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在高原低氧环境下，会出现消化系统不适症状，如上腹疼痛、消化不良、腹泻等，症状严重时可导致胃肠出血（GIB）甚至器官器质性损伤[1]，对进入高原的人群身体有严重的危害。因此讨论进入高原人群胃肠道损伤的原因及保护十分必要。
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胃肠运动为食物消化吸收提供条件，胃肠道内部的胃酸、胆汁、消化酶的减少导致胃肠道运动减缓[2]，引起胃肠道功能受损。急进高原后，胃肠运动减慢主要与胃肠道激素的分泌及Cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal, ICC）有关。
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胃肠激素对胃肠运动有一定的调节作用，主要包括胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、生长抑素等[3]。胃泌素主要由胃及十二指肠黏膜开放型G细胞分泌，具有促进胃肠蠕动的作用，分泌过多则会导致胃肠黏膜损伤，影响胃肠道功能。胃动素由Mo细胞分泌，分布于小肠，能够促进和影响胃肠运动及胃肠道对水及电解质的运输，胃动素升高，肠蠕动加快，可能会导致腹痛、腹泻等症。高原低氧环境下胃肠运动紊乱表现为激素分泌紊乱和胃肠运动收缩的频率的改变。李红[4]对急进高原个体胃肠激素进行检测，包括GAS、P物质（SP）及MTL，发现MTL、SP显著降低，GAS显著升高，说明急进高原后机体胃肠运动受到抑制，上述研究表明，急进高原后腹痛可能是GAS分泌增加引起。高原低氧环境会引起个体胃肠动力激素改变，进而导致胃肠运动缓慢，胃肠道分泌化学物质减少，化学屏障被破坏，从而引起急性胃肠黏膜损伤。
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ICC是胃肠道慢波的启动细胞，在消化道电活动的传播及介导神经信号转导中发挥重要作用， ICC细胞受损，会导致慢波传导异常，影响胃肠道运动[5]。ICC特异性表达酪氨酸激酶受体 (C-kit) , 干细胞因子 (SCF) 是C-kit的天然配体，SCF/C-kit信号通路关系着ICC的生长、发育及增殖的过程[6]。在急进一定海拔高原后，小肠推进率与 C-kit mRNA表达呈正相关[7]，C-kit mRNA、SCF mRNA的表达和小肠推进率均降低[8]，表明急进高原导致胃肠道运动功能紊乱与SCF/C-kit机制有关。高原低氧条件下，SCF以及C-kit mRNA及蛋白表达水平均下降，说明高原低氧环境抑制SCF/C-kit信号通路，同时SCF 与C-kit结合减少，影响ICC的生长、发育及繁殖，进而影响小肠推进功能，SCF/C-kit信号通路图如图1所示。
图 1 高原低氧条件对SCF / C-kit通路的影响
缝隙连接又称为通讯连接，是细胞间跨膜信号传导的重要方式之一，缝隙连接蛋白43 (Cx43) 作为重要的连接蛋白之一，大量存在于胃肠道壁中, 发挥信号传导作用。急进高原后大鼠小肠ICC细胞间缝隙连接受损，而且Cx43的表达出现异常[9]。说明急进高原后胃肠道运动功能受到影响与ICC以及缝隙连接蛋白有关，ICC细胞与消化道平滑肌间物质及电信号传递障碍，导致胃肠道运动功能障碍。
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胃肠黏膜屏障对维持机体内环境稳态有着至关重要的作用，高原低氧环境会对机体胃黏膜屏障产生不同程度的破坏，低氧刺激肥大细胞释放组织胺和胃窦G细胞释放胃泌素，使血清胃泌素浓度显著升高。升高的胃泌素促进H+分泌，导致组织胺浓度上升，毛细血管扩张，通透性增加[10]，引起血浆渗入胃腔, 使血液黏稠度增加, 同时缺氧导致红细胞增多，加剧了血液黏稠程度，导致血栓以及出血的形成，即胃黏膜层细胞因缺血而糜烂、溃疡、出血等。在这个过程中，氧自由基、炎症因子、自噬和细胞因子发挥重要作用。
