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传统中药黄芪可补益肝气、活血利水，对各种慢性肝病均具有治疗作用[1]，其有效成分包括黄芪皂苷类、黄芪多糖类、黄芪黄酮类等。其中，黄芪甲苷（AS-Ⅳ）作为《中国药典》规定的中药黄芪的质控标准，是中药黄芪的主要活性成分，具有抗炎、降糖调脂、抗纤维化等作用[2]，已被证实能改善实验性非酒精性脂肪肝[3]。但黄芪甲苷水溶性差、生物利用度低等特点限制了其临床应用前景。本课题组研究人员前期通过对黄芪甲苷进行结构优化改造，提高化合物溶解性，改善药物动力学性质，筛选到水溶性好、成药性佳的小分子化合物HHQ16[4]，具有良好的新药研发前景。
ORM （Orosomucoid）是一种主要由肝脏合成分泌的急性期蛋白，在血清、肝脏及其他外周组织以ORM1亚型表达为主。ORM具有运载药物、免疫调节等多种生物学功能，近年来，其在代谢性疾病中的作用受到越来越多的关注[5]。本课题组研究人员前期研究发现，ORM是一个新的内源性能量调控蛋白，ORM1缺失可导致小鼠肝脏脂质沉积[6]。Zhou等也发现，ORM2可以抑制脂质从头合成，改善肝脏的脂代谢[7]。这些研究都提示ORM可成为治疗肝脏脂代谢相关疾病的潜在靶标。
本研究中采用游离脂肪酸（FFA）诱导肝细胞脂质损伤模型，探讨全新小分子化合物HHQ 16对肝细胞脂质沉积的改善作用及对ORM信号的调控作用。
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油红O（0684，Amresco）、棕榈酸钠（Macklin）、油酸（Sigma）、牛血清白蛋白（Sigma）、异丙醇（80109218，国药集团）、α1 酸性糖蛋白抗体（Genway Biotech Inc.）、GAPDH 抗体（Affinity）、Tubulin 抗体（Affinity）、抗兔 IgG 抗体（Rockland）、油红O染色试剂盒（Solarbio）、细胞及组织总蛋白抽提试剂盒（数谱生物）、NC 膜（GE Amersham）、NC 膜平衡液（VisualProtein）、封闭液（VisualProtein）、蛋白酶抑制剂三联装（上海碧云天生物有限公司）、蛋白质预染色标记（上海碧云天生物有限公司）。
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酶标检测仪（Epoch BioTeK）、涡旋混合器（MX-F Servicebio）、台式高速冷冻离心机（D3024R，大龙）、蛋白电泳仪（Bio-Rad Laboratories，Inc）、蛋白快速湿转仪（GenScript，Inc.）、荧光扫描仪（Li-COR Biosciences）、制冰机（Scotsman Industries Inc.）、电热恒温水浴锅 SVT3100（杭州瑞城仪器有限公司）、PCR 扩增仪（Thermo Fisher Scientific）、QuantStudio 3 实时荧光定量PCR仪（ABI）。
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小鼠肝细系 AML12，购自中国科学院细胞库。培养液配方：DMEM/F-12 （1∶1）、FBS（Fetal bovine serum）、1‰ ITS 液体补充剂、1‰双抗生素。培养条件：5%CO2、37 ℃恒温孵育箱。
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1%BSA配制：100 mg 牛血清白蛋白（BSA）加入10 ml双蒸水，振荡混匀，4 ℃保存备用；12 mmol/L油酸（OA）储备液（12.976 mg）加入5 ml 1% BSA 溶液中，振荡混匀，0.22 μm微孔滤膜进行滤菌处理，4 ℃保存；6 mmol/L 棕榈酸钠（PA）储备液（8.352 mg）加入5 ml 1% BSA溶液，60 ℃水浴加热混匀至无沉淀析出，0.22 μm微孔滤膜进行滤菌处理，4 ℃保存，冷却之后出现沉淀为正常形象，不高于 60 ℃水浴加热后可继续使用。接种细胞：将 AML12小鼠肝细胞接种于6孔板，密度约为106 个/孔，每组复孔为3，在 37 ℃、5%CO2 恒温培养箱培养。细胞造模：弃去完全培养基，按照OA∶PA=800 μmol/L∶400 μmol/L 的比例，用无血清培养基稀释药物储备液（即配即用），刺激细胞 24 h，构建 FFA 脂质沉积模型；同样按照OA∶PA=1 000 μmol/L∶500 μmol/L 的比例刺激细胞 24 h，构建 FFA 脂质损伤模型。在药物处理前，更换含PA、OA的无血清培养基，用于后续实验。
