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环境条件是维持机体正常生理功能的重要因素，长期生活于低海拔地区的人，当快速进入海拔 3 000 m以上高原时，通常会出现头痛、全身乏力等急性高原反应[1]。高原低压性缺氧能够诱导活性氧自由基（ROS）的快速积累，导致机体氧化应激水平升高，从而造成机体损伤。心脏是机体最重要的器官之一，对高原急性低压缺氧条件十分敏感[2]。当机体长期处于缺氧状态下，心率、血压发生改变，心脏负荷增加，心脏能量供应不足，最终导致机体损伤。高原低压性缺氧严重地限制了初到高海拔地区人们的生活和工作，甚至危及生命。
雪莲是我国高山地区常用的名贵中草药，近年来，国内对雪莲药理作用的研究主要集中于提高机体免疫力、抗氧化及抗辐射等作用[3]，而关于抗高原缺氧作用的研究较少。本课题组前期对20多种青藏高原植物进行筛选，发现大苞雪莲具有显著的抗缺氧活性，并通过最佳提取工艺研究[4]、质量标准研究[5]，研制出用于高原缺氧防治的医院制剂——雪莲黄酮胶囊。在本课题组前期研究中确定了最佳给药剂量为500 mg/kg[6]。本实验使用低压低氧动物实验舱模拟海拔8 000 m高原缺氧环境，通过检测急性高原缺氧小鼠心脏的组织学、缺氧相关生化指标和基因蛋白的变化情况，研究雪莲黄酮胶囊对于缺氧小鼠心脏的保护作用及机制。
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SPF级雄性Balb/c小鼠64只，体重18～22 g，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2019-001，伦理审批编号：2021KYLL170。饲养于联勤保障部队第九四〇医院动物实验科。
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乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司, 59-66-5）；雪莲黄酮胶囊（中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院制剂）； 乳酸（LD）、乳酸脱氢酶（LDH）、总抗氧化能力（T-AOC）、BCA蛋白试剂盒（南京建成生物工程研究所，A003-1-2）；RNAiso试剂、TakaRa Prime ScriptTM试剂盒、PCR扩增试剂盒（大连宝生物公司，引物委托宝生物工程公司合成）；缺氧诱导因子1α（HIF-1α）抗体、血管内皮生长因子（VEGF）抗体、超氧化物歧化酶（SOD）抗体（Abcom，英国）；抗体(BD，美国)；Western BrightTM ECL（Advansta，美国）。
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Delta 320电子pH计（梅特勒托利多公司）；IEC-Micromax高速离心机（美国ThermoElectron公司）；Tissuelyser 快速研磨仪（上海净信科技公司）；BP210S电子天平（赛多利斯有限公司）；HP-8453紫外分光光度计（美国惠普公司）；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱（中航贵州风雷航空军械有限责任公司）。
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取SPF级健康雄性Balb/c小鼠64只，饲养适应3 d后随机分为正常组（N）、模型组（M）、乙酰唑胺阳性对照组（ACZ，250 mg/kg）、雪莲黄酮胶囊组（XLJN，500 mg/kg）4组，每组16只，单次灌胃给药，除正常组小鼠外，其余各组小鼠给药50 min后放入低压低氧动物实验舱，模拟8 000 m海拔缺氧环境。以10 m/s的速度升至8 000 m海拔，维持缺氧9 h，完成减压缺氧后以20 m/s的速度降至海拔1 450 m。小鼠完成减压后立即脱臼处死，取心肌组织，−80 ℃冰箱冻存备用。
实验过程严格按照“3R”原则进行，实验废弃物及动物尸体等按照《医疗废物管理条例》要求进行无害化处理，严格遵守国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》，尽可能减少对动物的伤害。
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每组随机取3只小鼠心脏组织标本，置于甲醛中固定。标本送至联勤保障部队第九四〇医院病理科进行石蜡包埋、组织切片、染色以及观察。
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每组随机取3只小鼠心脏标本，切成1 mm×1 mm×3 mm的小块，置于2.5%戊二醛中固定，之后对标本进行浸透包埋以及电镜观察。
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取各组剩余10只小鼠的心肌组织50 mg，加入9倍质量的0 ℃生理盐水，匀浆并离心，取上清，−20 ℃冷冻，用于LD、LDH、T-AOC指标测定。以上操作均按试剂盒说明书要求进行。
