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白血病是一类由造血干细胞恶性增殖引起的以出血、贫血、感染、不同程度的肝、脾、淋巴结肿大等为症状的造血系统恶性肿瘤[1]。目前，化疗是白血病治疗的重要手段，但复发率高、预后差、易产生耐药性等情况使得其对白血病的治疗效果大大折扣[2-3]。因此，寻找低毒、高效的治疗药物来提高疗效并降低复发率是治疗白血病的关键[4-5]。中医古籍中无白血病病名，但据其临床特点，应归属于“急劳”“热劳”“髓劳”“血证”“髓枯”“虚劳”等范畴[6]，由正虚邪实导致形成本虚标实之证。中药有可改善症状、减低化疗后毒副反应等特点，在白血病的治疗方面具有独特优势[7]。
定清片是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院（本院）血液科黄振翘教授、周永明教授在“扶正祛邪”理论指导下，经多年潜心研究，逐步改良而成的一种治疗白血病的有效制剂，由雄黄、黄芩、人工牛黄、栀子、陈皮、冰片等12味药组成[8]。方中诸药配伍，共奏益气养阴、清解邪毒之功，使标本得治、虚实共调。定清片在临床使用中取得了很好的疗效，在临床上定清片联合化疗治疗急性髓系白血病患者的西医疗效总有效率为80.0%，中医证候疗效总有效率为93.34%，缓解率66.7%，高于化疗治疗，还可显著改善患者临床症状，减轻化疗引起的常见毒副反应[9-10]。实验表明，定清片在体外能抑制人白血病HL-60细胞增殖，其作用机制可能与影响细胞周期和诱导细胞凋亡相关[11]，但其具体作用机制尚不明晰，需要进一步研究。
本研究利用网络药理学及分子对接技术，探讨定清片治疗白血病的活性成分和作用靶点，以期阐明其可能的作用机制，为定清片用于白血病的临床治疗提供理论依据。
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本研究通过检索TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以OB≥30%，DL≥0.18[12] 作为筛选条件选出定清片的有效成分及对应的靶点信息。对于TCMSP数据库没有的中药，通过HERB数据库（http://herb.ac.cn/）筛选成分，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载有效成分的2 D结构，并在SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中输入有效成分的2 D结构进行检索，以“Probability>0.1”为条件对靶点进行筛选。最后利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选到的靶点转换为对应的标准基因名。
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在OMIM（https://www.omim.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）数据库，以关键词“Leukemia”进行检索，获取白血病相关疾病靶点，在Venny2.1在线平台导入药物与疾病靶点，绘制药物-疾病共有靶点韦恩图，获得定清片治疗白血病的潜在靶点。
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将药物、活性成分、疾病靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病靶点” 网络图。
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将共有靶点导入 String 数据库（https://cn.string-db.org），种属选择“homo sapiens”，设置置信度为0.4，隐藏游离节点，其他参数保持默认设置，输出后将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络，应用MCODE插件，识别密集连接的网络特征，进一步筛选核心靶点群落。
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将物种设置为“homo sapiens”，利用DAVID数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）， 进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。富集结果以P<0.05为标准进行筛选，通过微生信在线软件（http://www.Bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化处理。
