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对萼猕猴桃Actinidia valvata Dunn是猕猴桃科猕猴桃属中型落叶藤本植物，分布于安徽、浙江、江西等地[1]。其根和根茎作猫人参入药，具有清热解毒、消肿的功效[2]，临床常用于治疗肺癌、肝癌及消化道肿瘤[3]。随着猫人参药材的需求量不断增加，在生产过程中，有大量的枝叶未得到有效利用，造成了自然资源的浪费。从中药资源开发利用的角度出发，课题组前期首次对非传统药用部位对萼猕猴桃叶进行了大量研究，发现对萼猕猴桃叶中含有较多的黄酮类成分，具有较强的抗心肌缺血作用和抗氧化活性[4-7]。其中对萼猕猴桃苷E是课题组首次从对萼猕猴桃叶中发现的新黄酮苷类化合物，在叶中含量高，药理活性显著，具有很好的开发前景。作为一个新化合物，如何得到高纯度的对萼猕猴桃苷E并对其进行开发利用，成为一项亟待解决的问题。因此，本文以对萼猕猴桃苷E为研究对象，对其提取分离纯化工艺进行优化，以此获得高纯度的对萼猕猴桃苷E，为后续对萼猕猴桃苷E的药代动力学研究及药理活性研究奠定物质基础。
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Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；2500Y多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；BT25S十万分之一电子天平（德国塞利多斯公司）；SYG-A2-6电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；IS-RDV1恒温振荡器（苏州捷美电子有限公司）。
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对萼猕猴桃苷E（纯度≥98%，自制）；无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇为分析纯试剂（上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技股份有限公司）、乙腈（德国Merck公司）、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）为色谱纯试剂；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；D101型、AB-8型、DM130型、HPD100型、NKA-9型大孔吸附树脂（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；柱层析硅胶（100~200目、200~300目，青岛海洋化工有限公司）；ODS填料（日本YMC公司）。
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对萼猕猴桃叶样品为2008年5月采自浙江省衢州市常山县，经海军军医大学辛海量教授鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物对萼猕猴桃Actinidia valvata Dunn的叶。样品于60 ℃烘箱烘干，粉碎过三号筛，得对萼猕猴桃叶粉末，置干燥器中密封保存。
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色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱：0~35 min, 10%~40% B）；流速：1 ml/min；柱温：26 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 µl。对照品及样品色谱图见图1。
图 1 对萼猕猴桃苷E对照品（A）和对萼猕猴桃叶提取液（B）HPLC图
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精密称取对萼猕猴桃苷E对照品15.77 mg，置于10 ml容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.577 mg/ml的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，过0.45 µm微孔滤膜，备用。
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精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，置于250 ml圆底烧瓶中，加入55%乙醇50 ml，95 ℃回流提取1 h，过滤后滤液定容至50 ml，摇匀，经0.45 µm微孔滤膜过滤，备用。
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（1）线性关系考察
精密吸取对萼猕猴桃苷E对照品溶液0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、5.0 ml，分别置于5 ml容量瓶中，色谱纯甲醇溶解定容，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以对萼猕猴桃苷E浓度（mg/ml）为横坐标（c），其峰面积（mAU*s）为纵坐标（A），绘制标准曲线。回归方程为A =