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取各组剩余10只小鼠心肌组织标本30 mg，向低压低氧处理的小鼠心肌组织中加入1 ml RNAiso Plus试剂进行研磨，加入200 μl氯仿，混匀后离心，弃上清液，取75%乙醇溶液纯化总RNA沉淀，再次离心弃上清液，将所得RNA于−80 ℃保存。紫外分光光度计检测总RNA的浓度及纯度，并使用1 %甲醛变性琼脂糖电泳检测其完整性。将提取的总RNA进行逆转录，具体步骤参考PrimeScriptTM RT试剂盒说明书。实时PCR检测：步骤参考Applied Biosystems公司7300仪器说明。反应条件如下：两步法PCR扩增，95 ℃预变性30 s；95 ℃反应5 s，60 ℃退火31 s，40个循环。引物及序列见表1。
表 1 Real Time RT- PCR引物序列
基因引物 序列 HIF-1α Forward5′-GGACGATGAACATCAAGTCAGCA-3′
Reverse 5′-AGGAATGGGTTCACAAATCAGCA-3′VEGF Forward5′-ACATTGGCTCACTTCCAGAAACAC-3′
Reverse 5′-TGGTTGGAACCGGCATCTTTA-3′SOD Forward5′-GGCCTGAAATACCAAGTCAGGAA-3′
Reverse 5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′CAT Forward5′-CCAGTGCGCGTAGATGTGAAAC-3′
Reverse5′-GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTG-3GAPDH Forward5′-AGCATTCCATCATTGGCCGTA-3′
Reverse5′-TACTGCGCAATCCCAATCACTC-3′ -
取各组剩余10只小鼠心肌组织标本50 mg，加入高效裂解液，匀浆，于冰上裂解30 min，低温离心后吸取部分上清液，用于BCA法对总蛋白浓度进行定量。向剩余上清液中加入3倍量上样缓冲液，95 ℃加热10 min，取等量蛋白样品上样，采用SDS-PAGE进行分离，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜，将PVDF膜浸泡于5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入小鼠抗β-actin单抗抗体（1∶1 000）、HIF-1α兔多克隆抗体（1∶500）、VEGF兔多克隆抗体（1∶1 000）、SOD兔多克隆抗体（1∶1 500），4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗。加入二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液漂洗。配制ECL发光液，按照A液和B液1∶1进行配制，加入发光液，使用ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度值分析。
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采用统计软件SPSS 13. 0处理,实验数据以（
$ \bar x \pm s $ ）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。实时PCR结果采用△△Ct法处理数据。 -
结果如图1所示，N组心肌组织结构正常，细胞形态结构完好；M组心肌细胞肿胀，心肌纤维增粗，排列不整齐，胞核增大淡染；ACZ组与XLJN组的肌纤维肿胀、排列不齐现象，其程度有所减轻；心肌收缩舒张功能损伤减轻。
图 1 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织显微结构的影响（200×）
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如图2所示，N组心肌组织肌纤维排列整齐且紧密。肌节分明，肌线清晰，线粒体形状规则，膜光滑，内嵴清晰可见。M组肌丝溶解、破裂，肌丝排列疏松，基膜下肿胀、变形。线粒体肿胀，产生空泡，双层膜结构溶解。ACZ组肌丝排列疏松，线粒体基本正常，肌丝连接处部分溶解，连接不整齐。XLJN组，肌纤维与线粒体形态良好，远优于模型组。综上所述，雪莲黄酮胶囊对心肌的超显微结构具有明显的保护作用。
图 2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织显微结构的影响
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如表2所示，缺氧后，M组LD含量升高（P<0.01），T-AOC活性显著降低（P<0.01），LDH活性无显著变化（P>0.05）。与M组相比，ACZ组与XLJN组的小鼠心肌组织LD活性降低（P<0.01），LDH活性无明显变化（P>0.05），T-AOC活性升高（P<0.01）。