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用RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点的蛋白结构，借助Pymol软件去除蛋白的水分子和小分子配体。通过Pubchem数据库获取成分的3 D结构，运用OpenBabel-3.1.1软件将小分子结构转换为mol 2格式。再通过AutoDock vina软件对小分子配体和蛋白受体进行预处理并进行分子对接，得到靶点蛋白和化合物对接的最低结合能，运用Pymol软件将对接结果进行可视化。
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定清片由12味药组成，通过数据库搜集共获得82个活性成分及439个作用靶点。通过疾病数据库得到白血病相关靶点1 878个，将疾病靶点与活性成分靶点进行交集，绘制韦恩图（图1），得到169个共有靶点。将这169个共有靶点导入Cytoscape中，删除与靶点无交集的孤立成分后绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图（图2），共获得249个节点、712条边。根据网络的拓扑分析，筛选出度值较大的活性成分有槲皮素（97）、桑黄素（78）、山柰酚（75）、木犀草素（61）、川陈皮素（33）、汉黄芩素（20）和柚皮素（17）等，这些度值较大的化合物可能是定清片治疗白血病的潜在活性成分。
图 1 药物-疾病靶点韦恩图
图 2 定清片治疗白血病的药物-成分-靶点网络
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将169个共有靶点导入STRING数据库，将得到的文件导入Cytoscape软件进行可视化处理（图3A），获得PPI网络图。通过分析可知网路中共有162个节点（靶点蛋白）、1 817条边（蛋白相互作用），颜色由深变浅代表度值由大变小。按照度值大小排名靠前的靶点有TP53、AKT1、CASP3、STAT3、TNF、MYC、EGFR、JUN、BCL2等，选取度值最高的靶点绘制核心靶点PPI网络图（图3B），这些可能是定清片治疗白血病的关键靶点。
图 3 定清片治疗白血病共有靶点的PPI网络与核心靶点网络
为进一步探究靶点间的集落关系，对PPI网络开展MCODE子簇分析，得到评分最高的4个基因簇（图4）。其中基因簇1包含31个靶点，2含27个，3含7个，4含8个。评分最高的基因簇1中包含了31个关键靶点，有FOS、IL-2、EGFR、TP53、ICAM1、MAPK3、MAPK14、IFNG、TGFB1、MYC、NFKBIA、HIF1A、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、IL-10、AKT1、IL-6、IL-1B、MMP9、CCL2、JUN、CXCL10、PTGS2、IL-4、VCAM1、STAT3、IL-1A、CASP3、CXCL8。
图 4 富集分子复合物检测（MCODE）分析中排名前4位的基因簇
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为聚焦核心靶点的相互作用，对基因簇1中的31个关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析，最终得到GO富集条目431条。其中，生物过程（BP）368条，细胞组成（CC）19条，分子功能（MF）44条。通过GO富集分析发现，BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、细胞凋亡过程的负调控等；CC主要包括细胞外间隙、转录因子复合物、大分子复合物等；MF主要包括酶的结合、细胞因子活性、相同蛋白质结合等（图5）。KEGG信号通路有138个条目，相关通路主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和癌症信号通路等（图6）。
图 5 定清片作用靶点的GO富集分析
图 6 定清片作用靶点的KEGG通路富集分析
为进一步探究其作用机制，以KEGG分析获得的TNF、IL-17信号通路为重点研究对象，探讨药物、活性成分、核心靶点的关系。通过分析发现，信号通路中包含的核心靶点有7个，分别为AKT1、CASP3、MMP9、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。这7个核心靶点与定清片中相关活性成分对应，构建活性成分-关键靶点-通路网络（图7），包括36个节点和75条边。核心靶点对应得到的13个活性成分为:槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、刺槐素、β-谷甾醇、汉黄芩素、吴茱萸次碱、川陈皮素、桑黄素、睾酮、黄芩素、芒柄花素等。这些成分存在于黄连、太子参、黄芩、黄柏等8味药材中，通过调控核心靶点参与了TNF与IL-17信号通路的调节，可能在定清片治疗白血病的过程中发挥重要作用。