11127 c+31.985，R2=0.9998 ，表明对萼猕猴桃苷E在0.047~1.577 mg/ml范围内与其峰面积线性关系良好。（2）精密度试验
精密吸取同一浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液连续进样6次，记录其峰面积，相对标准偏差（RSD）为1.29%，表明仪器精密度良好。
（3）稳定性试验
精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，分别于室温0、4、8、12、16、24 h进样测定，记录峰面积，RSD为0.21%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。
（4）重复性试验
称取对萼猕猴桃叶粉末6份，每份2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样测定并记录峰面积，RSD为1.07%，表明该方法重复性良好。
（5）加样回收率试验
精密称取已知对萼猕猴桃苷E含量的对萼猕猴桃叶粉末9份，每份1 g，分别加入相当于本底量80%、100%、120%的已知浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样分析并计算加样回收率。对萼猕猴桃苷E的平均加样回收率为101.16%，RSD为1.95%，表明该方法准确可靠。
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以对萼猕猴桃苷E的含量为指标，单因素考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对对萼猕猴桃苷E含量的影响，并通过四因素三水平L9（34）正交试验优选对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺。
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（1）乙醇浓度考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1∶10分别加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至50 ml，测定对萼猕猴桃苷E含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的含量随乙醇浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，当乙醇浓度为65%时对萼猕猴桃苷E含量最大（图2A）。
图 2 单因素对对萼猕猴桃苷E含量的影响
（2）料液比考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入65%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至相应体积。结果表明，料液比过大时，对萼猕猴桃苷E含量下降，其在料液比为1:25时含量最大（图2B）。
（3）提取时间考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，90 ℃回流提取1次，提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量在提取时间为1 h时最大（图2C）。
（4）提取温度考察
精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，分别于50、60、70、80、90、100 ℃回流提取1 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量随着提取温度的升高而不断增加，温度升高到90 ℃时，对萼猕猴桃苷E含量骤然提升，当提取温度为100 ℃时其含量最大（图2D）。
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根据单因素实验考察结果，确定影响对萼猕猴桃苷E提取率的因素为乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）4个因素，每个因素选取3个水平，设计L9（34）正交表进行正交试验，优化对萼猕猴桃苷E的提取工艺。重复试验正交结果及直观分析见表1，方差分析见表2，结果表明，影响对萼猕猴桃苷E含量的主次因素为提取温度>乙醇浓度>料液比>提取时间，其中提取温度和乙醇浓度有显著性差异（P < 0.05）。综合考虑，确定对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺为A1B2C2D2，即以对萼猕猴桃叶粉末25倍量的55%乙醇，95 ℃回流提取1 h。
表 1 L9（34）正交试验结果及直观分析（n = 3）