表 2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 例数（n） 剂量（mg/kg） LD含量（mmol/g蛋白） LDH活性（U/g蛋白） T-AOC活性（U/mg蛋白） N组 10 — 0.405±0.050 1919.8±143.1 1.58±0.23 M组 10 — 0.579±0.032## 1871.0±95.9 1.11±0.10## ACZ组 10 300 0.513±0.059* 1925.9±141.4 1.30±0.21** XLJN组 10 500 0.524±0.057** 1916.8±129.1 1.34±0.19** *P<0.05，**P<0.01，与M组比较；#P<0.05，##P<0.01，与N组比较。 -
如表3所示，与N组相比，M组小鼠心肌组织HIF-1α和VEGF的mRNA水平显著提高，SOD、过氧化氢酶（CAT）mRNA水平显著降低（P<0.01）；与M组相比，ACZ组、XLJN组心肌组织HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平均有所下降（P<0.05），SOD、CAT 的mRNA表达水平显著提高（P<0.01）。
表 3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 例数（n） 剂量 （mg/kg） HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N组 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M组 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07# ACZ组 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16** XLJN组 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**# *P<0.05，**P<0.01，与M组比较；#P<0.05，##P<0.01，与N组比较。 -
如图3、图4所示，与N组相比，M组小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF蛋白表达显著升高（P<0.01），SOD蛋白表达显著降低（P<0.01）。与M组相比，XLJN组和ACZ小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF蛋白表达显著降低（P<0.01），SOD蛋白表达显著升高（P<0.01）。
图 3 雪莲黄酮胶囊对缺氧小鼠心肌缺氧相关蛋白表达电泳图
图 4 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌缺氧相关蛋白表达量的比较
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低压低氧条件能够诱导ROS的快速积累，导致机体氧化应激水平升高，心脏中的氧气浓度低于临界值，造成能量衰竭，同时伴随组织ATP水平下降，引发细胞内离子稳态失衡及不可逆的膜结构损伤[7]。部分研究表明，抗氧化剂具有一定的抗缺氧作用，例如，葛根素、去甲汉黄芩素、槟榔多酚等抗氧化剂能够通过清除ROS缓解缺氧损伤[8-11]。本课题组前期研究发现，雪莲中黄酮成分具有优异的抗氧化作用[12]，为此，我们对雪莲黄酮胶囊的高原缺氧诱导小鼠心肌损伤的保护作用进行考察。结果发现，与M组相比，XLJN组小鼠肌纤维形态明显改善，线粒体膜完好，说明雪莲黄酮胶囊对于模拟高原缺氧小鼠心肌的形态结构具有较好的保护作用。
在缺氧环境下，组织呼吸链受抑制，ATP酶活性下降，有氧呼吸产生ATP的量减少。为弥补能量缺失，糖酵解作用加强，并成为组织供能的主要途径[13]。LDH可催化丙酮酸与LD间的相互转化，低氧条件下LDH促进厌氧糖酵解，产生的LD反过来又会提高其活性[14]，这就解释了本研究中M组的LDH没有升高的现象。有研究发现，组织中LD含量的增加直接反映机体的缺氧程度。根据本文研究结果，雪莲黄酮胶囊可显著降低缺氧心肌的LD水平、提高T-AOC活性，由此推断，雪莲黄酮胶囊能够提高乳酸的代谢转化，促进细胞无氧酵解。
缺氧诱导因子-l（HIF-1）是近年来发现对缺氧环境高度特异性的转录因子，是专一调节氧稳态的关键介质[15]。HIF-1可能作为活性氧受体，感受环境中的低氧程度，同时调控具有效应器作用的低氧反应基因的转录[16]。表皮生长因子（VEGF）作为HIF-1的下游基因，可调节毛细血管通透性和血管生成。本实验通过RT-PCR检测缺氧相关基因，发现缺氧可造成心肌组织HIF-1、VEGF的mRNA表达明显升高，而雪莲黄酮胶囊可使HIF-1α、VEGF的mRNA表达降低，由此推断，雪莲黄酮胶囊通过降低小鼠心脏对于缺氧的敏感性，延缓组织水肿来抵抗缺氧造成的损伤，该结论与Xu等[17]研究一致。SOD与CAT是机体清除自由基的主要酶，是抗缺氧能力的重要指标。缺氧可造成模型组SOD、CATmRNA表达与蛋白含量降低，雪莲黄酮胶囊给药后，缺氧小鼠的SOD、CAT的mRNA表达、蛋白含量显著提高，证明其能够通过增加缺氧小鼠心肌SOD与CAT的含量，提高心肌的抗氧化能力。