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用PBS漂洗AML12细胞2次后，提取细胞总蛋白，参照碧云天BCA（Bicinchoninic Acid Assay）蛋白浓度测定试剂盒说明书测量蛋白浓度，加入1/4体积的5X蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，按20 ng蛋白/孔上样电泳，转膜，封闭1 h，一抗ORM（1∶1 000），GAPDH（1∶5 000），Tubulin（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶10 000）37 ℃孵育1 h。ECL法显色曝光，使用ImageJ图像分析软件测定蛋白灰度值。
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接种细胞：将AML12 接种于 96 孔板，密度约 104个/孔，每组复孔为 6。药物刺激：弃去培养基，用无血清的培养基加不同浓度 FFA（OA∶PA=2∶1）刺激细胞 24 h 后，在原培养基里加入浓度为 1 μmol/L 黄芪甲苷衍生物 HHQ16 刺激 12 h。CCK8 检测：弃去培养基，每孔加 100 μl 无血清培养基，快速加入 10 μl CCK8 （Cell Counting Kit-8）溶液，勿产生气泡，放入培养箱孵育 15、30、60、120 min。吸光度测定：在上述时间点测定 450 nm 处A值，根据不同组之间的A值计算组间差异。
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采用AG RNAex Pro RNA 提取试剂（艾科瑞生物，中国），按照说明书提取小鼠肝脏和小鼠肝细胞（AML12）的RNA，随后采用Evo M-MLV 反转录试剂盒（艾科瑞生物，中国）将RNA逆转录为cDNA，逆转录反应条件如下：37 ℃ 15 分钟、85 ℃ 5 秒、4 ℃ ∞。以GAPDH为内参，采用实时荧光定量 PCR 方法对目的基因进行定量分析，通过 2−△△Ct 计算目的基因在不同组别之间的表达差异。反应条件如下，保持阶段 ，95 ℃ 10 分钟 ；循环阶段 ，95 ℃ 15 秒 （40 个循环） ，60 ℃ 1 分钟 ；熔化曲线阶段， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。引物序列见表1。
表 1 相关引物序列
基因 上游序列（5'—3'） 下游序列（5'—3'） ORM1 ACACAATAGAGCTTCGGGAGT ATATCTGGCCTTTTGGCATAGA GAPDH CCAATGCACCACTGCTTAG GGATGCAGGGATGATGTTCT -
样品前处理：直接在培养板中裂解细胞，按100 μl/106 加入裂解液，混匀后静置 10 min，取适量上清液，70 ℃加热 10 min，室温 2 000 r/min离心5 min，上清液直接用于酶学测定，余下裂解液参照 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量或−20 ℃保存备用。
样品测定：选取96孔板，分为样品孔、标准孔和空白孔，每孔分别加入10 μl待测样品、标准品及蒸馏水，再加入190 μl工作液，37 ℃或 25 ℃反应 15 min，反应平衡后在60 min内稳定，根据吸光度值计算待测样本甘油三酯浓度。
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移除细胞培养基后，用PBS洗涤两次后，加油红O固定液固定20～30 min。弃去固定液，用蒸馏水洗涤2次，加入60%异丙醇浸洗20～30 s。弃去60%异丙醇后加入新配置好的油红O染色液，浸染10～20 min。弃去染色液，60%异丙醇漂洗20～30 s至间质清晰，水洗2～5次，直至无多余染液。加入Mayer苏木素染色液，复染核1～2 min，弃去染液后水洗2～5次，加入油红O缓冲液孵育1 min，弃去。加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。采用 ImageJ软件对免疫组化阳性细胞占区域面积比进行统计并分析数据。
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ORM1基因的siRNA由广州锐博生物技术有限公司构建，序列见表2。
表 2 基因转染序列
siRNA 序列 siORM1-1 GCAGGCAATTCAAACAATG siORM1-2 CAACTTCACCATAGGCGAA siORM1-3 CCACCAACTTGATAAACGA 接种细胞：AML12细胞接种于12孔板，密度约 106个/孔，每组复孔为3。
siRNA 孵育液配置：采用Polyplus Transfection公司INTERFERin转染试剂，以12孔板为例，取1 μl siRNA溶液，加入200 μl DMEM/F12培养基，混匀离心，再加入5 μl INTERFERin 转染试剂，再次混匀离心，室温孵育10 min。
转染：更换原培养基为含1% FBS的完全培养基，每孔加入siRNA 孵育液200 μl，48 h后收集细胞总蛋白、总RNA。
验证：根据蛋白和基因水平确定最佳干扰序列。