编号 A（%） B（w/V） C（t/h） D（T/ ℃） 对萼猕猴桃苷E含量（mg/g） 1 2 3 1 55（1） 1∶20（1） 0.5（1） 90（1） 7.94 7.98 7.87 2 55（1） 1∶25（2） 1（2） 95（2） 7.99 7.98 8.09 3 55（1） 1∶30（3） 1.5（3） 100（3） 7.89 7.85 7.98 4 65（2） 1∶20（1） 1（2） 100（3） 7.87 7.81 7.77 5 65（2） 1∶25（2） 1.5（3） 90（1） 7.85 7.99 7.97 6 65（2） 1∶30（3） 0.5（1） 95（2） 7.91 7.93 8.05 7 75（3） 1∶20（1） 1.5（3） 95（2） 7.91 7.91 7.81 8 75（3） 1∶25（2） 0.5（1） 100（3） 7.84 7.75 7.81 9 75（3） 1∶30（3） 1（2） 90（1） 7.88 7.97 7.87 K1 71.57 70.87 71.08 71.32 K2 71.15 71.27 71.23 71.58 K3 70.75 71.33 71.16 70.57 k1 7.95 7.87 7.90 7.92 k2 7.91 7.92 7.91 7.95 k3 7.86 7.93 7.91 7.84 R 0.09（2） 0.05（3） 0.02（4） 0.11（1） 表 2 对萼猕猴桃叶提取工艺方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 A 0.037 2 0.019 4.989 0.019* B 0.014 2 0.007 1.856 0.185 C 0.001 2 0.001 0.167 0.847 D 0.061 2 0.031 8.161 0.003** 误差 0.067 18 0.004 合计 0.181 26 注：f1=2，f2=18，F0.05（2, 18）=3.55；*P<0.05，**P<0.01. -
根据优选出的提取方法制备3份对萼猕猴桃叶提取液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，所测对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取率为99.32%，得率为0.80%，RSD均小于1%，表明所选工艺稳定，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取。
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（1）大孔树脂预处理
取5种型号的大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、NKA-9适量，置于250 ml锥形瓶内，倒入高于树脂层3 cm的95%乙醇，置摇床振摇12 h，继续用95%乙醇洗涤，直至洗涤液不浑浊。然后加入蒸馏水至摇床振摇清洗，直至无醇味。
（2）大孔树脂型号的筛选
精密称取已处理的上述树脂各0.5 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，分别加入最佳提取工艺制备的对萼猕猴桃叶浓缩提取液10 ml，盖紧瓶塞，置于恒温振荡器中振摇12 h（150 r/min），达到饱和吸附后过滤，收集未吸附溶液，测定未吸附液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的吸附率。将上述静态吸附过的树脂用吸水纸吸干溶液，各用10 ml 75%乙醇溶液解吸附，相同条件下振摇，收集解吸附液，测定溶液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的解吸附率。结果见表3，综合吸附和解吸附性能考虑，最终根据权重大小选择D101型大孔树脂进行后续实验。
表 3 不同型号大孔树脂对对萼猕猴桃苷E静态吸附和解吸附的测定结果
树脂型号 吸附率（%） 解吸率（%） 权重（%） D101 91.54 96.67 88.49 AB-8 88.71 98.01 86.94 DM130 62.10 89.80 55.76 HPD100 87.82 97.25 85.41 NKA-9 87.15 97.64 85.09 （3）上样液浓度考察
称取5份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，分别加入浓度为0.07、0.16、0.24、0.33、0.55 mg/ml的对萼猕猴桃叶提取液5 ml，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的转移率随上样液浓度的增加而升高（图3A），当上样液浓度大于0.55 mg/ml时，其流动性变差，不予考虑，因此选择0.55 mg/ml作为合适的上样液浓度。
图 3 D101型大孔树脂纯化对萼猕猴桃叶提取液工艺考察结果
（4）吸附流速考察
称取3份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液5 ml，分别以0.5、1、2 ml/min的流速上柱吸附，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，吸附流速增大，对萼猕猴桃苷E的转移率下降（图3B），故选择0.5 ml/min作为合适的吸附流速。
（5）最大上样体积考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g（1 BV=30 ml），湿法装柱，制备一定体积的浓度为0.55 mg/ml的上样液，吸附流速为0.5 ml/min，收集流出液（每15 ml收集1管），根据泄露曲线确定最大上样量。结果表明，当上样体积大于12 BV时，流出液中检测到对萼猕猴桃苷E，且泄露量逐渐增大（图3C），因此确定上样量为12 BV。
（6）梯度洗脱曲线考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，完全吸附后，加水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇各4 BV依次洗脱，收集各段洗脱液，每1 BV为1份。结果显示，水和10%乙醇洗脱液中有极少量的对萼猕猴桃苷E，其主要集中在30%和50%乙醇洗脱液中（图3D），故选择水和10%乙醇除杂，50%乙醇洗脱。