综上所述，雪莲黄酮胶囊能显著减轻高原缺氧对小鼠心肌组织显微结构和超显微结构的损伤，说明雪莲黄酮胶囊对低压性缺氧造成的组织损伤具有良好的保护作用。此外，雪莲黄酮胶囊还可显著降低缺氧小鼠心肌组织LD累积水平，因此改善心肌组织能量代谢，这也可能是其发挥保护功能的原因之一。进一步的分子实验结果表明，雪莲黄酮胶囊抗高原缺氧的机制可能与影响HIF-1α、VEGFmRNA与蛋白的表达、调节小鼠组织内部氧平衡、血管通透性、提高SOD、CAT等抗氧化酶含量有关。下一步，我们将对雪莲黄酮胶囊的药动学进行研究，为将其开发成为抗缺氧药物提供了一定的理论和实验依据。
Protective effect of Saussurea involucrata flavone capsule on myocardial injury induced by hypoxia at high altitude in mice
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摘要:
目的 研究雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧环境小鼠心肌组织的保护作用及其机制。 方法 将64只Balb/c小鼠随机分为正常对照组、缺氧模型组、阳性对照组和雪莲黄酮胶囊组，以500 mg/kg剂量进行单次灌胃给药后，在模拟海拔8 000 m环境停留9 h，对心肌组织进行显微与超微结构观察，并检测缺氧相关指标的变化。通过RT-PCR法检测缺氧相关基因转录水平的变化，并通过蛋白质印迹法检测缺氧相关基因蛋白表达的变化，研究雪莲黄酮胶囊的作用机制。 结果 雪莲黄酮胶囊可明显缓解模拟高原缺氧环境对小鼠心肌的病理学损伤，提高心肌组织T-AOC活力，降低LD累积，还可以降低心肌组织HIF-1α、VEGF mRNA的表达水平，提高SOD、CAT mRNA及蛋白的表达水平。 结论 雪莲黄酮胶囊具有良好的抗高原缺氧作用，可保护心肌组织结构和功能，调节能量代谢和提高抗氧化能力。其机制可能与提高高原缺氧小鼠抗氧化能力、调节能量代谢以及影响HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA的蛋白表达有关。 Abstract:Objective To study the protective effect and mechanism of Saussurea involucrata flavone capsule on the myocardial tissue of mice in simulated plateau hypoxia environment. Methods 64 Balb/c mice were randomly divided into normal control group, hypoxia model group, positive control group and Xuelian flavonoid capsule group. Myocardial tissue was observed microscopically and ultra-structurally, and the changes of hypoxia-related indexes were detected. The changes in the transcription levels of hypoxia-related genes were detected by RT-PCR, and the changes in the protein expressions of hypoxia-related genes were detected by Western blotting to study the mechanism of action of Xuelian flavone capsules. Results Saussurea involucrata flavone capsule had significantly alleviated the pathological damage to the myocardium of mice caused by simulated altitude hypoxia, increased the activity of T-AOC in myocardial tissue, reduced the accumulation of LD, and also reduced the expression levels of HIF-1α and VEGF mRNA in myocardial tissue, increased the SOD, CAT mRNA and protein expression levels. Conclusion Saussurea involucrata flavone capsule have good anti-altitude hypoxia effect, which could protect myocardial tissue structure and function, regulate energy metabolism, and improve antioxidant capacity. The mechanism might be related to improving the antioxidant capacity, regulating energy metabolism, and affecting the protein expression of HIF-1α, VEGF, SOD and CAT mRNA in high altitude hypoxic mice. -
