，从而诱导成纤维细胞的活化和增殖，抑制其凋亡，从而引起肺纤维化。 -
关键词:
- 来氟米特 /
- 肺纤维化 /
- 成纤维细胞 /
- α平滑肌肌动蛋白 /
- 微小RNA-449a /
- c-Jun氨基末端激酶
Abstract:Objective To investigate the mechanism of leflunomide (LEF) in regulating pulmonary fibrosis by regulating microRNA (miR)-449a. Methods Human lung fibroblasts MRC-5 were divided into 6 groups: control group, LEF group, LEF+mimic group, mimic group, LEF+inhibitor group and inhibitor group. MiR-449a was overexpressed or silenced by plasmid transfection with miR-449a mimic or inhibitor and ncubate for 48 h at 5 mg / L LEF. The cell viability, cell proliferation ability and apoptotic rate of each group were measured by CCK-8 method, clone formation experiment and flow cytometry. Immunofluorescent staining was used to detect α smooth muscle actin (α-SMA) and collagen I (col I). The levels of miRNA and protein were detected using qPCR and Western blot, respectively. Results The miR-449a level in the mimic group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The level of miR-449a in LEF group and inhibitor group was significantly lower than that in control group (P<0.05). The expression level of miR-449a in LEF+mimic group was significantly higher than that in LEF group, and the level of miR-449a in LEF+inhibitor group was significantly lower than that in LEF group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF group and inhibitor group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the mimic group were significantly lower than those of the control group (P<0.05). The cell viability and cell proliferation ability of the LEF+mimic group were significantly lower than those of the LEF group, while the cell viability of the LEF+inhibitor group was significantly higher than that of the LEF group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF group and inhibitor group was lower than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of mimic group was significantly higher than that of control group (P<0.05). The apoptosis rate of LEF+mimic group was significantly higher than that of LEF group, while the apoptosis rate of LEF+inhibitor group was significantly lower than that of LEF group (P<0.05). The fluorescence intensity of α-SMA and Col I proteins in LEF group and inhibitor group were significantly higher than those in control group (P<0.05). The relative fluorescence intensity of mimic group was lower than that of control group (P<0.05). The relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I proteins in LEF+mimic group were significantly lower than those in LEF group, while the relative fluorescence intensities of α-SMA and Col I protein in LEF+inhibitor group were significantly higher than those in LEF group (P<0.05). The levels of p-JNK / JNK in LEF group and inhibitor group were higher than those in control group (P<0.05). The p-JNK / JNK level in the mimic group was significantly lower than that in the control group (P<0.05). The level of p-JNK / JNK in LEF+mimic group was significantly lower than that in LEF group, while the level of p-JNK / JNK in LEF+inhibitor group was significantly higher than that in LEF group (P<0.05). Conclusion LEF may activate the JNK pathway by inhibiting the expression of miR-449a in lung fibroblasts, thereby inducing fibroblast activation and proliferation, inhibiting apoptosis, and causing pulmonary fibrosis. -
Key words:
- leflunomide /
- pulmonary fibrosis /
- fibroblasts /
- alpha smooth muscle actin /
- microRNA-449a /
- c-Jun N-terminal kinase
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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表 1 各组miR-449a表达水平比较
组别 miR-449a 对照组 1.16±0.08 LEF组 0.58±0.05* LEF+mimic组 2.04±0.16# mimic组 6.32±0.63* LEF+inhibitor组 0.41±0.06# inhibitor组 0.77±0.07* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较 
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表 2 各组细胞的相对细胞活力比较（%）
组别 24 h 48 h 72 h 对照组 100.07±1.83 100.76±2.07 100.16±1.96 LEF组 103.67±2.06 110.83±2.15* 121.17±2.65* LEF+mimic组 99.98±2.14 98.57±2.11# 97.37±2.01# mimic组 97.54±1.97 91.79±2.35* 81.77±1.78* LEF+inhibitor组 107.68±2.08 118.67±3.07# 132.84±2.07# inhibitor组 104.31±1.79 111.38±2.67* 119.35±2.18* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 3 各组细胞增殖和凋亡情况比较
组别 克隆形成数目（个） 细胞凋亡率（%） 对照组 54.32±4.36 5.53±0.94 LEF组 87.66±7.24* 3.11±0.76* LEF+mimic组 60.82±6.06# 6.73±1.26# mimic组 31.12±3.78* 17.32±3.28* LEF+inhibitor组 119.35±5.08# 2.14±0.62# inhibitor组 92.71±7.89* 3.45±0.83* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 4 各组细胞α-SMA相对荧光强度比较
组别 α-SMA Col I 对照组 1.02±0.11 1.24±0.14 LEF组 2.36±0.47* 2.57±0.38* LEF+mimic组 1.53±0.34# 1.89±0.25# mimic组 0.47±0.05* 0.45±0.06* LEF+inhibitor组 3.25±0.18# 4.13±0.54# inhibitor组 2.48±0.15* 3.11±0.39* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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表 5 各组p-JNK/JNK相对水平比较
组别 p-JNK JNK p-JNK/JNK 对照组 2.04±0.18 2.16±0.16 0.94±0.09 LEF组 2.87±0.31 1.05±0.10 2.73±0.18* LEF+mimic组 1.67±0.19 2.24±0.21 0.75±0.07# mimic组 0.96±0.11 3.11±0.28 0.31±0.04* LEF+inhibitor组 3.04±0.24 1.10±0.10 2.76±0.25# inhibitor组 3.78±0.34 1.02±0.09 3.71±0.31* *P<0.05，与对照组比较；#P<0.05，与LEF组比较
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