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河豚毒素（TTX）属于氨基全氢化喹唑啉化合物，分子式为C11H17O8N3，分子量为319。其分子结构类似于生物碱[1]，呈独特的笼形，如图1。河豚毒素粗品为黄褐色粉末，纯品为白色晶体，呈弱碱性，容易潮解，微溶于水溶液，易溶于无机酸水溶液，且在弱酸条件下稳定；对于热不敏感，但在高温下毒性会增强，强酸强碱条件下其结构可被破坏[2]。
图 1 河豚毒素结构式
河豚毒素是一种高效的神经类毒素，由于能够特异性的阻断Na+离子通道，进而产生麻痹作用，因此低浓度的河豚毒素被认为是一种优良的神经类候选药物，一直受到科研人员尤其是新药研发人员的关注[3]。目前已有将河豚毒素作为止痛药[4-5]和成瘾戒断药[6]的相关探索和研究。由于河豚毒素在药学领域有着广阔前景，关于其药学应用的研究报道逐年增多，但大多集中在分析方法[7]、药理机制[8]或药物载体研究[9]，对其可成药性的相关研究报道较少。本文按照新药研发要求，建立高效液相反相离子对色谱法，对河豚毒素在不同溶剂中的溶解性和不同pH环境中的稳定性进行考察，为河豚毒素的处方前研究积累数据，为其进一步临床应用提供有力支撑。
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LC-2030C高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；AL-104电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；数显pH计（sartorius，德国）；紫外可见分光光度计（安捷伦科技（中国）有限公司）；循环水式真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平（赛多利斯，德国）；Arium@ mini 超纯水机（赛多利斯，德国）。
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河豚毒素原料药（中洋生物科技江苏有限公司，批号：20220089，含量88%）；河豚毒素对照品（泰州康特生物工程有限公司，批号：201206，含量≥99%）；磷酸、98%甲酸、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、庚烷磺酸钠、磷酸二氢铵、乙酸铵、盐酸、30% H2O2和冰醋酸均为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。
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色谱柱为Shim-pack GISI C18-AQ（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为5 mmol/L庚烷磺酸钠-25 mmol/L磷酸二氢铵，等度洗脱；进样量为10 μl；柱温：25 ℃；流速1 ml/min；检测波长为196 nm；检测时长为40 min。
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取TTX对照品适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的TTX对照品储备液。
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取TTX原料药适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的供试品储备液。
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按照《中国药典》（2020版）四部通则8004缓冲液配制方法，配制pH值分别为3.5、4.5、5.0、6.5、7.0、7.4、8.0的缓冲液[10]。称取研成细粉的TTX原料药各2 mg，分别置于4 ml不同pH值的缓冲液（25±2 ℃）中，30 min内每隔5 min强力振摇30 s，观察溶解情况，如无目视可见颗粒，视为完全溶解。如完全溶解则继续加入研成细粉的TTX原料药，同法操作直至饱和，取适量经滤膜滤过，作为溶解度试验测试溶液。
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取研成细粉的TTX原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，分别用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容，置于70 ℃下反应20 min。精密量取各反应溶液适量，冷却至室温，分别加入对应体积的0.1 mol/L氢氧化钠或0.1 mol/L盐酸进行中和并终止反应。取适量样品经滤膜过滤后作为强酸与强碱破坏试验测试溶液。
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取研成细粉的TTX原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，加入30% H2O2溶液溶解定容后，室温反应10 min。精密量取反应溶液适量，经滤膜过滤，作为氧化破坏试验测试溶液。
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取研成细粉的TTX各适量，精密称定，分别用PBS缓冲液（pH值=7.4）、0.1%甲酸溶液、0.1%柠檬酸溶液溶解，并稀释制成浓度为0.1 mg/ml的TTX溶液，然后分别置于4 ℃、25 ℃、37 ℃中储存，在第1、2、3、5、7、14、21、28 d各取适量经滤膜过滤，作为温度适应性测试溶液。
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分别将对照品储备液及供试品储备液用0.1%磷酸溶液稀释至0.1 mg/ml，作为对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项进行测试。如图2所示，TTX的保留时间为22.665 min。理论板数为14 501，供试品溶液中主峰与邻峰的分离度为6.4。结果表明，此色谱条件可以满足TTX相关测试要求。
图 2 TTX对照溶液（A）与供试品溶液（B）的典型色谱图
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取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液配制浓度为4、10、20、40、80 μg/ml的TTX对照品测试溶液，按“2.1”项进行测试。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=12 601.2X–2 263.69（r=0.999 9）。结果表明，TTX的浓度与峰面积在测试范围内呈良好线性关系。
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取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液分别稀释至10、20、40 μg/ml的溶液各3份，按“2.1”项进行测试，计算其含量的平均值为101.000%，RSD为0.60%，表明该方法准确度良好，满足测试要求。
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取供试品溶液，按“2.1”项重复测试6次，计算得到的RSD为0.17%，表明该方法重复性良好。室温分别放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后按“2.1”进行测试。计算得到的RSD为1.48%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
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由表1结果可看出，TTX几乎不溶于碱性水溶液，但溶解度随着pH值降低而逐渐增大，易溶于pH值为3.5的酸性水溶液。