Key words:
- Saussurea involucrata /
- plateau /
- anti-hypoxia /
- hypoxia-inducible factor 1α /
- epidermal growth factor
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骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）属于脊柱骨折，多发于中老年人，为临床最为常见的骨质疏松性骨折之一，严重影响患者脊柱功能、日常活动能力等，且发病率、致残、致死率均较高。现阶段，临床多以经皮椎体成形术（PVP）对OVCF患者进行治疗，临床疗效确切，可迅速缓解骨折引起的疼痛，促进椎体形态和功能恢复，但其对患者骨质疏松程度及骨质疏松引起的疼痛改善效果欠佳，故临床倡导PVP术后予以适当的干预以改善手术效果[1]。西医临床常用药物为碳酸钙D3，但有研究[2]指出其对部分患者的干预效果较差，临床多与中医药物干预、锻炼等相结合对PVP术后OVCF患者进行治疗。中医学认为，OVCF属“骨痿”范畴，主要病机为肾精不足、气滞血瘀所致骨质枯槁，肝肾阴虚证为其主要证型之一，应治以滋补肝肾，填精壮骨[3]。中药膏方含阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参等，根据临床中药机制可见其有补肾填精、益气健脾、通络止痛等功效，但其对PVP术后OVCF患者的疗效及机制尚未完全明确[4]。故设立本研究，以120例于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象进行前瞻性随机对照研究，旨在进一步观察中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF患者的疗效，为其临床应用提供参考。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
前瞻性选取120例2016年1月至2017年9月于我院行PVP治疗的OVCF患者为研究对象，患者均知情同意，按随机数字表法将其分为观察组（60例），对照组（60例）。本研究经我院医学研究伦理研究委员会审核通过。观察组：男35例，女25例；年龄50~80岁，平均（66.27±2.15）岁；体质量指数（BMI）19~25 kg/m2，平均（22.35±0.41）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.51±0.22）年；骨折病程1~3周，平均（1.55±0.12）周；骨压缩程度[5]：轻度16例，中度30例，重度14例。对照组：男33例，女27例；年龄51~78岁，平均（66.18±2.20）岁；BMI 19~25 kg/m2，平均（22.41±0.42）kg/m2；骨质疏松病程1~5年，平均（2.48±0.20）年；骨折病程1~3周，平均（1.52±0.13）周；骨压缩程度：轻度15例，中度29例，重度16例。两组性别、年龄、BMI、骨质疏松病程、骨折病程、压缩程度等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 纳入标准
①中医诊断符合《中医药防治原发性骨质疏松症专家共识（2015）》[6]中肝肾阴虚证相关辩证标准，西医诊断符合《骨质疏松性骨折诊疗指南》[7]中OVCF相关诊断标准，并经临床检查确诊者；②均为胸腰椎骨折，且是首次因OVCF就诊者；③无PVP相关禁忌，手术成功，且术后生命体征平稳者；④近3个月内未行特殊的抗骨质疏松治疗，同期未接受其他治疗者；⑤无脊髓损伤或神经根症状者等。
1.3 排除标准
①椎体爆裂性骨折、陈旧性胸腰椎压缩性骨折或肿瘤、感染等所致病理骨折者；②脊柱结核、骨肿瘤者；③继发性骨质疏松者；④精神障碍、认知能力或沟通能力障碍者；⑤伴严重器官障碍、急性腰扭伤、骨瘤骨转移、强直型脊柱炎、四肢新鲜骨折、软组织损伤者等。
1.4 方法
对照组予以碳酸钙D3咀嚼片[重庆海默尼制药有限公司，国药准字H20205039，碳酸钙1.25 g（相当于钙0.50 g）、维生素D3 200 IU]口服，每次1片，每日2次。同时指导患者每天摄入适量豆类、瘦肉、牛奶、鱼类等优质蛋白（1.20~1.40 g/kg），进行适当的日光浴及行走锻炼（30 min以上）。
观察组在对照组基础上予以中药膏方（将阿胶、枸杞子、鸡血藤、党参各200 g，鹿角胶、茯苓、桑寄生、熟地黄、牛膝、丹参、威灵仙各150 g，龟板胶、白术、骨碎补、神曲各100 g，炙甘草60 g制成膏剂后即得）口服，开水调服，每次10 g，每日2次。同时指导患者进行八段锦锻炼，所用方法为改良八段锦第八式：躯体直立，两足平行分开（与肩同宽），两手臂自然下垂，手指稍并拢，掌指向前，两膝关节屈曲135°~170°；两眼平视前方，微张口，平稳呼吸，全身放松2 min，紧接着保持原来体位尽可能屈膝下蹲，然后在双上臂伸直情况下慢慢上举到水平，慢慢随之站起（保持躯体直立下），至身体直立时顺势将两脚跟向上提起（期间慢慢匀速吸气到最满并憋气），停顿10~15 s；两脚跟下落着地，双手臂随之顺势下落，回到膝关节屈曲位（期间慢慢匀速呼气）；每次7个循环，每日3次。两组均治疗6个月，并随访3年。