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本实验采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计与分析。单因素两组之间相互比较，采用student t检验分析；单因素多组之间相互比较，采用单向方差分析 one way ANOVA 检验；组间均值两两比较采用 Dunnett’s multiple comparisons test 检验。实验结果均采用（均数±标准误）表示。 若P<0.05 ，则认为差异具有统计学意义。
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用经典FFA（OA:PA=2:1）进行脂质沉积造模，在小鼠AML12细胞上，当OA∶PA=200 μmol/L∶100 μmol/L时，开始出现脂质沉积，当OA：PA=400 μmol/L∶200 μmol/L时，可见明显脂质沉积（图1A），但当OA∶PA=800 μmol/L∶400 μmol/L时才发生肝细胞活力下降（图1B）。在给予药物HHQ16 后，可缓解FFA导致的脂质沉积，降低甘油三酯水平，恢复肝细胞活力（图1C~F）。
图 1 HHQ16改善肝细胞脂质损伤
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分别用相同剂量的黄芪甲苷和HHQ16处理AML12肝细胞，发现相较于黄芪甲苷，改造后的HHQ16能更显著地提高细胞内ORM水平（图2A）。进一步时效和量效实验显示，HHQ16可以时间依赖性与剂量依赖性地升高ORM的表达水平（图2B、2C）。此外，CCK8实验结果显示，黄芪甲苷与HHQ16在最高实验剂量（1 000 nmol/L）下均未对AML12细胞活力产生影响（图2D），说明该实验浓度下药物无细胞毒性。
图 2 HHQ16显著升高ORM表达
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研究人员初步探索了HHQ16调控ORM表达的机制，HHQ16能显著升高肝脏ORM主要亚型ORM1的mRNA水平（图3A），提示HHQ可能在转录水平调控ORM1表达。据文献报道，ORM的表达受C/ebp-β、雄性激素受体（Ar）和雌性激素受体（Er）等转录因子调控[8–10]。检测这3个转录因子的表达水平，发现HHQ16给药不影响C/ebpβ的mRNA表达水平（图3B），但Ar的mRNA表达水平上升至原来的2倍左右（图3C），同时Er-α的mRNA表达水平下降到原来的1/2左右（图3D）。提示HHQ可能通过影响上游转录因子Ar和Er的表达，进而升高肝细胞内ORM水平。
图 3 HHQ16对ORM上游的影响（n=4）
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小鼠ORM共有3个亚型，其中，ORM1为肝脏中表达的主要亚型[5]。为验证HHQ16是否通过ORM1发挥药效，设计了ORM1的siRNA，利用实时定量PCR、Western blot验证不同siRNA序列的干扰效率，综合二者结果得出siORM1-3序列的干扰效果最佳，后续实验均采用siORM1-3序列（图4A、B），发现HHQ16改善FFA诱导的AML12细胞脂质沉积的作用被逆转（图4C、D），说明HHQ可能是通过调控ORM1来改善肝细胞脂质沉积的。
图 4 HHQ通过ORM改善FFA诱导的肝细胞脂质损伤
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肝脏作为脂质与脂蛋白摄取、合成与分泌的主要器官，在全身脂质循环中发挥着至关重要的作用。其中，肝脏因子作为肝脏组织分泌的蛋白质，除影响肝脏局部脂质代谢外，还可通过自分泌、旁分泌、内分泌等途径调节全身的脂质代谢。本课题组研究人员前期研究发现，肝脏因子ORM在能量代谢调控中发挥重要作用，ORM1敲除小鼠会出现严重脂肪肝[5]。Zhou等也报道了ORM2缺陷会导致肝内甘油三酯沉积、肝脂肪变性，而补充ORM2能通过影响固醇调节元件来改善肝脏脂质代谢[7]。这些研究都提示，ORM有望成为治疗肝脏脂质代谢异常的新靶标。
传统中药在脂肪性肝病的治疗预防方面已经有数千年的治疗史，多种有效成分被发现具有降脂、抗氧化、缓解脂肪肝等作用，如水飞蓟素（水飞蓟主要有效成分）可提高肝脏抗氧化能力，促进肝细胞修复与再生[11]；淫羊藿苷（中药淫羊藿的主要成分）可通过提高大鼠葡萄糖利用率与胰岛素敏感性，达到一定的降脂作用[12,13]；黄芪甲苷可通过增加胆固醇的排出[14]，降低肝脏与血液中的总胆固醇与甘油三酯水平[15]。然而，许多天然的活性成分不稳定，提取物的质量受光照、环境温度、湿度、时间等因素影响，这在一定程度上限制了中药提取物的临床应用。本课题组前期通过对黄芪的主要有效成分黄芪甲苷进行化学改造，得到化学稳定性更高，生物利用度更好的全新小分子药物HHQ16。本文研究发现，黄芪甲苷衍生物HHQ16可以显著升高肝细胞ORM水平，并且对ORM的调控优于其前体黄芪甲苷。初步机制探索发现，HHQ16可以升高转录因子Ar的水平，并降低Er表达。据文献报道，Ar可通过结合ORM1增强子区域增强ORM的表达[8]，而Er激活后则通过MAPK通路抑制ORM表达[9]，提示HHQ可能通过多条途径提高ORM水平。同时，本研究发现，HHQ16改善肝细胞脂质沉积的作用是由ORM介导的，初步阐明了HHQ16改善肝细胞脂质沉积的机制，为HHQ16进一步开发成为干预与治疗肝脏脂质代谢紊乱相关疾病的潜在药物提供了理论支撑。