表 1 TTX在不同pH值水溶液中的溶解度
pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0 $ \bar{\rm{x}} $（mg/ml） 264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05 SD（mg/ml） 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001 -
实验结果表明，强碱对TTX的破坏能力最强，在0.1mol/L氢氧化钠溶液中、70 ℃条件下反应20 min后，TTX被完全降解。强酸对TTX的破坏能力次之，TTX在70 ℃、0.1mol/L HCl溶液中反应20 min后的降解率为60.78%；氧化对TTX的破坏能力相对最弱，在30% H2O2溶液中反应20 min后的降解率为17.06%。
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不同介质、不同温度条件下TTX稳定性试验结果见图3。当溶剂为pH值=7.4的PBS溶液时，不同温度下TTX均表现出降解趋势，在25 ℃与37 ℃条件下保存28 d的TTX溶液降解率均超过50%，在37 ℃时PBS溶液中的TTX降解率更高达88.07±0.27%，提示在后续剂型研究中，需注意TTX在体外释放液中的稳定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%柠檬酸溶液为溶剂的TTX溶液则较为稳定，在25 ℃和37 ℃下保存28 d含量均未表现出显著性变化。
图 3 TTX在不同温度、不同介质中的稳定性（A. 4 ℃条件下TTX浓度变化趋势；B. 25 ℃条件下TTX浓度变化趋势；C. 37 ℃条件下TTX浓度变化趋势）
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TTX作为一种具有广泛应用前景的潜在镇痛药物，其在药理和作用机制方面的相关研究已有较多报道[11-13]，但对于其理化性质和成药性研究的报道极少。本研究建立了高效液相反相离子对色谱法，测定TTX在不同溶剂中的溶解性，并考察温度、溶剂pH值和氧化剂对其稳定性的影响。实验结果表明TTX在酸性条件下具有较高的溶解度，前期试验还表明TTX不溶于乙醇，二氯甲烷等有机溶剂。稳定性试验结果显示TTX在强碱溶液中较不稳定，实验条件下20 min即被强碱全部降解，而在酸性条件、氧化环境中较为稳定。不同温度稳定性试验结果同样显示，TTX在0.1%甲酸或柠檬酸溶液中4周内稳定性均良好；而在pH值=7.4 PBS中降解较为迅速，即使在4 ℃条件下，pH值=7.4 PBS中28 d的降解率仍然接近50%，37 ℃条件下28 d降解率接近90%。研究结果可为TTX处方设计及制备工艺提供实验依据，并提示研究者在开展TTX剂型研究和体外释放研究时应重点关注其稳定性和降解情况。
Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin
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摘要:
目的 考察河豚毒素（TTX）在不同溶剂中的溶解性及稳定性，以及温度和pH值对稳定性的影响。 方法 配制TTX不同介质的溶液，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其在不同温度、不同pH缓冲液中的浓度，分析计算其溶解度及稳定性。 结果 TTX在pH值为3.5时溶解度最大，随着pH值增加其溶解度逐渐降低。TTX在强碱条件下降解最为迅速，在70 ℃条件下、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中，20 min即完全降解。稳定性试验结果同样证明TTX在碱性条件下的稳定性最差，在37 ℃、pH值=7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，TTX浓度在1~10 h时开始持续降低，28天降解率为88.07±0.27%。 结论 TTX易溶于pH值=3.5的酸性水溶液，几乎不溶于碱性水溶液。其稳定性与温度、介质pH值密切相关，在酸性水溶液中较为稳定，在碱性条件下易降解，温度升高会加速其降解过程。 Abstract:Objective To investigate the solubility and stability of Tetrodotoxin (TTX) in different solvents, and the effect of temperature and pH on its stability. Method Solutions of TTX in different matrices were prepared. Their concentrations at different temperatures and pH buffers were determined by high performance liquid chromatography and their solubility and stability were analyzed and calculated. Result TTX was most soluble at pH 3.5 and its solubility decreased as the pH increased. TTX degraded most rapidly under strong alkali conditions, with complete degradation after 20 min of reaction at 0.1 mol/L sodium hydroxide and 70 ℃. The stability test results similarly demonstrated that TTX was least stable under alkaline conditions. In a PBS buffered solution at 37 ℃, pH 7.4, TTX concentration began to decrease consistently at 1~10h, with a degradation rate of 88.07±0.27% after 28 days. Conclusion TTX is readily soluble in acidic aqueous solutions at pH 3.5 and almost insoluble in alkaline aqueous solutions. Its stability is closely related to the temperature and pH of the medium. It is more stable in acidic aqueous solutions and easily degrades under alkaline conditions, and its degradation process could be accelerated by increasing temperature. -
Key words:
- Tetrodotoxin /
- HPLC /
- Stability /
- Solubility
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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表 1 TTX在不同pH值水溶液中的溶解度
pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0 $ \bar{\rm{x}} $ （mg/ml）264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05 SD（mg/ml） 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001 
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