图 7 子网络A的药物-成分-靶点-通路图
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采用分子对接技术，选择药物-疾病共有靶点和基因簇1的“药物-成分-靶点-通路”网络图中节点度值最高的核心靶点蛋白，包括TP53、AKT1以及MMP9、CASP3和TNF，与排名靠前的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素和柚皮素（图8）进行分子对接分析。化合物与靶点的结合能越低，表明其可能有更好的相互作用。从表1的结合能结果可知，定清片中的活性成分与核心靶点蛋白有一定的相互作用，例如槲皮素，与多个靶点的结合能均小于−20.93 kJ/mol，被认为可能有较好的结合性，其中与AKT1的结合能最低（−41.03 kJ/mol），表明其与AKT1的结合能力最强，槲皮素可能与蛋白上的TYR-272、ASN54、GLN79、THR211残基通过氢键等相互作用（图9），其他活性成分均与对应的大分子蛋白上的关键残基存在相互作用，对接可视化结果见图9。这些结果提示，定清片中的多种化合物成分与白血病的相关核心靶点有良好的亲和性。
图 8 定清片主要活性成分的化学结构式
表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
图 9 分子对接示意图
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定清片是本院黄振翘教授和周永明教授通过多年临床实践拟定的经验方，对白血病的疗效得到了普遍认可。其由12味中药组成，每味药物中又有许多不同的化合物。且其对白血病治疗的作用机制尚未阐明。
白血病的发病机制涉及多种因素，不同的药物治疗针对不同的通路和机制发挥作用[13]。本研究通过网络药理学分析，筛选出可能在定清片防治白血病的作用机制中具有重要作用的5个核心靶点。其中，肿瘤抑制基因TP53是人类癌症中最常见的突变基因之一，也是包括血液系统恶性肿瘤在内的许多恶性肿瘤研究的重要预后指标。其编码产生的p53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡和衰老等重要的生物学功能息息相关，通过抑制细胞的生长，预防癌症的发展[14-15]。在分子对接实验中，刺槐素与p53蛋白有较好的亲和性。已有研究表明，刺槐素能通过结合RARγ，靶向调控AKT-p53信号通路，诱导癌细胞凋亡[16]；但其是否能直接作用于p53从而调控下游生物学功能尚需实验证实。丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）在细胞存活、细胞周期、侵袭和代谢的调节中发挥作用。研究表明，包括白血病在内的多种癌症都伴有AKT信号的失调，在急性白血病中经常发现AKT的持续激活和磷酸化水平的显著升高。AKT1与PI3K、PTEN和mTOR等构成的重要信号通路对维持细胞存活和凋亡之间的平衡具有重要作用[17]，且AKT1会影响来自胸腺的调节性T细胞的增殖能力[18]。研究发现，定清片中的槲皮素与多个核心靶点均有较好的亲和力，其与AKT的相互作用可能最强。已有多项研究表明，槲皮素可用于白血病的治疗，是一种有应用前景的抗肿瘤药物。槲皮素可通过调节CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路诱导HL-60细胞凋亡和自噬[19]，还能克服癌细胞的耐药性[20]。但槲皮素治疗白血病是否与AKT通路有关，有待进一步研究。在药物-靶点网络中显示与白血病靶点密切相关的化合物，如木犀草素、山柰酚和柚皮素等，都可能是定清片治疗白血病的关键化合物。
聚类分析结果显示，定清片治疗白血病的作用机制可能与TNF信号通路和IL-17信号通路有关。TNF参与白血病发生发展的所有过程，包括细胞转化、增殖、血管生成和髓外浸润等，并且在急性髓性白血病患者外周血中，调节性T细胞的增殖依赖于TNF受体通路[21]。而对慢性淋巴细胞白血病（CLL）、免疫功能紊乱和肿瘤细胞生存期延长是病情进展的重要诱因之一。在CLL早期，存在机体Th细胞免疫系统失衡，其中Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞聚集，促进慢性炎症的发生，致使IL-17水平升高，最终导致CLL进展，预后欠佳[22]。IL-17诱导炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）和趋化因子（CXCL1、CXCL2）的持续产生，从而促进急性髓性白血病（AML）的发生发展[23]。在B细胞急性淋巴细胞白血病中，Th17细胞分泌的IL-17A水平明显升高，其通过激活Akt 信号通路显著促进细胞的增殖，提高柔红霉素的耐药性[24]。这些研究均表明，TNF信号通路和IL-17信号通路在白血病的发生发展中有重要作用，药物对这些通路发挥调控作用可能是其治疗白血病和改善耐药性的作用机制。