Upregulation of α1-acidglycoprotein to ameliorate hepatocyte lipid accumulation by Astragaloside derivative HHQ16
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摘要:
目的 研究黄芪甲苷衍生物HHQ 16对肝细胞脂质沉积的作用及机制。 方法 在AML12肝细胞上用游离脂肪酸构建脂质沉积模型，检测细胞的甘油三酯和油红染色等反映肝细胞脂质沉积情况。通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测α1酸性糖蛋白（ORM）及其上游相关调控因子表达。通过siRNA技术对ORM1的表达进行干扰，确定ORM1是否介导HHQ16的作用。 结果 HHQ16显著改善FFA导致的肝脂质沉积，同时HHQ16升高ORM表达，干扰主要亚型ORM1表达后HHQ16改善肝细胞脂质沉积作用被逆转。 结论 HHQ16通过升高ORM改善肝细胞脂质沉积。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of HHQ 16, a derivative of astragaloside Ⅳ, on hepatocyte lipid accumulation. Methods Free fatty acids were used to stimulate lipid hepatocyte accumulation. Triglyceride and Oil Red O staining were detected to reflect hepatocyte lipid accumulation. The expression of α1-acidglycoprotein （ORM） and its regulators were detected by real-time quantitative PCR and immunoblotting. The expression of ORM1 was interfered with siRNA to determine whether it mediated the action of HHQ16.The expression of ORM1 was interfered by siRNA to determine whether it mediated the action of HHQ16. Results HHQ16 significantly ameliorated FFA-induced hepatocyte lipid deposition. HHQ16 elevated ORM expression, and the protective effect of HHQ16 on hepatocyte lipid accumulation was reversed by ORM interference. Conclusion HHQ16 could ameliorate hepatocyte lipid accumulation by elevating ORM. -
Key words:
- HHQ16 /
- ORM /
- hepatocyte /
- lipid accumulation
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骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）属于脊柱骨折，多发于中老年人，为临床最为常见的骨质疏松性骨折之一，严重影响患者脊柱功能、日常活动能力等，且发病率、致残、致死率均较高。现阶段，临床多以经皮椎体成形术（PVP）对OVCF患者进行治疗，临床疗效确切，可迅速缓解骨折引起的疼痛，促进椎体形态和功能恢复，但其对患者骨质疏松程度及骨质疏松引起的疼痛改善效果欠佳，故临床倡导PVP术后予以适当的干预以改善手术效果[1]。西医临床常用药物为碳酸钙D3，但有研究[2]指出其对部分患者的干预效果较差，临床多与中医药物干预、锻炼等相结合对PVP术后OVCF患者进行治疗。中医学认为，OVCF属“骨痿”范畴，主要病机为肾精不足、气滞血瘀所致骨质枯槁，肝肾阴虚证为其主要证型之一，应治以滋补肝肾，填精壮骨[3]。