（7）除杂溶剂用量考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速上样吸附，加水和10%乙醇除杂，均冲洗10 BV，按柱体积收集各段除杂液，将其烘干称重。结果表明，水和10%乙醇除杂液烘干质量均在第5 BV后无明显变化（图3E），因此除杂体积均控制在5 BV。
（8）洗脱溶剂用量考察
称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇洗脱10 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，7 BV后洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量基本可以忽略（图3F），因此选择50%乙醇洗脱液的用量为7 BV。
（9）D101型大孔树脂柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证
称取已处理的D101型大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速进行动态吸附，完全吸附后，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，除杂和洗脱流速均为2 ml/min，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量，计算该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率，并将洗脱液浓缩干燥至恒重，备用。结果表明，在大孔树脂纯化步骤中，对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的转移率为91.36%。该纯化工艺稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶提取液的纯化。
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（1）硅胶柱装填
称取200~300目硅胶适量，用初始比例的洗脱液充分溶胀后湿法装柱，尽可能地排出柱子中的气泡，待其沉降后加入洗脱液充分冲洗压实，直至硅胶层界面不再下降。收集D101型大孔树脂50%乙醇洗脱部分所得的干燥样品，适量甲醇溶解后与100~200目硅胶按质量比1∶1~1∶1.5于50 ℃水浴锅上充分混匀蒸干，干法上样后在其表面加一层空白硅胶，以不同比例的洗脱液洗脱，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。
（2）不同洗脱系统的考察
①二氯甲烷-甲醇洗脱系统的考察：采用湿法装柱干法上样的方式进行硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，每个梯度洗脱5 BV，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E主要集中在10∶1和8∶1洗脱部位（图4A），可选择二氯甲烷-甲醇8∶1洗脱5 BV进行硅胶柱色谱。
图 4 硅胶柱色谱不同洗脱系统考察结果
②乙酸乙酯-乙醇洗脱系统的考察：依次用乙酸乙酯-乙醇20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，其余步骤同上。结果显示，对萼猕猴桃苷E在10∶1条件下基本已完全洗脱（图4B），因此可选择乙酸乙酯-乙醇洗脱系统10∶1洗脱5 BV。
在硅胶柱色谱实验中，使用上述两种洗脱体系所得对萼猕猴桃苷E的转移率分别为82.09%、83.21%，两者相差不大，考虑到洗脱溶剂的毒性安全性问题，选择乙酸乙酯-乙醇系统作为硅胶柱色谱步骤的洗脱体系。
（3）硅胶柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证
硅胶柱色谱采用湿法装柱干法上样的方式进行操作，上样后以乙酸乙酯-乙醇10∶1洗脱5 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的含量，得该步骤对萼猕猴桃苷E的转移率为83.52%。
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将浸泡在甲醇中的ODS填料倒入色谱柱中，待其沉降完全后以初始洗脱比例30%甲醇溶液置换柱子中的纯甲醇溶液。将硅胶柱色谱所得的洗脱液浓缩干燥后用少量甲醇溶解过滤膜后进行湿法上样，待样品完全吸附后，依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，通过液相色谱结果进行合并，合并液再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到较纯的对萼猕猴桃苷E单体化合物（图5），该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率为70.37%，其纯度为99.9%，表明该方法分离纯化效果较好。
图 5 ODS柱色谱所得对萼猕猴桃苷E的HPLC图