1.5 观察指标
1.5.1 疗效
根据《中药新药临床研究指导原则》[8]可将两组治疗6个月后的疗效分为临床治愈（腰部功能完全恢复，临床症状、体征完全消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），显效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征基本消失，X射线可见压缩椎体恢复正常状态），有效（腰部功能没有完全恢复，临床症状、体征减轻，X射线可见大量骨痂形成，但未完全愈合），无效（腰部功能有改善，临床症状、体征有减轻，但X射线可见几乎无骨痂形成）。临床治愈率=临床治愈例数/总例数；显效率=显效例数/总例数；有效率=有效例数/总例数；无效率=无效例数/总例数。总有效率=（临床治愈+显效+有效）例数/总例数。
1.5.2 不同时点腰背疼痛情况
以疼痛视觉模拟评分法（VAS，0~10分）[9]评估两组治疗1、3、6个月的腰背疼痛情况，得分越高提示患者腰背疼痛程度越严重。
1.5.3 骨密度（BMD）、椎体后凸角度（Cobb角）及椎体前壁高度（AVBH）变化情况
以BMD测定仪（QDR 4500C，美国Hologic公司）检测两组治疗前、治疗6个月后的腰椎、股骨颈BMD；以X射线检查两组治疗前、治疗6个月后的Cobb角、AVBH。
1.5.4 骨代谢指标
抽取两组治疗前、治疗6个月后的晨起空腹静脉血3 ml，离心机3 000 r/min离心15 min，分离血清，以全自动电化学发光分析仪（罗氏Cobas e601，北京东方迈润医疗器械有限公司）检测血清I型原胶原降解产物（β-Cross I）、N端中段骨钙素（N-MID Ost）、甲状旁腺素（PTH）水平。
1.5.5 PVP术后推体再骨折发生率
记录两组随访时间及随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率，同1例患者发生多次再骨折仅算1例。
1.6 统计学方法
数据采用SPSS 21.0（IBM公司，美国）统计学软件进行分析，计量资料采用（
$\bar x $ ±s）表示，组内比较使用配对t检验，治疗前、治疗6个月后的比较使用独立样本t检验，多组间比较采用F检验；计数资料采用[n(%)]表示，使用χ2检验进行比较。2. 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
治疗6个月后，观察组临床治愈率为73.33%，高于对照组的53.33%（P<0.05）；而两组显效率、有效率、无效率、总有效率比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表 1 两组患者临床疗效比较[n(%)]组别 例数 临床治愈率 显效率 有效率 无效率 总有效率 观察组 60 44(73.33) 13(21.67) 3(5.00) 0(0.00) 60(100.00) 对照组 60 32(53.33) 20(33.33) 8(13.33) 0(0.00) 60(100.00) χ2 5.167 2.048 2.502 P <0.05 >0.05 >0.05 2.2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较
治疗前，两组患者VAS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗3、6个月后两组VAS评分均降低，且观察组低于对照组（P<0.05）；与治疗3个月后比较，治疗6个月后，两组VAS评分均降低（P<0.05，表2）。
表 2 两组患者不同时点腰背疼痛情况比较（$\bar x $ ±s，分）组别 例数 治疗前 治疗3个月后 治疗6个月后 观察组 60 7.55±0.37 2.47±0.33* 1.14±0.23** 对照组 60 7.52±0.35 3.51±0.51* 2.36±0.42** t 0.456 13.262 19.735 P >0.05 <0.05 <0.05 *P<0.05，与治疗前比较；**P<0.05，与治疗3个月后比较 2.3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较
治疗前，两组患者BMD、Cobb角及AVBH比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后两组腰椎、股骨颈BMD及AVBH均升高，且观察组高于对照组（P<0.05）；而两组Cobb角均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表3）。