中药膏方含阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参等，根据临床中药机制可见其有补肾填精、益气健脾、通络止痛等功效，但其对PVP术后OVCF患者的疗效及机制尚未完全明确[4]。故设立本研究，以120例于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象进行前瞻性随机对照研究，旨在进一步观察中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF患者的疗效，为其临床应用提供参考。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取120例2016年1月至2017年9月于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象，患者均知情同意，按随机数字表法将其分为观察组（60例），对照组（60例）。本研究经我院医学研究伦理研究委员会审核通过。观察组：男35例，女25例；年龄50~80岁，平均（66.27±2.15）岁；体质量指数（BMI）19~25 kg/m2，平均（22.35±0.41）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.51±0.22）年；骨折病程1~3周，平均（1.55±0.12）周；骨压缩程度[5]：轻度16例，中度30例，重度14例。对照组：男33例，女27例；年龄51~78岁，平均（66.18±2.20）岁；BMI 19~25 kg/m2，平均（22.41±0.42）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.48±0.20）年；骨折病程1~3周，平均（1.52±0.13）周；骨压缩程度：轻度15例，中度29例，重度16例。两组性别、年龄、BMI、骨质疏松病程、骨折病程、压缩程度等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 纳入标准
①中医诊断符合《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识（2015）》[6]中肝肾阴虚证相关辩证标准，西医诊断符合《骨质疏松性骨折诊疗指南》[7]中OVCF相关诊断标准，并经临床检查确诊者；②均为胸腰椎骨折，且是首次因OVCF就诊者；③无PVP相关禁忌，手术成功，且术后生命体征平稳者；④近3个月内未行特殊的抗骨质疏松治疗，同期未接受其他治疗者；⑤无脊髓损伤或神经根症状者等。
1.3 排除标准
①椎体爆裂性骨折、陈旧性胸腰椎压缩性骨折或肿瘤、感染等所致病理骨折者；②脊柱结核、骨肿瘤者；③继发性骨质疏松者；④精神障碍、认知能力或沟通能力障碍者；⑤伴严重器官障碍、急性腰扭伤、骨瘤骨转移、强直型脊柱炎、四肢新鲜骨折、软组织损伤者等。
1.4 方法
对照组予以碳酸钙D3咀嚼片[重庆海默尼制药有限公司，国药准字H20205039，碳酸钙1.25 g（相当于钙0.50 g）、维生素D3 200 IU]口服，每次1片，每日2次。同时指导患者每天摄入适量豆类、瘦肉、牛奶、鱼类等优质蛋白（1.20~1.40 g/kg），进行适当的日光浴及行走锻炼（30 min以上）。
观察组在对照组基础上予以中药膏方（将阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参各200 g，鹿角胶、茯苓、桑寄生、熟地黄、牛膝、丹参、威灵仙各150 g，龟板胶、白术、骨碎补、神曲各100 g，炙甘草60 g制成膏剂后即得）口服，开水调服，每次10 g，每日2次。同时指导患者进行八段锦锻炼，所用方法为改良八段锦第八式：躯体直立，两足平行分开（与肩同宽），两手臂自然下垂，手指稍并拢，掌指向前，两膝关节屈曲135°~170°；两眼平视前方，微张口，平稳呼吸，全身放松2 min，紧接着保持原来体位尽可能屈膝下蹲，然后在双上臂伸直情况下慢慢上举到水平，慢慢随之站起（保持躯体直立下），至身体直立时顺势将两脚跟向上提起（期间慢慢匀速吸气到最满并憋气），停顿10~15 s；两脚跟下落着地，双手臂随之顺势下落，回到膝关节屈曲位（期间慢慢匀速呼气）；每次7个循环，每日3次。两组均治疗6个月，并随访3年。
1.5 观察指标
1.5.1 疗效
根据《中药新药临床研究指导原则》[8]可将两组治疗6个月后的疗效分为临床治愈（腰部功能完全恢复，临床症状、体征完全消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），显效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征基本消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），有效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征减轻，X射线可见大量骨痂形成，但未完全愈合），无效（腰部功能有改善，临床症状、体征有减轻，但X射线可见几乎无骨痂形成）。临床治愈率=临床治愈例数/总例数；显效率=显效例数/总例数；有效率=有效例数/总例数；无效率=无效例数/总例数。总有效率=（临床治愈+显效+有效）例数/总例数。