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按照优选的对萼猕猴桃苷E提取分离纯化方法对其工艺进行验证。称取对萼猕猴桃叶粉末25 g，以25倍量55%乙醇95 ℃回流提取1 h，滤液减压浓缩。将已处理的D101型大孔树脂进行湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，洗脱液浓缩干燥。硅胶柱采用湿法装柱干法上样的方式进行柱色谱，上样后以乙酸乙酯-乙醇10:1洗脱5 BV，收集并浓缩干燥洗脱液。ODS柱经上样后依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，较纯部分合并后再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到黄色粉末状物质，HPLC进样检测，与对照品比对后确定该物质为对萼猕猴桃苷E。该提取分离纯化工艺所得对萼猕猴桃苷E的转移率为53.70%，得率为0.35%，纯度为99.9%，表明该方法稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取分离纯化。
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中药的提取方法包括热回流提取、水煎煮提取、超声辅助提取等方法[8]，在前期提取方法及提取试剂的考察中，我们使用了水及不同浓度的乙醇考察提取溶剂对对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E提取率的影响，结果表明，乙醇浓度在60%左右时其提取率最大。此外，通过对超声提取法、热回流提取法及渗漉法三种提取方法的比较，发现热回流提取法具有时间较短、节省溶剂、提取率较大的优势，因此在本实验中选用乙醇回流提取法进行单因素考察和正交试验。
在回流提取实验的单因素考察中，除了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度外，提取次数也是一个重要的考察因素。本实验发现，第2次回流提取所得的提取液中对萼猕猴桃苷E含量极低，基本可以忽略，因此在实验中确定提取次数为1次。
大孔吸附树脂柱色谱是分离纯化黄酮类化合物常用的方法之一[9]，其吸附与解吸附性能对化合物的转移率有很大影响。本实验中，我们对D101型大孔树脂进行静态吸附与解吸附动力学考察，分别在不同时间点吸取未吸附液及解吸附液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果显示，D101型大孔树脂属于慢速吸附型树脂，在上样时，应尽量降低流速，增加样品与树脂的接触时间，其解吸附能力较强，洗脱时可加大流速。
葡聚糖凝胶柱和ODS柱常作为化合物精制纯化的关键一步。前者主要是依据分子筛原理，由于化合物的分子量不同，在凝胶柱中受到的阻滞作用也不同，导致分子量大的化合物先被洗脱下来[10]；后者是根据化合物极性的不同进行分离的，由于反相柱中固定相极性小于流动相极性，致使极性较大的化合物先从柱中流出。在硅胶柱色谱后，我们发现对萼猕猴桃叶洗脱液中主要成分为两个黄酮苷类化合物，两者结构式仅有一个乙酰基之差，使用葡聚糖凝胶柱始终无法完全分离。其中对萼猕猴桃苷E的极性与另一黄酮类化合物相比极性较小，通过高效液相色谱可以将两个化合物分离，且分离度较好。因此，选用ODS反相柱进行纯化，最终得到对萼猕猴桃苷E单体化合物。
本实验从中药资源非药用部位的开发利用角度出发，对对萼猕猴桃叶进行研究，首次设计出一条稳定可行、重复性好的提取分离纯化工艺从对萼猕猴桃叶中分离得到对萼猕猴桃苷E，整个工艺操作简易，提取效率高，所得对萼猕猴桃苷E纯度为99.9%。作为一个新化合物，其药物开发过程有很长的路要走，本实验所做的提取分离纯化工艺研究为对萼猕猴桃苷E进一步的药代动力学研究、安全性药理研究等内容的实施奠定了物质基础。
Study on the extraction, separation and purification process of actinoside E
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摘要:
目的 优选对萼猕猴桃苷E的提取分离纯化工艺。 方法 以对萼猕猴桃苷E的含量为指标，采用单因素考察结合正交试验确定对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺；通过优化大孔吸附树脂柱、硅胶柱和ODS柱的色谱条件，对提取物进行分离纯化。 结果 对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺为：以25倍量的55%乙醇95 ℃加热回流1 h。优化的分离纯化工艺为：D101型大孔树脂柱以50%乙醇洗脱7 BV；硅胶柱以乙酸乙酯-乙醇10∶1洗脱5 BV；ODS柱重复纯化50%甲醇洗脱部分，最终得到对萼猕猴桃苷E单体化合物。整个工艺对萼猕猴桃苷E的转移率为53.70%，得率为0.35%，纯度达99.9%。 结论 该工艺稳定可行，可为对萼猕猴桃苷E的开发利用提供物质基础。 