表 3 两组患者BMD、Cobb角及AVBH变化情况比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 腰椎BMD(g/cm3) 股骨颈BMD(g/cm3) Cobb角(°) AVBH(%) 治疗前 观察组 60 0.70±0.07 0.68±0.06 23.09±2.51 53.93±7.26 对照组 60 0.69±0.08 0.67±0.07 23.11±2.49 54.04±7.44 t 0.729 0.840 0.044 0.082 治疗6个月后 观察组 60 0.93±0.08* 0.93±0.07* 6.47±1.98* 96.56±9.41* 对照组 60 0.84±0.11* 0.85±0.08* 8.91±2.26* 85.73±8.04* t 5.125 5.829 6.290 6.778 *P<0.05，与治疗前比较 2.4 两组患者骨代谢指标比较
治疗前，两组患者血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较，治疗6个月后，两组血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平均降低，且观察组低于对照组（P<0.05，表4）。
表 4 两组患者骨代谢指标比较（$\bar x $ ±s）时间 组别 例数 β-Cross I(ng/ml) N-MID Ost(ng/ml) PTH(pg/ml) 治疗前 观察组 60 0.79±0.13 42.10±9.53 62.28±9.42 对照组 60 0.78±0.14 41.98±9.52 62.25±9.39 t 0.405 0.069 0.017 治疗6个月后 观察组 60 0.67±0.10* 36.15±5.46* 52.47±4.02* 对照组 60 0.73±0.12* 38.93±6.14* 57.45±5.72* t 2.975 2.621 5.518 *P<0.05，与治疗前比较 2.5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较
两组患者随访时间、随访1年内、1~3年内PVP术后推体再骨折发生率比较，均无统计学意义（P>0.05）；随访3年内，观察组PVP术后推体再骨折发生率为3.33%，低于对照组的20.00%（P<0.05，表5）。
表 5 两组患者PVP术后推体再骨折发生率比较组别 例数 随访1年内发生率
[n(%)]随访1~3年内 合计
[n(%)]随访时间
($\bar x $±s, 年)发生率
[n(%)]观察组 60 2(3.33) 1.94±0.43 0(0.00) 2(3.33) 对照组 60 7(11.67) 1.86±0.72 5(8.33) 12(20.00) t/χ2 3.003 0.739 3.339 8.086 P >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 3. 讨论
骨质疏松为临床常见的慢性骨代谢异常疾病，可见骨钙含量减少、骨量下降，极易出现骨折，OVCF为其临床常见类型。OVCF发病后可致患者出现椎体高度下降、疼痛、功能障碍等，未得到及时有效的治疗，可致残、致死，且其再发骨折风险高[10]。现阶段，微创PVP治疗为大多保守治疗无效的OVCF患者的主要选择，可恢复椎体力学强度、稳定骨折，但骨转换率及骨量流失未能纠正，且手术造成的内外骨膜血管损伤及制动可能会加重骨质疏松而影响患者预后[11]。故PVP术后予以适当的干预治疗至关重要，临床常用药物为碳酸钙D3，其可促进骨质形成而缓解骨质疏松程度，但其多偏重于抑制骨吸收，减轻骨质流失。近年来，越来越多的研究[12-13]发现，中医药治疗PVP术后OVCF有一定成效，其既能抑制流失，又能促进成骨形成，在抗骨质疏松、促进骨折愈合、防治再骨折发生等方面优势明显，现已备受临床医生青睐，但关于何种药物更佳尚无统一定论。
中医认为OVCF属“骨枯”、“骨萎”、“痹证”等范畴，肾中精气是骨生长发育的根本，脾胃为后天之本，气血生化之源，故其发病机制主要为肾精亏虚、脾精不足所致骨骼失养；外伤导致筋脉损伤、气血运行不畅，加之患者湿热寒邪侵袭、肾脾虚亏，容易加重气滞血瘀症状，使得骨骼和筋骨失去濡养，导致骨关节萎缩、活动不利等而诱发OVCF，故治疗应补肾壮骨、活血行气、舒经通络、消肿止痛[14]。中药膏方中的阿胶、枸杞子、鹿角胶、龟板胶可补血益气、填精益髓，其中，龟鹿二仙胶中鹿角胶、龟板胶为主方，与党参、枸杞子配伍可增强益气养阴、补肾填精益髓之功；鸡血藤可活血补血、舒筋活络、疏风止痛；党参可补中益气、生血行血；茯苓可利水消肿、益气健脾；桑寄生、熟地黄、骨碎补、牛膝可补肾壮骨；丹参、威灵仙、神曲可健脾和胃、消食调中，进而减轻膏方的厚腻；炙甘草可补脾和胃，益气复脉，同时调和诸药；全方可发挥补肾填精、益气健脾、通络止痛之功效[15-16]。同时八段锦作为一种由八节不同动作组成的一套医疗、康复体操，其通过人体垂直方向的应力刺激成骨、下蹲平衡锻炼、膀胱经的经气疏通等可对OVCF患者产生舒筋活络的良好功效，进而有助于促进患者腰部功能恢复，提高患者临床疗效。本研究显示，治疗6个月后，观察组临床治愈率高于对照组，且治疗3、6个月后VAS评分低于对照组，进一步说明中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可有效缓解患者腰背疼痛，疗效显著。