综上所述，本研究基于网络药理学方法，对定清片中的12味药材进行有效成分和作用靶点的筛选，构建了药物成分-疾病-靶点网络图，并通过对关键子网络核心靶点的富集分析，探索其治疗白血病的主要通路。定清片中的主要有效成分如山柰酚、槲皮素、木犀草素、柚皮素、刺槐素等，可能通过与核心靶点TP53、AKT1、MMP9、CASP3和TNF等的相互作用，调控TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。本研究围绕中药复方多种药物成分、多靶点的基本分析策略，验证了“定清片”的有效性和科学性，为其在临床的推广应用提供了一定的理论依据。
Mechanism of effective ingredients of Dingqing tablets in the treatment of leukemia based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 探讨定清片治疗白血病的药理作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、本草组鉴平台（HERB），收集定清片的活性成分；利用SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点。利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取疾病靶点，将药物与疾病的共有靶点导入String网站，构建共有靶点蛋白相互作用（PPI）网络，并利用MCODE插件筛选核心子网络。利用DAVID数据库中对评分最高的基因簇1基因进行GO和KEGG富集分析，构建“成分-靶点-通路”网络；利用AutoDock对定清片的活性成分和核心靶点进行分子对接，并对其结果进行可视化分析。 结果 数据库检索共获得定清片活性成分82个及其作用靶点439个，白血病相关靶点1 878个，活性成分和疾病的共有靶点169个。由度值推测定清片中发挥作用的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，而PPI核心网络表明其治疗白血病的关键靶点主要包括TP53、MMP9、TNF、AKT1、CASP3等；子网络的基因富集分析及“成分-靶点-通路”网络图显示定清片可能通过调节TNF、IL-17等信号通路来发挥对白血病的治疗作用。分子对接结果显示活性成分与靶点间有较强的结合活性。 结论 定清片的活性成分可能通过调控TP53、AKT1和CASP3等基因参与TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Dingqing tablets in the treatment of leukemia. Methods The potential active ingredients of Dingqing tablets were retrieved through TCMSP and HERB Database and the targets of herbs were screened by Swiss TargetPrediction databases. The treatment targets of leukemia were searched from the GeneCards, OMIM and Disgenet databases. The protein-protein interaction network was used to construct the interactive target regulation function of Dingqing tablets and leukemia by STRING software, and the core subnetworks were filtered by the MCODE plug-in. A component-target pathway network was constructed by GO and KEGG enrichment analysis of the highest scoring Gene cluster 1 gene in the DAVID database. Molecular docking of the active components and core targets of