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水飞蓟素（SM）是从菊科植物水飞蓟[Silybum marianum （L.） Gaertn.]的果实中提取的一种黄酮木脂素类混合物，主要成分为花旗松素（TF）、水飞蓟宁（SD）、水飞蓟亭（SC）、水飞蓟宾（SB）和异水飞蓟宾（ISB） [1-4]。现代药理学研究表明，水飞蓟素具有多种药理活性，除保肝护肝脏作用外[5]，其对肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默症（AD）也有一定的治疗效果[6-8]。然而，水飞蓟素在水中的溶解度低，导致其口服生物利用度达不到要求，极大地限制了其临床应用。
磷脂复合物（PC）是指药物和磷脂分子在非质子溶剂中反应，通过电荷迁移而形成稳定的化合物（或络合物），形成复合物后能显著改变母体药物的理化性质，进而提高药物的生物利用度[9]。当前，对天然药物磷脂复合物的研究已有较多报道，如根皮素磷脂复合物[10]、鼠李素磷脂复合物[11]、鞣花酸磷脂复合物[12]。然而，对SM-PC的制备工艺研究较少 [13]，且针对其体外溶出行为研究主要以水飞蓟宾为指标进行评价，难以反映水飞蓟素原料药（SM-API）中多成分的情况。基于此，笔者拟采用星点设计-效应面法[10]优化SM-PC的制备工艺，并对其5种主要活性成分的体外溶出行为进行考察，以期解决水飞蓟素溶解性差、生物利用度低的问题，为后续水飞蓟素的进一步开发应用提供依据。
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DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥机（上海一恒科技有限公司）；Agilent1200高效液相色谱系统（DAD检测器，美国Agilent公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；RCZ-6BZ型药物溶出仪（上海黄海药检仪器有限公司）；KQ-800KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴器（上海精密试验设备有限公司）。
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SM-API（辽宁盘锦华成制药厂，批号：120508，含量48 %）；水飞蓟素胶囊（德国马博士制药厂，批号：B1101616，规格140 mg）；TF、SC、SD、SB和ISB对照品（上海同田生物技术股份有限公司，纯度约为98.5%，批号：120115）；大豆卵磷脂（江苏曼氏生物科技有限公司，批号：130201，其中，磷脂酰胆碱含量约为70 %）；蛋黄卵磷脂（德国Lipoid®公司，批号：120920，其中，磷脂酰胆碱含量约为70 %）；十二烷基硫酸钠（湖南尔康制药有限公司）；甲醇为色谱纯，乙醇、丙酮、氯仿、磷酸、氢氧化钠等为分析纯，水为蒸馏水。
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取SM-API 5.0 g，加入丙酮溶液500 ml，充分搅拌使其溶解，加入大豆磷脂10.0 g，在40 ℃水浴条件下持续搅拌1 h，反应液减压蒸干，加入500 ml氯仿溶解，将溶液过滤，取续滤液减压浓缩至约50 ml，将浓缩液置于45 ℃的条件下真空干燥24 h，铲下得淡黄色磷脂复合物，粉碎过80目筛避光保存。根据SM-API不溶于氯仿，而SM-PC和PC均易溶解于氯仿，将制备的SM-PC溶解于氯仿当中，溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤，收集沉淀，干燥称重，计算复合率，公式如下：
Y =（W−W1）/ W×100 %
其中，Y为复合率，W为SM-API的质量，W1为产生沉淀的质量。
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Agilent1200高效液相色谱系统（DAD检测器，美国Agilent公司），色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm ×250 mm ，5 μm），流速为1 ml/min，柱温40 ℃，检测波长为288 nm，进样量为20 μl，以甲醇（A）-0.05 %磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～4 min，35% A；4～16 min，35% A→40 % A; 16～23 min，40% A→45% A; 23～40 min，45% A→50% A）[2]。
在上述色谱条件下，水飞蓟素5种成分的分离度均>1.5，结果见图1。
图 1 SM-PC溶出度测定HPLC图
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分别取TF、SC、SD、SB和ISB对照品适量，用分析天平精密称定，置于100 ml量瓶中，加甲醇轻微振摇使溶解，并稀释至刻度，得浓度为75.0、80.2、74.5、168.0、93.2 μg/ml的混合对照品溶液，保存备用。
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取SM-PC适量（含水飞蓟素约20 mg），精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇轻微振摇使溶解，加65 %甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