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在高原低氧刺激下，胃肠黏膜产生大量的氧自由基(ROS)。产生的自由基数量过多会导致胃肠黏膜的损伤。低氧暴露可使大鼠小肠绒毛长度和数量均显著减少, 氧自由基生成增多,导致小肠黏膜的结构和功能发生损伤[11]。ROS上调 HIF-1α的水平，ROS介导的 HIF-1α信号转导可能是高原条件下胃功能受损的相关机制[12]。
缺氧后机体炎症也会导致胃肠黏膜损伤，Wang等人[13]发现将大鼠置于低压氧舱后，其血清中 Zonulin、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平升高，CD4+/CD8+ T 细胞比值和小肠 NK 细胞数量增加，小肠 NK 细胞的 mRNA 和蛋白表达水平升高。肠道 TLR4、NF-κB、HIF-1α 和 iNOS mRNA 和蛋白表达水平均有所升高。急进高原后肠组织炎症因子有所上升，原因可能是在机体缺氧情况下，为了保证脑以及心脏等重要器官的血流供应，机体对血流进行重新分配，胃肠道在受到低张性以及循环性双重缺氧下，黏膜产生明显的损伤，引起机体炎症，炎症因子表达上升又反作用于胃肠道，使胃肠道损伤进一步加重。
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自噬是由溶酶体介导的吞噬自身衰老或损伤的细胞器、蛋白质以及细胞内病原体的过程，从而实现细胞的自我更新[14]，其能增强肠黏膜屏障，减轻肠道炎症，在维持肠黏膜稳态中发挥重要作用[15]。大鼠急进高原后使用自噬抑制剂会使肠组织的病理性损伤明显加重，无抑制剂时损伤减轻[16]，说明自噬可能是缺氧肠上皮细胞损伤过程中的保护因素之一。高原急性暴露导致肠上皮细胞的时间依赖性损伤，观察急性高原暴露肠功能衰竭大鼠自噬体的表达，发现Beclin1和LC3B蛋白的表达明显升高[17]，表明自噬可能有助于清除肠上皮组织中受损的细胞和蛋白，在修复受损细胞中发挥着重要作用。
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三叶因子(TFF)家族是一种参与胃肠道黏膜愈合的重要因子，该家族由TFF1、TFF2和TFF3多肽组成[18]，TFFs有影响胃黏膜黏液的黏度和弹性及促进黏膜创面愈合[19]的作用，高原缺氧环境条件下肠上皮组织中TFF mRNA表达量明显升高[20]，说明高原缺氧环境导致胃肠黏膜损伤后，机体会启动损伤修复的相关机制，TFF家族在此过程中会发挥一定的保护作用。
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人肠道内寄生着10万亿个细菌，其参与了人体内许多生理过程，包括消化和代谢功能、上皮屏障的调节、发育和免疫系统的调节等，是影响人胃肠道功能的重要因素。急进高原除了会对胃、肠黏膜有损伤作用，对人体内肠道菌群的数量和组成也有影响。肠道菌群是人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌，乳酸杆菌等，能够合成机体所必需的维生素以及利用蛋白质残渣合成氨基酸，在缺氧情况下，随着时间的延长，肠黏膜受到严重破坏，肠道菌群发生转移，破坏肠系膜淋巴结的结构，加剧氧化应激，进而影响肠道自身免疫功能的完整性[21]。
肠道菌群包含了极为多样的微生物群落，每个个体约有500种细菌，其中拟杆菌门(Bacteroidetes)最为丰富和多样，而高原环境会导致拟杆菌门组成显著增加[22]，Han等人运用基因敲除法敲除Hif-1β，发现拟杆菌门在Hif-1β缺失小鼠中比高原空白组小鼠中的数量更多[23]，这表明拟杆菌门不仅对氧含量敏感，而且可能能够感知氧相关基因的变化。与拟杆菌门相同，肠杆菌门（Enterobacteriaceae）与γ变形菌门（Gammaproteobacteria）有相同的变化。缺氧后，肠杆菌门丰度增加，肠杆菌门的过度生长促使细菌易位，从而导致内毒素的扩散[24]，这表明缺氧会引起机体内肠道菌群紊乱，进而引起胃肠道功能被破坏。