1.5.2 不同时点腰背疼痛情况
以疼痛视觉模拟评分法（VAS，0~10分）[9]评估两组治疗1、3、6个月的腰背疼痛情况，得分越高提示患者腰背疼痛程度越严重。
1.5.3 骨密度（BMD）、椎体后凸角度（Cobb角）及椎体前壁高度（AVBH）变化情况
以BMD测定仪（QDR 4500C，美国Hologic公司）检测两组治疗前、治疗6个月后的腰椎、股骨颈BMD；以X射线检查两组治疗前、治疗6个月后的Cobb角、AVBH。
1.5.4 骨代谢指标
抽取两组治疗前、治疗6个月后的晨起空腹静脉血3 ml，离心机3 000 r/min离心15 min，分离血清，以全自动电化学发光分析仪（罗氏Cobas e601，北京东方迈润医疗器械有限公司）检测血清I型原胶原降解产物（β-Cross I）、N端中段骨钙素（N-MID Ost）、甲状旁腺素（PTH）水平。
1.5.5 PVP术后推体再骨折发生率
记录两组随访时间及随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率，同1例患者发生多次再骨折仅算1例。
1.6 统计学方法
数据采用SPSS 21.0（IBM公司，美国）统计学软件进行分析，计量资料采用（
$\bar x $ ±s）表示，组内比较使用配对t检验，治疗前、治疗6个月后的比较使用独立样本t检验，多组间比较采用F检验；计数资料采用[n(%)]表示，使用χ2检验进行比较。2. 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
治疗6个月后，观察组临床治愈率为73.33%，高于对照组的53.33%（P<0.05）；而两组显效率、有效率、无效率、总有效率比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表 1 两组患者临床疗效比较[n(%)]组别 例数 临床治愈率 显效率 有效率 无效率 总有效率 观察组 60 44(73.33) 13(21.67) 3(5.00) 0(0.00) 60(100.00) 对照组 60 32(53.33) 20(33.33) 8(13.33) 0(0.00) 60(100.00) χ2 5.167 2.048 2.502 P <0.05 >0.05 >0.05 2.2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较
治疗前，两组患者VAS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗3、6个月后两组VAS评分均降低，且观察组低于对照组（P<0.05）；与治疗3个月后比较，治疗6个月后，两组VAS评分均降低（P<0.05，表2）。
表 2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较（$\bar x $ ±s，分）组别 例数 治疗前 治疗3个月后 治疗6个月后 观察组 60 7.55±0.37 2.47±0.33* 1.14±0.23** 对照组 60 7.52±0.35 3.51±0.51* 2.36±0.42** t 0.456 13.262 19.735 P >0.05 <0.05 <0.05 *P<0.05，与治疗前比较；**P<0.05，与治疗3个月后比较 2.3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较
治疗前，两组患者BMD、Cobb角及AVBH比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后两组腰椎、股骨颈BMD及AVBH均升高，且观察组高于对照组（P<0.05）；而两组Cobb角均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表3）。
表 3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 腰椎BMD(g/cm3) 股骨颈BMD(g/cm3) Cobb角(°) AVBH(%) 治疗前 观察组 60 0.70±0.07 0.68±0.06 23.09±2.51 53.93±7.26 对照组 60 0.69±0.08 0.67±0.07 23.11±2.49 54.04±7.44 t 0.729 0.840 0.044 0.082 治疗6个月后 观察组 60 0.93±0.08* 0.93±0.07* 6.47±1.98* 96.56±9.41* 对照组 60 0.84±0.11* 0.85±0.08* 8.91±2.26* 85.73±8.04* t 5.125 5.829 6.290 6.778 *P<0.05，与治疗前比较 2.4 两组患者骨代谢指标比较