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精密量取对照品混合液0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4、4.0 ml于10 ml量瓶中，加65 %甲醇稀释至刻度，配制成TF浓度为1.5、3.0、6.0、12.0、15.0、18.0、30.0 μg/ml；SC浓度为1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、19.2、32.1 μg/ml；SD浓度为1.5、3.0、6.0、11.9、14.9、17.9、29.8 μg/ml；SB浓度为3.4、6.7、13.4、26.9、33.6、40.3、67.2 μg/ml；ISB浓度为1.9、3.7、7.5、14.9、18.6、22.4、37.3 μg/ml的混合对照品溶液，取混合对照品溶液20 μl进样，计算峰面积。以进样浓度X（μg/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，经线性回归得回归方程，结果见表1。
表 1 水飞蓟素5种有效成分的线性方程
有效成分 线性方程 相关系数r 线性范围（μg/ml） TF Y=66.273X+3.921 0.9999 1.5～30.0 SC Y=42.952X−7.056 0.9999 1.6～32.1 SD Y=37.610 X+6.686 0.9998 1.5～29.8 SB Y=37.627X+6.684 0.9998 3.4～84.0 ISB Y=48.892X−4.681 0.9998 1.9～37.3 取SM-PC适量，按“2.2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得TF、SC、SD、SB和ISB峰面积RSD分别为0.86%、1.12%、0.65%、2.13%、1.87%，表明该方法重复性良好。 取同一份供试品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h 在 “2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得TF、SC、SD、SB和ISB峰面积RSD为 2.21%、0.98%、1.57%、2.76%、2.12%，表明溶液在 24 h 内稳定性良好。取“2.2.2”项下混合对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定 6 次，测得TF、SC、SD、SB和ISB峰面积RSD分别为 0. 88%、0. 62%、0. 78%、1.05%、0.93%，表明仪器精密度良好。回收率试验结果表明，TF、SC、SD、SB和ISB的平均加样回收率分别为100.55%、99.64%、100.51%、100.13%、104.63%，RSD分别为0.95%、0.68%、1.15%、1.22%、1.05%。
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固体药物载体比1∶2，反应温度40 ℃，反应时间1 h，药物浓度为10 mg/ml，考察反应溶剂为无水乙醇、丙酮、甲醇时药物的复合率，结果见表2。
表 2 溶剂对复合率的影响（n=3）
溶剂 介电常数 复合率（%） 无水乙醇 26.8 71.5±2.3 丙酮 19.5 75.6±2.0 甲醇 33.2 65.8±0.8 以丙酮为反应溶剂的复合率高于无水乙醇和甲醇，这可能是由于乙醇和甲醇均为质子性溶剂，不利于磷脂复合物的形成。
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固定反应溶剂为丙酮，药物载体比1∶2、反应温度40 ℃，药物浓度为10 mg/ml，考察反应时间为0.5、1、2 、3 h时药物的复合率，结果见表3。
表 3 反应时间对复合率的影响（n=3）
反应时间（t/h） 复合率（%） 0.5 46.1±1.0 1 76.4±1.4 2 85.1±1.2 3 86.6±0.5 4 87.3±1.2 试验表明，随着反应时间的延长，则复合率也增大，当反应时间大于2 h后，复合率受时间影响较小。
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固定反应时间为2 h，反应溶剂为丙酮，药物载体比1∶2，药物浓度为10 mg/ml，考察磷脂复合物制备温度在30、40、50和60 ℃时的复合率，结果见表4。
表 4 反应温度对复合率的影响（n=3）
温度（T/ ℃） 复合率（%） 30 68.2±0.8 40 86.7±2.2 50 90.8±0.8 60 92.4±1.3 试验表明，随着反应温度的升高，复合率也增大，在60 ℃时，复合率达到最高，考虑到磷脂在60 ℃以上时容易变性，因此未做更高温度的考察。
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固定反应温度为60 ℃，反应溶剂为丙酮，反应时间为2 h，药物载体比1∶2，考察药物浓度为5、10、20、30 mg/ml的复合率，结果见表5。
表 5 药物浓度对复合率的影响（n=3）
药物浓度（ρB/mg·ml−1） 复合率（%） 5 92.5±1.2 10 91.5±2.2 20 88.7±0.8 30 75.8±1.3 从上表可见，药物浓度对药物的复合率有一定的影响，随着药物浓度的增加，水飞蓟素磷脂复合物的复合率降低。
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固定药物浓度为10 mg/ml，反应温度为60 ℃，反应溶剂为丙酮，反应时间为2 h，考察水飞蓟素原料药与大豆磷脂的比例分别为1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5时药物的复合率，结果见表6。