Abstract:Objective To optimize the extraction, separation and purification process of actinoside E. Methods Single factor experiment combined with orthogonal test was used to determine the optimal extraction process of actinoside E using its content as an index. The extracts were separated and purified by optimizing the chromatographic conditions of macroporous resin, silica gel and ODS column. Results 25 times amount of 55% ethanol with heating reflux at 95 ℃ for one hour were used as the optimal extraction process of actinoside E. The optimum separation and purification process was as follows: D101 macroporous resin column was eluted with 7 BV of 50% ethanol, silica gel column was eluted with 5 BV of ethyl acetate-ethanol（10∶1）and 50% methanol eluted fraction was purified repeatedly by ODS column to obtain actinoside E. The transfer rate of actinoside E in the whole process was 53.70%, the yield was 0.35%, and the purity was 99.9%. Conclusion The process is stable and viable, which can provide material foundation for the development and utilization of actinoside E. -
Key words:
- actinoside E /
- extraction /
- separation and purification /
- chromatography
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卡培他滨是一种新型的氟尿嘧啶类口服药，它是5-氟尿嘧啶（5-FU）的前体药物。卡培他滨口服给药方便、依从性好、疗效确切，是治疗结直肠癌的基石药物，但在治疗过程中产生的不良反应（手足综合征等）极大地影响了患者的治疗。手足综合征（HFS）是卡培他滨引起的不良反应中较为特殊的反应，也是卡培他滨在治疗过程中的药物剂量限制性不良反应，主要表现为皮肤红肿、水泡、出血、疼痛。合并使用环氧合酶、尿素霜、维生素B6、奥美拉唑也不能完全阻断手足综合征的发生[1-3]；合并使用中草药如白芍、桂枝、甘草等可降低手足综合征的发生率[4]。口服卡培他滨的患者手足综合征发生率高达60%[1]，严重降低患者用药依从性，严重手足综合征（约17%）的患者只能减少药物摄入量乃至停止服用药物，影响化疗按期、足量进行[5-6]。明确手足综合征的发生机制和有效干预对卡培他滨安全有效的应用具有重要价值。目前手足综合征模型的建立还没有统一的金标准，本实验尝试用ICR小鼠灌胃卡培他滨后建立手足综合征模型，为卡培他滨致手足综合征模型的建立及机制研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 动物与药品
雄性ICR小鼠，SPF级，5周龄左右，共42只小鼠，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。经上海中医药大学动物伦理委员会批准，实验动物伦理审查号为PZSHUTCM210715004。将小鼠随机编号1~42号，对照组ICR小鼠6只，实验组ICR小鼠36只。卡培他滨（商品名希罗达，上海罗氏制药有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字号H20073024）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）(国药集团)；离心管（Titan公司）；动物解剖手术器材（瑞沃德公司）；消毒酒精、棉花球、锡箔纸（国药集团）。
1.2 饲养条件与环境
造模前小鼠先饲养1周，保证充足的水源与饲料，42只ICR小鼠自由摄取食物，环境湿度保持区间50%~60%（±5%），控制温度在(23±1) ℃，调节光照为12 h（6: 30至18: 30光照），其余时间为光暗周期。定期观察小鼠培养环境，定期为小鼠更换垫料，清理排泄物。
1.3 给药剂量、方式及周期
卡培他滨0.5 g/片，溶解于10 ml CMC-Na（0.5%）中，制得50 mg/ml悬浊液备用。实验组ICR小鼠（36只），灌胃给药，按275 mg/kg（即小鼠0.15 ml/30g）连续灌胃14 d，2次/d（按照卡培他滨临床给药方案1 250 mg/kg，2次/d的剂量换算）。对照组ICR小鼠（6只），灌胃给予CMC-Na（0.5%）溶液，按照4 ml/kg剂量连续的灌胃14 d，2次/d。
1.4 手足综合征阳性判断标准
1.4.1 小鼠手足综合征观察
取ICR小鼠的后足跖部皮肤组织，用生理盐水冲洗并擦干，以多聚甲醛（4%）对小鼠组织进行固定，石蜡包埋切片，使用苏木精-伊红对小鼠组织染色（H&E染色），使用普通光镜（比例尺5 μm）检测（注：染色呈现蓝色的为表皮层，该层位于淡粉色的角质层和淡蓝色的真皮层之间）。每天肉眼观察，若小鼠出现足跖部特征性改变，立即拍照并记录手足综合征发生时间，每3 d拍照记录小鼠足跖部皮肤变化情况。
1.4.2 小鼠体重观察