治疗前，两组患者血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后，两组血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表4）。
表 4 两组患者骨代谢指标比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 β-Cross I(ng/ml) N-MID Ost(ng/ml) PTH(pg/ml) 治疗前 观察组 60 0.79±0.13 42.10±9.53 62.28±9.42 对照组 60 0.78±0.14 41.98±9.52 62.25±9.39 t 0.405 0.069 0.017 治疗6个月后 观察组 60 0.67±0.10* 36.15±5.46* 52.47±4.02* 对照组 60 0.73±0.12* 38.93±6.14* 57.45±5.72* t 2.975 2.621 5.518 *P<0.05，与治疗前比较 2.5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较
两组患者随访时间、随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率比较，均无统计学意义（P>0.05）；随访3年内，观察组PVP术后推体再骨折发生率为3.33%，低于对照组的20.00%（P<0.05，表5）。
表 5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较组别 例数 随访1年内发生率
[n(%)]随访1~3年内 合计
[n(%)]随访时间
($\bar x $±s, 年)发生率
[n(%)]观察组 60 2(3.33) 1.94±0.43 0(0.00) 2(3.33) 对照组 60 7(11.67) 1.86±0.72 5(8.33) 12(20.00) t/χ2 3.003 0.739 3.339 8.086 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 3. 讨论
骨质疏松为临床常见的慢性骨代谢异常疾病，可见骨钙含量减少、骨量下降，极易出现骨折，OVCF为其临床常见类型。OVCF发病后可致患者出现椎体高度下降、疼痛、功能障碍等，未得到及时有效的治疗，可致残、致死，且其再发骨折风险高[10]。现阶段，微创PVP治疗为大多保守治疗无效的OVCF患者的主要选择，可恢复椎体力学强度、稳定骨折，但骨转换率及骨量流失未能纠正，且手术造成的内外骨膜血管损伤及制动可能会加重骨质疏松而影响患者预后[11]。故PVP术后予以适当的干预治疗至关重要，临床常用药物为碳酸钙D3，其可促进骨质形成而缓解骨质疏松程度，但其多偏重于抑制骨吸收，减轻骨质流失。近年来，越来越多的研究[12-13]发现，中医药治疗PVP术后OVCF有一定成效，其既能抑制流失，又能促进成骨形成，在抗骨质疏松、促进骨折愈合、防治再骨折发生等方面优势明显，现已备受临床医生青睐，但关于何种药物更佳尚无统一定论。
中医认为OVCF属“骨枯”、“骨萎”、“痹证”等范畴，肾中精气是骨生长发育的根本，脾胃为后天之本，气血生化之源，故其发病机制主要为肾精亏虚、脾精不足所致骨骼失养；外伤导致筋脉损伤、气血运行不畅，加之患者湿热寒邪侵袭、肾脾虚亏，容易加重气滞血瘀症状，使得骨骼和筋骨失去濡养，导致骨关节萎缩、活动不利等而诱发OVCF，故治疗应补肾壮骨、活血行气、舒经通络、消肿止痛[14]。中药膏方中的阿胶、枸杞子、鹿角胶、龟板胶可补血益气、填精益髓，其中，龟鹿二仙胶中鹿角胶、龟板胶为主方，与党参、枸杞子配伍可增强益气养阴、补肾填精益髓之功；鸡血藤可活血补血、舒筋活络、疏风止痛；党参可补中益气、生血行血；茯苓可利水消肿、益气健脾；桑寄生、熟地黄、骨碎补、牛膝可补肾壮骨；丹参、威灵仙、神曲可健脾和胃、消食调中，进而减轻膏方的厚腻；炙甘草可补脾和胃，益气复脉，同时调和诸药；全方可发挥补肾填精、益气健脾、通络止痛之功效[15-16]。同时八段锦作为一种由八节不同动作组成的一套医疗、康复体操，其通过人体垂直方向的应力刺激成骨、下蹲平衡锻炼、膀胱经的经气疏通等可对OVCF患者产生舒筋活络的良好功效，进而有助于促进患者腰部功能恢复，提高患者临床疗效。本研究显示，治疗6个月后，观察组临床治愈率高于对照组，且治疗3、6个月后VAS评分低于对照组，进一步说明中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可有效缓解患者腰背疼痛，疗效显著。