短链脂肪酸（SCFAs）作为结肠细胞的能量来源，具有调节葡萄糖代谢、调控肝脏甘油三酯和胆固醇的生物合成、抑制病原体生长及减轻肠道炎症等作用。其中丁酸在肠上皮细胞增殖，分化，功能方面有重要作用。丁酸盐能通过营养功能及保护细胞内信号传导作用保护猪结肠上皮免受缺氧诱导的损伤，同时降低炎症因子的表达[25]。肠道菌群能通过调节嗜中性粒细胞的迁移和功能影响T细胞分化，有利于调节性T细胞（Tregs）的分化和扩增，而调节性T细胞是介导免疫耐受的关键组成部分[26]。在T淋巴细胞中 SCFAs刺激G蛋白偶联受体（GPR41），抑制炎症细胞因子如白介素10（IL-10）和干扰素（IFN）的生成等[27]。在体内和体外，丁酸盐通过抑制组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）的活性，改变CYP1A1的表达及活性，减少了吲哚代谢物的清除，并增加了吲哚代谢物进入固有层的途径，在固有层中，它们通过刺激IL-C3和Th17细胞分泌IL-22和IL-17来增强肠道免疫力。这些细胞因子能增加黏蛋白和抗菌肽的产生，从而改善肠道屏障功能。丁酸盐对肠道保护作用如图2。
图 2 高原低氧条件肠道菌群改变的影响
高原低氧环境会导致肠道菌群的组成和比例发生改变，例如肠杆菌门的增加会导致机体内毒素扩散，影响肠屏障功能以及导致肠道炎症。厚壁菌门减少会导致SCFAs生成减少，低温低氧环境会导致肠道菌群产生的SCFAs减少[28]，丁酸盐产生量降低，致丁酸盐对肠道保护作用降低，进而影响肠道功能以及完整性，说明高原低氧条件会通过肠道菌群的改变破环肠道屏障功能以及导致肠道损伤，同时降低SCFAs对肠道的保护作用，影响肠功能。
高原低氧环境可造成急性胃黏膜损伤甚至急性上消化道大出血等严重情况。目前对于急进高原病的研究较多，但急进高原导致的胃肠道损伤具体机制尚不明确，因此，研究急进高原个体胃肠损伤对防治应激损伤、加快疾病恢复具有重要的意义。
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中药复方擅于从整体出发，主张辨证论治，标本兼治，治疗多种疾病成效显著。急进高原导致胃肠运动减慢，除了使用常用的促胃动力药物治疗以外，使用中药复方等也能达到促进胃肠道运动的作用，如表1所示。
表 1 保护胃肠道功能的药物及相关机制
改善胃肠道功能的
药物类型复方名（药物名称） 作用效果及机理 改善胃肠道运动
功能的药物丹皮-蒲公英配伍[31] 提升小肠推进率，降低胃残留率，改善胃肠动力障碍。 大承气汤改良方[32] 促进MTL释放，改善肠梗阻小鼠的胃肠道运动功能，减轻炎症反应，调节肠道菌群。 胃理气方[33] 升高C-kit、SCF的mRNA及蛋白的表达水平，上调SCF/C-kit信号通路相关蛋白表达。 白术内酯I（Atractylenolide-1）[34] 激活SCF/C-kit信号通路，调节氧化应激反应，抑制Cajal间质细胞的凋亡，改善胃运动功能。 阿奇霉素[35] 激动胃动素受体，诱发大幅度的胃推进型收缩，且药物相互作用及副作用少。 普鲁卡必利[36] 高选择性 5-羟色胺4 (5-HT4) 受体激动剂，与受体结合后，抑制环状平滑肌松弛和胆碱能传递，增强乙酰胆碱的释放，促进胃肠蠕动和黏液分泌。 改善胃肠道黏膜
屏障功能的药物肠黏膜抗氧化活性肽[37] 清除自由基，提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）活性，保护肠黏膜。 香连丸[38] 促进DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的自噬作用，抑制炎症反应，保护肠上皮屏障。 阿菠萝素[39] 调节自噬途径，抑制肠上皮细胞凋亡，改善肠上皮屏障及屏障稳态。 微囊化阿霉素（NLC-DOX）[40] 改善绒毛高度和隐窝深度，降低炎症因子表达，保持肠道通透性，增加紧密连接蛋白跨膜蛋白(ZO-1)和胞浆附着蛋白(Occludin)的表达。 Emu Oil Combined with Lyprinol™[41] 小肠中部的隐窝深度标准化，降低了肠 髓过氧化物酶（MPO）水平，减轻肠道炎症，保护肠黏膜。 Dissotis rotundifolia[42] 减少出血、水肿和白细胞浸润以及提升谷胱甘肽（GSH）水平，降低MDA 水平，增强过氧化氢酶 (CAT) 和SOD 酶水平，保护胃黏膜。 Rosmarinic Acid[43] 降低溃疡指数、减少胃液分泌量和降低酸度，通过抗炎和抗凋亡机制保护胃黏膜。 维持肠道菌群稳定