OVCF的发生发展与骨代谢及转换密切相关，其中，β-Cross I为骨吸收的重要指标，N-MID Ost为骨形成、骨转换的重要指标，可直接反映成骨细胞的活性与数量变化，PTH则可加速骨代谢活跃，促进骨吸收，血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平升高提示患者骨转换成程度严重，可促进病情进展，不利于PVP术后腰部功能的恢复[17]。本研究显示，治疗6个月后，观察组腰椎、股骨颈BMD及AVBH高于对照组，Cobb角、血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH低于对照组，且随访3年内PVP术后推体再骨折发生率低于对照组，提示中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可调节患者机体骨代谢，提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，降低PVP术后推体再骨折发生率。PVP术后OVCF患者骨折愈合的本质为骨重建，该过程涉及局部微环境的构建、成骨细胞的活化、大量血管的生成等，而现代药理学研究[18-20]指出，中药膏方中的骨碎补含双氢黄酮苷、黄酮等成分，可提高BMD，刺激成骨细胞增殖分化，防止骨吸收、促进骨形成，发挥抗骨质疏松、促进骨折愈合等作用，进而促进腰部功能的恢复；牛膝含牛膝竹节参皂苷，可发挥较好的抗炎、止痛、改善微循环作用，有助于促进局部微环境的构建而促进患者骨折愈合，进而降低再骨折发生率。同时联合八段锦进行治疗，可有效疏通OVCF患者经络，促进机体气血运行通畅，进而可增强中药膏方促进患者腰部功能恢复的作用，降低患者PVP术后推体再骨折发生率。而对照组由于仅进行常规对症治疗，而未对患者采取中药膏方联合八段锦等治疗，故患者复发的风险明显增加。
综上，中药膏方联合八段锦治疗PVP术后OVCF可降低其血清β-Cross I、N-MID Ost、PTH水平，调节机体骨代谢，有助于提高腰椎、股骨颈BMD及AVBH，降低Cobb角，促进腰部功能的恢复，进而缓解患者腰背疼痛，降低PVP术后推体再骨折发生率，疗效显著。
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表 1 Real Time RT- PCR引物序列
基因引物 序列 HIF-1α Forward5′-GGACGATGAACATCAAGTCAGCA-3′
Reverse 5′-AGGAATGGGTTCACAAATCAGCA-3′VEGF Forward5′-ACATTGGCTCACTTCCAGAAACAC-3′
Reverse 5′-TGGTTGGAACCGGCATCTTTA-3′SOD Forward5′-GGCCTGAAATACCAAGTCAGGAA-3′
Reverse 5′-CCATGGCTTAGAATCACACACACA-3′CAT Forward5′-CCAGTGCGCGTAGATGTGAAAC-3′
Reverse5′-GGTGGACGTCAGTGAAATTCTTG-3GAPDH Forward5′-AGCATTCCATCATTGGCCGTA-3′
Reverse5′-TACTGCGCAATCCCAATCACTC-3′
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表 2 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织生化指标的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 例数（n） 剂量（mg/kg） LD含量（mmol/g蛋白） LDH活性（U/g蛋白） T-AOC活性（U/mg蛋白） N组 10 — 0.405±0.050 1919.8±143.1 1.58±0.23 M组 10 — 0.579±0.032## 1871.0±95.9 1.11±0.10## ACZ组 10 300 0.513±0.059* 1925.9±141.4 1.30±0.21** XLJN组 10 500 0.524±0.057** 1916.8±129.1 1.34±0.19** *P<0.05，**P<0.01，与M组比较；#P<0.05，##P<0.01，与N组比较。
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表 3 雪莲黄酮胶囊对模拟高原缺氧小鼠心肌组织HIF-1α、VEGF、mRNA的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 例数（n） 剂量 （mg/kg） HIF-1α mRNA VEGF mRNA SOD mRNA CAT mRNA N组 10 — 0.88±0.10 0.99±0.46 1.42±0.41 1.70±0.19 M组 10 — 6.21±0.79## 9.77±1.44## 0.41±0.16# 0.15±0.07# ACZ组 10 300 1.15±0.27** 2.72±0.54* 1.37±0.19** 0.63±0.16** XLJN组 10 500 1.34±0.36* 2.73±0.99* 1.28±0.38** 0.44±0.05**# *P<0.05，**P<0.01，与M组比较；#P<0.05，##P<0.01，与N组比较。
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