OVCF的发生发展与骨代谢及转换密切相关，其中，β-Cross I为骨吸收的重要指标，N-MID Ost为骨形成、骨转换的重要指标，可直接反映成骨细胞的活性与数量变化，PTH则可加速骨代谢活跃，促进骨吸收，血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平升高提示患者骨转换成程度严重，可促进病情进展，不利于PVP术后腰部功能的恢复[17]。本研究显示，治疗6个月后，观察组腰椎、股骨颈BMD及AVBH高于对照组，Cobb角、血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH低于对照组，且随访3年内PVP术后推体再骨折发生率低于对照组，提示中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可调节患者机体骨代谢，提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，降低PVP术后推体再骨折发生率。PVP术后OVCF患者骨折愈合的本质为骨重建，该过程涉及局部微环境的构建、成骨细胞的活化、大量血管的生成等，而现代药理学研究[18-20]指出，中药膏方中的骨碎补含双氢黄酮苷、黄酮等成分，可提高BMD，刺激成骨细胞增殖分化，防止骨吸收、促进骨形成，发挥抗骨质疏松、促进骨折愈合等作用，进而促进腰部功能的恢复；牛膝含牛膝竹节参皂苷，可发挥较好的抗炎、止痛、改善微循环作用，有助于促进局部微环境的构建而促进患者骨折愈合，进而降低再骨折发生率。同时联合八段锦进行治疗，可有效疏通OVCF患者经络，促进机体气血运行通畅，进而可增强中药膏方促进患者腰部功能恢复的作用，降低患者PVP术后推体再骨折发生率。而对照组由于仅进行常规对症治疗，而未对患者采取中药膏方联合八段锦等治疗，故患者复发的风险明显增加。
综上，中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可降低其血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平，调节机体骨代谢，有助于提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，进而缓解患者腰背疼痛，降低PVP术后推体再骨折发生率，疗效显著。
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图 1 HHQ16改善肝细胞脂质损伤
A. 不同浓度FFA造模后脂质沉积情况（n=3）; B.不同浓度FFA造模后肝细胞活力 （n=6）; C. HHQ16恢复FFA损伤的肝细胞活力; D. HHQ16（1 000 nmol/L）降低甘油三酯水平（n=3）, FFA（OA∶PA=800 μmol/L∶400 μmol/L）; E、F. HHQ16 （1 000 nmol/L） 缓解FFA导致的脂质沉积 （n=3）, FFA（OA∶PA=400 μmol/L∶200 μmol/L）*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001，与FFA组比较；#P<0.05, ###P<0.001，与空白组比较。
图 2 HHQ16显著升高ORM表达
A. 黄芪甲苷（AS-IV 100 nmol/L）与HHQ16 （100 nmol/L）处理AML12肝细胞24 h对ORM蛋白表达的影响; B. HHQ升高AML12肝细胞ORM表达的量效实验; C. HHQ升高AML12肝细胞ORM表达的时效实验; D. 黄芪甲苷（AS-IV 100 nmol/L）与HHQ（100 nmol/L）处理24 h对AML12肝细胞活力的影响（n=10）
图 3 HHQ16对ORM上游的影响（n=4）
A.HHQ16升高ORM mRNA水平；B.HHQ16不影响C/ebpβ mRNA水平；C.HHQ16升高Ar mRNA水平；D-F.HHQ16对Er mRNA水平的影响，D.Er-α，E.Er-β，F.Er-γ*P<0.05, ***P<0.001，与DMSO组比较。
图 4 HHQ通过ORM改善FFA诱导的肝细胞脂质损伤
A. siORM处理后ORM蛋白水平变化；B. siORM处理后mRNA水平变化（n=4）；C、D. FFA、HHQ、siORM处理前后脂质沉积情况（n=3）** P<0.01,*** P<0.001，与阴性对照组比较；###P<0.001，与空白组组比较；△△△P＜0.001，与FFA组比较。
表 1 相关引物序列
基因 上游序列（5'—3'） 下游序列（5'—3'） ORM1 ACACAATAGAGCTTCGGGAGT ATATCTGGCCTTTTGGCATAGA GAPDH CCAATGCACCACTGCTTAG GGATGCAGGGATGATGTTCT 
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表 2 基因转染序列
siRNA 序列 siORM1-1 GCAGGCAATTCAAACAATG siORM1-2 CAACTTCACCATAGGCGAA siORM1-3 CCACCAACTTGATAAACGA
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