Dingqing tablets was performed by AutoDock and the results were visualized. Results A total of 82 active ingredients and 439 targets of action of Dingqing tablets, and 1 878 leukemia-related targets were obtained through database retrieval, in which 169 common targets of active ingredients and diseases were mapped. Based on the degree values, the main active ingredients were determined as quercetin, luteolin, kaempferol, etc. The PPI core network indicated that the key targets for treating leukemia included TP53, MMP9, TNF, AKT1, CASP3, etc. The gene enrichment analysis of sub-networks and the component-target pathway network diagram showed that Dingqing tablets might exert therapeutic effects on leukemia by regulating signaling pathways such as TNF and IL-17. The molecular docking results showed fairly strong binding activity between the active ingredients and the targets. Conclusion The active ingredients of Dingqing tablets may participate in TNF, IL-17, and other signaling pathways by regulating genes such as TP53, AKT1, and CASP3, thereby exerting therapeutic effects on leukemia. -
Key words:
- Dingqing tablets /
- leukemia /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- mechanism
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药品非无菌产品微生物限度检查中微生物计数法（后简称计数法）是药品检验的重要组成部分，是对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数[1]。计数法检验流程概括为：取供试品根据其理化和生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。倍比稀释，选取1～3个合适的稀释级（根据样品特性和污染情况）用平皿法、薄膜过滤法或MPN法做供试品检查。供试样品的制备过程中使样品充分溶解或分散，并有效降低或消除药品本身的抑菌性在检验过程中尤为重要，是得到准确的微生物计数检验结论的关键点。过去的研究主要集中在对计数法检验有影响的菌株选择和保存、培养基质量控制、操作环境控制及被检样品方法适用性研究，而对药品的前处理（即供试液的制备方法）尤其是中成药的前处理法研究甚少。据佘凡等报道[2-7]，影响微生物限度检验误差因素分析中因前处理所产生误差在各因素中占比重较高。李超美等[8]曾组织同省9个药检所对同厂家、同批号中成药“香莲丸”做微生物限度验证，发现验证方法并不完全相同，以致验证结果不同，影响实验结果一致性评价。分析其主要原因是选择了不同的前处理方法，样品经前处理后是否完全溶解或分散，供试液中颗粒大小和沉降速度，取供试液时是振摇混匀还是取上清液、样品抑菌性是否被中和等因素直接影响微生物的回收率，致使各实验室有的采用常规法，有的采用培养基稀释法，有的采用薄膜过滤法才能使回收率达到药典规定的要求。
鉴于中成药微生物限度计数法前处理工作对提高中成药的检验质量影响较大，本文就中成药前处理关键影响因素和优化方法进行了系统的分析和综述。
1. 影响计数法前处理的因素分析
1.1 中成药溶解性分类