表 6 反应物投料比例对复合率的影响（n=3）
药物载体比（g/g） 复合率（%） 外观 1∶0.5 57.1±1.2 松脆 1∶1 83.0±2.2 松脆 1∶1.5 87.5±0.7 松脆 1∶2 92.2±1.2 松脆 1∶2.5 93.5±1.8 黏稠 由上表可以看出，随着磷脂用量的升高，复合率也增大，原因可能为磷脂的量增大，对水飞蓟素的增溶作用也增大，溶液分子间碰撞形成复合物的几率增大，但试验中我们发现，磷脂比例为1∶2.5时形成的复合物较黏稠，不易干燥，故选用药物载体比为1∶2。
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固定反应温度为60 ℃，反应溶剂为丙酮，反应时间为2 h，药物浓度为10 mg/ml，水飞蓟素与磷脂的比例为1:2，考察载体采用蛋黄卵磷脂和大豆卵磷时对复合率的影响，结果见表7。
表 7 磷脂种类对复合率的影响（n=3）
磷脂种类 磷磷脂酰胆碱含量（%） 复合率（%） 外观 大豆卵磷脂 70 91.8±0.3 松脆 蛋黄卵磷脂 70 92.2±0.2 黏稠 由上表可以看出，采用大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂作为载体时，其复合率并没有显著区别，但采用蛋黄卵磷脂制备得到的SM-PC较为黏稠，不易干燥，因此选用大豆卵磷脂作为复合载体。
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在单因素考察的基础上，选择对复合率影响较大的几个因素为自变量，即脂药比（X1）、反应浓度（X2）、反应温度（X3），以复合率（Y1）为因变量，采用三因素、五水平的星点试验设计，各因素的水平代码和具体的试验操作值见表8，具体的试验安排见表9。
表 8 各因素水平代码及试验操作值
因素 −1.682 −1 0 +1 +1.682 脂药比 1 1.20 1.5 1.80 2 药物浓度（ρB/mg·ml−1） 5 8.04 12.5 16.96 20 反应温度（T/ ℃） 40 44.05 50.0 55.95 60 表 9 试验设计及测定结果（n=3）
序号 X1 X2 X3 Y1 1 1.20 8.04 44.05 75.4±3.0 2 1.80 8.04 44.05 85.2±1.9 3 1.20 16.96 44.05 76.9±1.9 4 1.80 16.96 44.05 81.4±1.2 5 1.20 8.04 55.95 81.8±1.8 6 1.80 8.04 55.95 93.5±1.9 7 1.20 16.96 55.95 80.9±1.9 8 1.80 16.96 55.95 83.7±2.3 9 1.00 12.50 50.00 79.6±2.2 10 2.00 12.50 50.00 86.7±1.9 11 1.50 5.00 50.00 86.8±1.8 12 1.50 20.00 50.00 80.7±1.9 13 1.50 12.50 40.00 78.6±1.8 14 1.50 12.50 60.00 91.9±2.2 15 1.50 12.50 50.00 84.2±1.8 16 1.50 12.50 50.00 84.1±1.8 17 1.50 12.50 50.00 84.4±2.5 18 1.50 12.50 50.00 85.7±3.1 19 1.50 12.50 50.00 85.3±0.8 20 1.50 12.50 50.00 84.5±1.2 -
根据试验结果，应用SPSS 16.0统计软件，以评价指标（复合率）分别对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合，对二项式方程中的各系数进行t检验，删除P>0.2的项，以达到简化模型的目的。所得多元线性回归方程如下：Y=46.5846+10.034 2X1−0.381 9X2+0.534 1X3（r=0.8921），二项式方程如下：Y=75.3603+2.925 1X1+0.530 3X2−0.823 9X3−0.396 0X1X2+0.712 5 X1X3+7.039 1X2X3−7.180 2X12−0.0212 X22+2.845 9X32 （r=0.965 0）。
由以上方程可知，二项式方程拟合的回归系数r高于多元线性回归，故选择二项式拟合模型进行预测。
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由“2.4.2”项下所得二项式方程，应用Design Expert 8.0软件绘制指标（复合率）与影响显著的两个自变量的三维效应面和二维等高图（另一个自变量设为中心点值），结果见图2、图3和图4。
图 2 复合率对脂药比和药物浓度的三维效应面和二维等高线
图 3 复合率对脂药比和反应温度的三维效应面和二维等高线
图 4 复合率对药物浓度和反应温度的三维效应面和二维等高线
由图2～4可以看出，在一定范围内，水飞蓟素与大豆卵磷脂的复合率随磷脂与水飞蓟素比例的增大而增高，随反应浓度的增高而降低，随反应温度的增高而增高。每个效应面都有其较优区域，以复合率为指标，软件给出最佳工艺是水飞蓟素与大豆卵磷脂比例为1∶1.8，反应温度55.95 ℃，反应物的浓度为8.04 mg/ml。综合考虑技术的可行性和经济的合理性，确定制备SM-PC的最优工艺条件为水飞蓟素与大豆卵磷脂的比例为1∶1.8，反应温度56 ℃，反应物的浓度8.0 mg/ml。
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将上述优选的最佳工艺制备3批SM-PC进行验证性试验，测定水飞蓟素与磷脂的复合率，将所得结果与二项式拟合方程的预测值相比较，结果见表10。