实验组与对照组自由饲养1周后称重，记录原始体重，灌胃给药后每3 d对所有实验小鼠称重一次并记录体重变化。
1.4.3 手足综合征阳性参考标准
标准参考美国国家癌症研究所（NCI）关于手足综合征的分级规定，建模实验中若实验小鼠足跖部的皮肤呈现了红色斑块、组织肿胀、角质层脱屑、溃疡、角质层厚度明显增加及其他明显体征者均可判定为手足综合征阳性。
1.5 样本收集方案
1.5.1 手足综合征阳性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
对于手足综合征阳性的小鼠，在出现手足综合征后，经眼眶采样，用1.5 ml离心管（肝素钠抗凝）取血约0.5 ml，12 000 r/min离心10 min，收集血浆约0.25 ml，置于−80 ℃冰箱冷冻保存。采集小鼠血样后按照实验动物伦理要求规范处死小鼠，用手术剪取小鼠手足部皮肤，生理盐水冲洗后用锡纸包裹住样本并标号。所有样本置于−80 ℃冰箱冷冻保存，所有操作在1 h内完成。
1.5.2 手足综合征阴性ICR小鼠的血浆和足趾部皮肤组织样本制备
小鼠经过14 d给药未出现手足综合征阳性反应，则认定该类小鼠为造模失败小鼠，在第15天对该类小鼠统一进行眼眶采血和足趾部皮肤组织样本收集，方法同“1.5.1”。对照组小鼠在第15天收集样本，方法同“1.5.1”。
1.6 统计分析
数据采用平均值±标准差（mean±SD）表示，组与组之间根据数据分布状态比较采用学生t检验或秩检验，P<0.05认为有统计学差异。制图采用Excel或Graphpad 8.0软件。
2. 结果与讨论
2.1 小鼠体重变化及生存状态
通过对比对照组与实验组ICR小鼠体重变化，发现对照组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显增加；而实验组ICR小鼠，灌胃14 d后，体重明显降低。表1和图1 为14 d内ICR小鼠的体重变化，实验过程中实验组小鼠死亡3只。
表 1 实验周期内小鼠体重变化情况（m/g，$ \bar{x}\pm s $ ）组别 n 0 d 7 d 14 d 对照组 6 28.54±0.71 32.56±0.88 34.66±1.07 实验组 33 29.07±0.76 26.84±1.74*** 23.15±2.31*** *** P<0.001，与对照组比较。 2.2 小鼠手足综合征病理观察
与对照组ICR小鼠相比，19只实验组小鼠的足底皮肤明显出现红斑、肿涨并出现少许水泡（图2），认为该小鼠出现手足综合征，按照伦理要求将小鼠处死，收集足底皮肤组织样本和血浆样本。
2.3 小鼠足底皮肤H&E染色
将ICR小鼠四肢皮肤用4%多聚甲醛固定后进行H&E染色（因苏木精呈碱性，细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红呈酸性，细胞质和细胞外基质中的成分显红色），如图3显示。与正常ICR小鼠相比，手足综合征阳性小鼠皮肤表皮层增厚，角质层呈现粉红色，真皮层呈现浅蓝色，表皮层处在二者之间呈现蓝色。发生HFS小鼠皮肤颗粒层变薄，基底层和棘层间细胞数量减少。正常小鼠角质层明显较薄。
2.4 小鼠手足综合征发生率
ICR小鼠共39只（对照组6只，实验组33只），19只实验组ICR小鼠出现手足综合征阳性症状，发生率为57.58%。实验组ICR小鼠灌胃给药1周，出现手足综合征阳性小鼠与未出现手足综合征小鼠相比：实验组小鼠足底皮肤颜色变深（深红色），少量小鼠四肢掌心有透明水泡样组织出现；在灌胃给药10 d后，实验组小鼠出现手足综合征阳性症状，四肢出现了红斑、脱屑、水泡（红斑出现最多，脱屑其次，水泡最少）等情况。
2.5 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析
将收集的血浆样本按照前期报道的方法进行卡培他滨及其5种代谢产物（5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、去氧氟尿苷、5'-氟-2'-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮[7]）定量（ng/ml，mean±SD）。结果发现，发生手足综合征小鼠与未发生手足综合征小鼠相比，卡培他滨浓度(ng/ml)分别为(58.08±44.54)和(39.23±26.98)，5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷浓度(ng/ml)分别为(
6047.42 ±3331.94 )和(4442.77 ±2140.44 )，去氧氟尿苷浓度(ng/ml)分别为(2899.28 ±1821.15 )和(2018.81 ±1037.86 )，5'-氟-2'-脱氧尿苷浓度(ng/ml)分别为(112.89±36.85) 和(122.23±19.16)，5-氟尿嘧啶浓度(ng/ml)分别为(46.86±23.08)和(38.33±20.62)，5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮浓度(ng/ml)分别为(24.45±14.79)和(27.34±17.84)。卡培他滨及其代谢产物在发生和未发生手足综合征小鼠体内暴露水平均无明显差异（P>0.05，图4）。
图 4 卡培他滨及其代谢产物暴露浓度分析注：Cap：卡培他滨；5-DFCR：5'-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷；5-DFUR：去氧氟尿苷；2-DFUR：5'-氟-2'-脱氧尿苷；5-FU：5-氟尿嘧啶；FUH2：5-氟二氢嘧啶-2,4-二酮。3. 讨论