《中国药典》2020版与欧美药典[1,9,10]在样品供试液制备时（前处理）都根据药品的理化特性和生物学特性将药品分类。一般口服制剂除肠溶、结肠溶和膜剂供试品外基本分为三类：水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。中成药配方复杂，成分多样，制法较西药特殊。如片剂中牛黄解毒片是由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草8味药组成，制法是：以上八味，雄黄水飞成极细粉；大黄粉碎成细粉；人工牛黄、冰片研细；其余黄芩等四味加水煎煮二次，合并滤液浓缩成稠膏或干燥成干浸膏，加入大黄、雄黄粉末，制粒，干燥，再加入人工牛黄、冰片粉末，混匀，压制成片[11]。丸剂中防风通圣丸由防风、大黄、芒硝、栀子、滑石、白术、白芍、当归等17味中药组方。制法是以上十七味，滑石粉碎成极细粉；其余防风等十六味粉碎成细粉，过筛，混匀，用水制丸，干燥，用滑石粉包衣， 打光，干燥，即得。或以上十七味，粉碎成细粉，过筛，混匀，用水制丸，干燥，即得[11]。从以上两个中成药的配方、制法可以看出中成药是药材提取物与原粉的混合，雄黄、石膏是矿物质，冰片是植物提取物结晶，都不溶于水，其他生药原粉也不能完全溶于水。所以较难将其简单分成水溶性、不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。这是影响各实验室选择前处理方法制备样品最直接的因素。
1.2 缓冲液pH值
《中国药典》2020版和欧洲药典的缓冲液pH值范围基本相同[1,10]，为pH7.0、pH7.2、pH6.8、pH7.6，供试液制备时如需要，应调节pH值至6~8。中成药组方成分和制造工艺多样，决定产品的pH值范围较广，所需缓冲能力较大，缓冲范围涵盖pH值6~8的缓冲液。如麻仁丸配方为火麻仁、枳实（炒）、苦杏仁、大黄、炒白芍、姜厚朴。其制法为以上六味，除火麻仁、苦杏仁外，其余大黄等粉碎成细粉，再与火麻仁、苦杏仁掺研成细粉，过筛，混匀。粉末用炼蜜加适量的水制丸，干燥，制成水蜜丸；或加炼蜜制成小蜜丸或大蜜丸，即得[11]。这一制作过程没有对成品的酸碱度有特殊要求。又如一清胶囊的处方为黄连、大黄、黄芩。其制法是以上三味，分别加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩，喷雾干燥，制得黄芩浸膏粉及大黄和黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒，干燥，粉碎，加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量，混匀，装入胶囊，制粒，即得。整个过程没有测定酸碱度[11]。再如乙肝益气解郁颗粒配方为柴胡（醋炙）、白芍、枳壳、橘叶、黄芪、丹参、党参、茯苓、桂枝、瓜蒌、刺五加、黄连、法半夏、山楂、决明子、五味子。其制法是以上16味，白芍、茯苓、法半夏分别粉碎，过筛，依次取细粉混匀，备用；剩余的粗粉备用。五味子粉碎后用80％乙醇回流提取两次，合并提取液，回收乙醇，备用。其余柴胡（醋炙）等12味及白芍等三味的粗粉加水煎煮两次，合并煎液，静置 12小时，取上清液，与上述五味子提取液合并，浓缩，加入上述细粉及适量糖粉混匀，制成颗粒[11]。从以上丸剂、胶囊剂、颗粒剂的举例中可以看出中成药的pH范围会比较宽泛，将被检样品的前处理液加入胰酪大豆胨琼脂做菌落总数的培养，或许会改变培养基的酸碱度进而影响菌落的生长繁殖，从而影响菌落计数结果的准确性。根据细菌适应酸碱度不同可将微生物分成：中性微生物、嗜酸性微生物、耐酸性生物、嗜碱性微生物、耐碱性微生物等。培养基酸碱环境的改变，必然影响微生物的生长繁殖。另有研究表明，药品的分散度也会影响供试液的pH值，进而影响微生物的生长造成实验结果的差异[12]。
1.3 非离子表面活性剂的添加浓度
增加被检样品的分散度和溶解度有利于样品中的微生物更均匀的分布于处理液中。取样均匀性的提升有助于提高微生物的检出率。吐温80为非离子型表面活性剂，亲水性强，是优良的O/W型乳化剂，对植物油、矿物油、动物油脂等均有良好的乳化作用。根据《中国药典》2020版四部通则1105，供试液前处理添加吐温80浓度为0.1%，如水不溶性非油脂类分散力较差的供试品，可在稀释液中加入无菌0.1%的聚山梨酯80。油脂类供试品可加入无菌十四烷酸异丙酯，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀[1]。表面活性剂浓度过高会使细菌细胞膜中的脂类溶解而造成菌体死亡[13-16]。因此合适浓度的表面活性剂的使用尤为重要。王康[17]等增加吐温 80比例制备中药提取物穿心莲内酯固体分散体发现其能有效地提高穿心莲内酯的溶出速率。高飞[18]等在化妆品检测使用含1 g/L卵磷脂和7 g/L的吐温80生理盐水做缓冲液，可中和化妆品中防腐剂对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。张华光[19]等在缓冲液中添加3%吐温80和0.3%卵磷脂中和抑菌性较强的药品。中成药原料来源广泛，有动植物矿物等，所以表面活性剂对于中成药在计数法前处理中的最适用量仍有待研究。