表 10 最佳工艺条件验证试验（%）
批次 预测值 实测值 偏差 1 93.70 94.85 1.23 2 93.70 94.12 1.52 3 93.70 96.48 2.97 平均数 93.70 95.15 1.55 由表10可知，复合率的预测值和实测值的偏差小于3 %，证明试验所建立的数学模型预测性较好。
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采用桨法测定SM-API、SM-PC、市售水飞蓟素胶囊在蒸馏水（pH5.6）和pH7.5的磷酸盐缓冲液（含0.5 % SDS）中的体外溶出度，桨转速为100 r/min，水浴温度为37 ℃。每次取含水飞蓟素150 mg的磷脂复合物粉末装入胶囊，分别于10、20、30、40、50、60 min 取样，每次10 ml，并及时补充等温度等体积的溶出介质，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液进样分析[14]。试验结果见图5和图6。SM-API、SM-PC和水飞蓟素胶囊在pH5.6的蒸馏水中溶出均不完全，SM-API各组分的溶出显示出较大差异，其中，水溶性成分TF溶出最高，达60%，而SB溶出不到20%。在pH7.5的磷酸盐缓冲液（含0.5 %SDS）中，SM-API的溶出度有了一定的提高，但仍溶出不完全，SM-PC各组分在60 min的溶出接近90%，主要成分SB的溶出行为与市售水飞蓟素胶囊相似，远高于原料药。
图 5 在蒸馏水中的溶出曲线
图 6 在pH7.5的磷酸盐缓冲液（含0.5 %SDS）中的溶出曲线
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在制备磷脂复合物的过程中，真空干燥必须控制一定的温度条件，温度太低，则磷脂复合物无法充分干燥，制备的磷脂复合物较黏稠，不利于后续制剂的制备；而温度太高，发现所制备的磷脂复合物颜色加深，这可能是由于大豆卵磷脂在高温条件下变性所致。结合预实验，本研究最终确定制备SM-PC的真空干燥温度为45 ℃。
通常选择溶出度试验的溶剂应该接近生理条件，对于难溶性药物而言, 可根据药物的理化性质（如溶解度数据）添加适量的表面活性剂。文献报道[15]，将水飞蓟素制备成磷脂复合物后，药物的脂溶性提升较大，生物利用度在人体提高了2~ 3倍，而水溶性提升相对不明显，其在水、人工肠液和人工胃液中难以完全溶出。参考市售水飞蓟素磷脂复合物制剂的溶出条件，采用溶出介质为pH7.5的磷酸盐缓冲液（含0.5 %的SDS），桨转数为100 r/min[16]。
虽然采用磷脂复合物技术有效提高了水飞蓟素的体外溶出度，但由于磷脂复合物本身具有较强的黏性，分散性较差，因而也会限制其溶出速率和溶出度提高的幅度。从本文的研究结果也可以看出，仅采用磷脂复合物技术对水飞蓟素的体外溶出度提高有限，后续可与固体分散体、微球、微丸以及自微乳给药系统等制剂新技术联合应用来进一步改善溶出行为。需要注意的是，磷脂复合物联合其它制剂新技术虽能提高其自身的分散性，加快药物的溶出，但由于采用不同制剂新技术所制备药物的微粒载药方式、释药方式和速率、粒径大小等不同，其溶出速率、跨膜方式、作用部位也可能存在差异，也会影响药物的疗效[17]。因此，实际研究过程中，应该基于药物自身的性质以及循证药学的证据去探索合适的制剂新技术。
Preparation and in vitro dissolution behaviors evaluation of silymarin phospholipid complex
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摘要:
目的 将水飞蓟素和磷脂复合以研制水飞蓟素磷脂复合物（silymarin phospholipids complex，SM-PC），并考察其基本理化性质。 方法 采用溶剂挥发法制备SM-PC。通过前期的单因素考察，选择脂药比、药物浓度以及反应温度作为星点设计-效应面法的考察因素，以SM-PC的复合率为衡量指标筛选最佳研制工艺，并测定SM-PC的体外溶出度。 结果 SM-PC的最优制备条件如下：以丙酮为反应溶剂，水飞蓟素与大豆卵磷脂的比例为1∶1.8，反应温度56 ℃，反应物的浓度8.0 mg/ml。在此条件下制备3批样品得到SM-PC的复合率为（95.15±1.55）%，偏差<3%。体外溶出试验表明，SM-PC各组分在60 min的溶出接近90 %，主要成分水飞蓟宾的溶出行为与市售水飞蓟素胶囊相似，远高于原料药。 结论 采用星点设计-效应面法成功制备SM-PC，明显提高了溶出度，为后续制剂的研究奠定基础。 Abstract:Objective To prepare silymarin phospholipids complex（SM-PC） and investigate its physicochemical properties. Methods On the basis of single-factor tests, the drug-lipid ratio, drug concentration and reaction temperature were selected as the factors of the central composite design and response surface methodology in the preparation of SM-PC by solvent volatilization, and the best process was optimized with the compound rate as the index. And