体内药物暴露水平同药物疗效和不良反应密切相关。目前药物暴露水平常用的参数有曲线下面积（AUC）、稳态浓度（css）、峰浓度（cmax）、谷浓度（cmin）等。有研究发现[8]，根据5-FU的AUC调整给药剂量后，患者血液系统出现3~4级不良反应发生率从之前的17.5%下降为 7.6%（P<0.05），黏膜炎的发生率也从5%降低为0%（P<0.01），总生存时间显著增加，从原来的16个月延长到22个月（P<0.01）。因此，5-FU在体内浓度可能成为预测疗效及不良反应的潜在预警生物标志物之一[9-10]。本研究中未发现卡培他滨及其代谢产物同手足综合征具有相关性，但Daher Abdi在20名75岁以上老年患者中发现，卡培他滨及其代谢产物在发生手足综合征患者体内暴露水平明显较高[11]，但体外研究表明，5-FU同手足综合征无明显关联[12]。另有研究表明，手足皮肤局部较高表达的胸苷磷酸化酶可产生局部较高浓度的5-FU，同卡培他滨引发的手足综合征密切相关[13]。总之，卡培他滨引发手足综合征的机制仍需进一步研究。
在卡培他滨致手足综合征模型的建立方面，黎鹏等灌胃给予SD大鼠200~400 mg/d，2次/d，用药1~2周（1周后停药3 d），建立了卡培他滨致手足综合征模型，并认为200 mg/kg的剂量，灌胃2周可较好地建立手足综合征模型（造模成功率77.5%）[14]。但有研究显示，卡培他滨在大鼠体内的代谢过程与人体不同，因大鼠体内胞苷脱胺酶活性较低，5-DFCR通过糖基化生成其他产物，产生的5-FU较少，而卡培他滨在小鼠体内的代谢过程与人体基本相同，可能是最好的动物模型[15-16]；Hiromoto [3]等利用ICR小鼠，灌胃给予200 mg/kg，1次/d，5次/周的方法建立手足综合征模型，3周建立手足综合征模型，但成功率未报道。He和Chen等给予ICR小鼠灌胃200 mg/kg，1次/d，连续灌胃30 d后，6只小鼠中仅有1只未发生手足综合征[17]。前期预实验中，采用灌胃200 mg/kg，2次/d的方法在ICR小鼠上建立手足综合征模型，灌胃1周后，6只小鼠仅有1只发生手足综合征。因此，根据临床卡培他滨用药剂量（1 250 mg/kg，2次/d）换算小鼠剂量为275 mg/kg，2次/d，既缩短了给药时间，又提高了建模成功率（57.6%），且较少有小鼠死亡（3只）。
4. 小结
本实验成功建立了卡培他滨致手足综合征的ICR小鼠模型，在给药时长、造模成功率方面均有一定优势。卡培他滨及其代谢产物在小鼠体内暴露浓度同手足综合征发生可能无关。手足综合征的发生机制仍需进一步研究。
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表 1 L9（34）正交试验结果及直观分析（n = 3）
编号 A（%） B（w/V） C（t/h） D（T/ ℃） 对萼猕猴桃苷E含量（mg/g） 1 2 3 1 55（1） 1∶20（1） 0.5（1） 90（1） 7.94 7.98 7.87 2 55（1） 1∶25（2） 1（2） 95（2） 7.99 7.98 8.09 3 55（1） 1∶30（3） 1.5（3） 100（3） 7.89 7.85 7.98 4 65（2） 1∶20（1） 1（2） 100（3） 7.87 7.81 7.77 5 65（2） 1∶25（2） 1.5（3） 90（1） 7.85 7.99 7.97 6 65（2） 1∶30（3） 0.5（1） 95（2） 7.91 7.93 8.05 7 75（3） 1∶20（1） 1.5（3） 95（2） 7.91 7.91 7.81 8 75（3） 1∶25（2） 0.5（1） 100（3） 7.84 7.75 7.81 9 75（3） 1∶30（3） 1（2） 90（1） 7.88 7.97 7.87 K1 71.57 70.87 71.08 71.32 K2 71.15 71.27 71.23 71.58 K3 70.75 71.33 71.16 70.57 k1 7.95 7.87 7.90 7.92 k2 7.91 7.92 7.91 7.95 k3 7.86 7.93 7.91 7.84 R 0.09（2） 0.05（3） 0.02（4） 0.11（1） 
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表 2 对萼猕猴桃叶提取工艺方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 A 0.037 2 0.019 4.989 0.019* B 0.014 2 0.007 1.856 0.185 C 0.001 2 0.001 0.167 0.847 D 0.061 2 0.031 8.161 0.003** 误差 0.067 18 0.004 合计 0.181 26 注：f1=2，f2=18，F0.05（2, 18）=3.55；*P<0.05，**P<0.01.
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表 3 不同型号大孔树脂对对萼猕猴桃苷E静态吸附和解吸附的测定结果
树脂型号 吸附率（%） 解吸率（%） 权重（%） D101 91.54 96.67 88.49 AB-8 88.71 98.01 86.94 DM130 62.10 89.80 55.76 HPD100 87.82 97.25 85.41 NKA-9 87.15 97.64 85.09
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