1.4 中和剂或灭活方法
中成药种类多且成分复杂，难以归入药典列出的干扰物种类中。许多中成药对临床耐药细菌具有较好的抑制作用，临床上也常用抗菌中成药和抗生素联合应用以降低细菌的耐药性。深入研究中药抑菌作用和机制，大致可分为直接和间接抑制作用。直接抑制作用包括消除或逆转细菌耐药质粒、抑制细菌β-内酰胺酶活性和外排泵、改变细胞膜的通透性与消除生物膜等。间接抑制作用主要是：中药通过提高机体免疫力对抗耐药性细菌。据研究[20-22]，许多中药有抑菌作用，如黄芩、黄连、连翘、五倍子、五味子、乌梅、金银花等57种，中成药包括黄连上清片、穿心莲内酯胶丸、妇必舒胶囊等。有些中药的抗菌作用机制不是单一的，而是能够在多个方面发挥作用，所以药典常见中和剂或灭活方法（详见表1）是否能满足、何种浓度能满足有抑菌成分中成药的计数法检验要求尚待研究。
表 1 《中国药典》2020版常见的中和剂或灭活方法[1]干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛、汞制剂 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、醛类、吸附物 稀释法 醛类 甘氨酸 季铵化合物、对羟基苯甲酸、
双胍类化合物卵磷脂 季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸 聚山梨酯 水银 巯基醋酸盐 水银、汞化物、醛类 硫代硫酸盐 EDTA、唆喏酮类抗生素 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺酶 2. 优化中成药前处理的方法
陶明[23-24]等发现影响抑菌干混悬剂微生物限度方法适用性的因素主要是样品原料的分散性和中和剂的有效单位。对药品进行微生物限度计数法前处理的目的是：在生物样本安全的前提下通过前处理使被检样品成为均匀的溶液或悬浊液，以保证取样的均匀性。这样吸取供试液时，既可保证液体分散均匀，又可避免只吸取上清液或沉淀物，还可防止被检样品溶散不均造成制备液pH不同而形成结果偏离[4,7,25]。优化中成药前处理的方法有利于最终选取合适的检验方法（常规、稀释、中和、薄膜过滤法）消除样品的抑菌性，取得科学、准确的实验结果。
2.1 减小被检样品的粒度
中成药大致分为口服和外用两种使用方式，口服剂型大多为片剂、胶囊、丸剂等。无论中成药成分多复杂，减小被检样品的粒度从而增加样品的溶解度和分散度都是较佳选择。最直接减小被检样品的粒度方法就是提高匀浆效率。《中国药典》2020版对前处理匀浆的转速没有特别规定，而《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB4789.2-2020）中规定检测样品的匀浆转数常规为8 000～10 000 r/min，持续1～2 min[26-27]。有研究[28]分别用匀浆仪和研磨法对9种丸剂和3种片剂进行前处理，从各组实验所得的细菌数平均值来看，匀浆法测定的细菌数大于研磨法，并呈显著性差异，如槐角丸、益肝丸、通窍鼻炎片在研磨时菌落数为4.0×102、2.7×103、2.9×102CFU/g，经均质器细匀后菌落数为8.7×102、3.4×104、6.4×102CFU/g，说明样品均质的细腻均匀可提高细菌检出率。庞云娟等[29]报道，供试液制备过程中被检样品分散度和溶解度不足是造成实验结果偏离的原因之一。以上研究表明适当提高匀浆效率可增加样品的分散度和溶解度，进而提高细菌检出率以达到提升检验准确度的目的。均质器转速和时间可参考食品菌落总数检测标准。
2.2 选择pH7.2的磷酸盐缓冲溶液体系
磷酸盐缓冲溶液可以通过H2PO4−和HPO42-在不同的pH下形成缓冲体系。当H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶1时，此时溶液的pH值为6.86，也被称为磷酸盐缓冲液的电中性点。在电中性点的pH值下，磷酸盐缓冲溶液的缓冲能力最弱。随着pH值的升高，H2PO4−的浓度逐渐降低，溶液的缓冲能力逐渐增强。当pH升到7.21时，H2PO4−和HPO42-的浓度比为1∶2，此时溶液的缓冲能力最强，称为磷酸盐缓冲溶液的最大缓冲范围。随着pH值的继续上升，HPO42-的浓度逐渐升高，H2PO4−的浓度逐渐降低，溶液的缓冲能力逐渐减弱。磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围在pH值5.8~8.0之间，这个范围是根据H2PO4−和HPO42-的浓度比和pH值的关系所确定的，并且在pH值7.21左右具有最大的缓冲能力[30]，所以pH7.2的磷酸盐缓冲溶液最适合中成药的前处理。