its in vitro dissolution was measured. Results The optimum preparation technology of SM-PC was as follows: acetone was used as compound solvent, the concentration of SM was 8.0 mg/ml, the mass ratio of SM to phospholipid was 1∶1.8, the reaction temperature was 56 ℃ and the recombination rate was（95.15±1.55）% with deviation of less than 3%. The in vitro dissolution test showed that the dissolution of SM-PC was close to 90% in 60 min. The dissolution behavior of main component of silybin was similar to that of silymarin capsules（Legalon ®）, which was higher than SM-API. Conclusion SM-PC was successfully prepared by central composite design response surface method, which significantly improved the dissolution and laid a foundation for the study of subsequent preparations. -
慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
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表 1 水飞蓟素5种有效成分的线性方程
有效成分 线性方程 相关系数r 线性范围（μg/ml） TF Y=66.273X+3.921 0.9999 1.5～30.0 SC Y=42.952X−7.056 0.9999 1.6～32.1 SD Y=37.610 X+6.686 0.9998 1.5～29.8 SB Y=37.627X+6.684 0.9998 3.4～84.0 ISB Y=48.892X−4.681 0.9998 1.9～37.3 
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表 5 药物浓度对复合率的影响（n=3）
药物浓度（ρB/mg·ml−1） 复合率（%） 5 92.5±1.2 10 91.5±2.2 20 88.7±0.8 30 75.8±1.3
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表 6 反应物投料比例对复合率的影响（n=3）
药物载体比（g/g） 复合率（%） 外观 1∶0.5 57.1±1.2 松脆 1∶1 83.0±2.2 松脆 1∶1.5 87.5±0.7 松脆 1∶2 92.2±1.2 松脆 1∶2.5 93.5±1.8 黏稠
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表 8 各因素水平代码及试验操作值
因素 −1.682 −1 0 +1 +1.682 脂药比 1 1.20 1.5 1.80 2 药物浓度（ρB/mg·ml−1） 5 8.04 12.5 16.96 20 反应温度（T/ ℃） 40 44.05 50.0 55.95 60
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表 9 试验设计及测定结果（n=3）
序号 X1 X2 X3 Y1 1 1.20 8.04 44.05 75.4±3.0 2 1.80 8.04 44.05 85.2±1.9 3 1.20 16.96 44.05 76.9±1.9 4 1.80 16.96 44.05 81.4±1.2 5 1.20 8.04 55.95 81.8±1.8 6 1.80 8.04 55.95 93.5±1.9 7 1.20 16.96 55.95 80.9±1.9 8 1.80 16.96 55.95 83.7±2.3 9 1.00 12.50 50.00 79.6±2.2 10 2.00 12.50 50.00 86.7±1.9 11 1.50 5.00 50.00 86.8±1.8 12 1.50 20.00 50.00 80.7±1.9 13 1.50 12.50 40.00 78.6±1.8 14 1.50 12.50 60.00 91.9±2.2 15 1.50 12.50 50.00 84.2±1.8 16 1.50 12.50 50.00 84.1±1.8 17 1.50 12.50 50.00 84.4±2.5 18 1.50 12.50 50.00 85.7±3.1 19 1.50 12.50 50.00 85.3±0.8 20 1.50 12.50 50.00 84.5±1.2
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表 10 最佳工艺条件验证试验（%）
批次 预测值 实测值 偏差 1 93.70 94.85 1.23 2 93.70 94.12 1.52 3 93.70 96.48 2.97 平均数 93.70 95.15 1.55
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