2.3 选取合适的表面活性剂浓度
许多中成药含抑菌成分，通过添加表面活性剂吐温80，可提高非水溶性成份在稀释剂中溶解度和分散度。研究[31,32]表明，添加表面活性剂效果优于调节pH值，因当药品含有抑菌性成分时，降低pH值会增加药品的抑菌性。为方便分析中成药的抑菌性，我们将中成药分为以下几类：①清热解毒类中成药常含有板蓝根、黄芩、金银花等有较强抑菌能力；②止咳平喘类的中成药若含有麻黄、川贝母、薄荷脑等成分的药物的抑菌性也比较强；③胃肠道类中成药如含有广藿香、紫苏叶等成分的药物也有较强的抑菌作用；④抗感冒类药大多含有较高金银花、甘草、柴胡等中药抑菌性较强；⑤妇科内服类中成药比外用药抑菌性弱；⑥镇痛抗炎抗风外用中成药如含有黄柏对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有抑制作用[33]。欧洲药典11.0对有抑菌作用药品选用的缓冲液其中含3%聚山梨脂80和0.3%蛋黄卵磷脂[10]，既能增加被测样品的分散度和溶解度，又能中和药品本身的抑菌成分同时又可增加样品中细菌的检出率。[19]
2.4 选取合适的稀释液
既满足方法适应性菌株的回收率要求又提高样品溶解度和悬浊液的稳定性，是优化前处理过程的关键。稀释液在前处理的过程中起着重要的作用，一方面需要最大程度提供各类菌株的生存条件，另一方面要易于药品的溶解和分散。《中国药典》2015年版药品微生物限度检查方法实例中保济丸在微生物限度计数检验选用了两种稀释液，先用胰酪大豆液体培养基将被检样品制成1∶100的供试液，再取上清液薄膜过滤，并用含0.1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜[34]。前者可提高菌株回收率，后者可增加溶解和分散。另外有研究[35]表明，参考《中国药典》使用标准菌株进行化妆品微生物指标检验的供试液制备，研究不同的前处理方法的适用性结果显示：使用含中和剂的大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80（SCDLP）液体培养基、改良卵磷脂肉汤、戴伊恩格利中和肉汤（D/E中和肉汤）制备供试液，加菌计数回收试验结果及控制菌（耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）阳性检出率，均优于按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）用生理盐水制备供试液，其中采用 D/E 中和肉汤进行样品制备，对样品中防腐剂的中和效果最好。
3. 小结与展望
《中国药典》2020年版要求生产厂家进行一厂、一品、一规的微生物限度标准制订和验证实验，验证报告要完整、可靠。作为药品检验机构由于检验周期所限，实际抽检工作中不可能像生产厂家去一一验证。因此，分析研究中成药这一大类非无菌药品计数法检验的特点，优化检验过程，特别是样品前处理是检验中成药的重要环节。中成药成分多为动植物和矿物，使计数法前处理时难以简单用溶解度分类，往往同一种药品各实验室选择不同检验方法，导致检验结果差异加大。且中药炮制工艺多样使中成药的酸碱度范围宽泛，如果药品前处理时稀释液的缓冲能力不强，会影响后续培养基的酸碱度，进而影响检验结果的准确性。有些中成药本身具有抑菌性，若不中和或去除会造成假阴性结果。
以上因素直接影响中成药计数法的检出率和准确度，寻找一种分散度和溶解度好，缓冲力强且能中和药品抑菌性，又对受损细菌有修复力的缓冲液显得尤为迫切。本文从影响中成药计数法检验因素入手，层层分析寻找解决方案。综合中国药典和美国药典以及相关文献内容归纳出解决的途径：首先在稀释液中加入适宜的非离子表面活性剂吐温80和卵磷脂（3%吐温80和0.3%卵磷脂）等中和剂，可以起到增加药品分散度和溶解度并中和部分抑菌性的作用；其次通过增加适宜浓度的磷酸盐缓冲离子对（Na2HPO4和KH2PO4），使缓冲液达到最大缓冲能力，用以降低中成药因偏酸或偏碱对培养基的影响；再则增加缓冲液中生长因子和维生素以利于受损细菌的快速恢复。最后选择合适的匀浆速度和时间，在适宜剪切力的作用下使缓冲液和被检样品充分混和均匀。
随着课题研究进一步深入，最终可创新出一款可加强分散度和溶解度、提高取样均匀性、降低中成药抑菌性、加强缓冲能力、加强短时间修复受损细菌能力的改良缓冲液。以提高中成药计数法检验结果的准确性、重复性及工作效率，解决中成药计数法检验中遇到的诸多问题。为监测中成药计数法这类非无菌制剂的安全性和有效性提供现实的应用价值。
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表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
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