的药物多酚（绿茶多酚、姜黄素、白藜芦醇和槲皮素）[44] 促进有益细菌种的产生和生长，对抗胃肠道损伤。 益生菌[45] 防止胃肠道应激反应和肠道菌群失调的发生，减轻胃肠道反应的症状。 粪便菌群移植[46] 调节肠道菌群的组成与稳定及SCFAs的生成。 rhein[47] 调节肠道微生物群，间接改变肠道中的嘌呤代谢，从而缓解肠道炎症，保护肠道。 -
急进高原后，导致胃肠道黏膜的损伤，可以给予平原常用黏膜保护药，例如米索前列醇、硫糖铝、枸橼酸铋钾等。同时也应使用降低氧自由基、提升SOD活性的药物。自噬是维持抗微生物防御，上皮屏障完整性和黏膜免疫的重要作用机制[29]，许多自噬调节剂正被研究作为治疗肠道炎症的潜在药物。如表1所示。
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急进高原后导致肠道菌群发生改变，影响SCFAs对肠道的保护作用，因此调节肠道菌群种类，进而调节SCFAs的生成，能促进宿主整体的健康状态，具体药物如表1所示。益生菌是一类可对机体产生有益作用的微生物，具有改善胃肠道内微生物平衡、胃肠道内激素释放以及细胞因子水平的作用，植入胃肠道益生菌能通过抑制致病菌达到治疗胃肠道疾病、保护胃肠道的目的，因此急进高原人群可以通过益生菌制剂达到改善胃肠道损伤的作用，除益生菌外，使用针刺及服用中医药制剂等均被证明有一定调节肠道菌群、保护胃肠道的作用，可用于肠道菌群失调导致的胃肠道损伤保护。除此之外，将菌群从健康供体的粪便转移至接受患者的肠道，即粪菌移植，也能够重编肠道微生物群，该方法被认为是在胃肠道的炎症性疾病中使肠道菌群正常化的有效方法，在治疗或预防腹泻等胃肠道疾病[30]有发展前景，但当前此方法并未用于高原致胃肠道损伤，未来可能成为一个新的治疗手段。
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除以上保护方法外，同时应该注重饮食[48]，高原喜食生冷食品者胃肠道损伤程度更大，表明急进高原后应减少食用生冷食品，减轻胃肠道损伤。同时运动会增加缺氧程度，进而增加胃肠道黏膜损伤程度，因此应注意休息，减少运动。急进高原后会引起炎症因子上调，应合并使用抗炎药物，减轻炎症因子对胃肠道的进一步损伤。
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急进高原导致的胃肠道损伤如不及时治疗，会引发严重的胃出血甚至器质性损伤，对合适的治疗药物选择问题以及对高原低氧导致的胃肠功能改变的机制问题等进行深入探讨十分必要，这对我们深入了解高原低氧导致胃肠功能改变的根本原因有重要意义，也对保护急进高原人群胃肠道损伤具有重要的研究意义。此外, 利用中药复方改善胃肠道运动已有很多研究，但中药复方制备成适宜推广的剂型需要进一步探讨。相信随着对高原低氧导致的胃肠功能改变的研究和探讨的深入，必将为高原消化系统疾病的预防和治疗提供更有效的治疗手段。
Progress on factors affecting gastrointestinal function and drug protection in high altitude hypoxia environment
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摘要: 由于高原环境具有低压、低氧和寒冷等因素，急进高原人群易患消化系统疾病，如上腹疼痛、食欲减退及恶心呕吐等胃肠道功能障碍，严重影响了急进高原人群的身体健康及高原作业能力。急进高原引起的胃肠道功能障碍主要体现在胃肠道运动功能障碍、黏膜屏障功能受损及肠道菌群失调3个方面。目前胃肠道功能障碍发病机制仍不十分明确，针对性预防和治疗的药物较少。笔者对近年来胃肠道激素、氧自由基与炎症因子和肠道菌群等影响因素及药物保护作用等方面的研究做出归纳总结，以期为防治急进高原引起的胃肠道应急反应提供治疗方案和理论依据。Abstract: Due to factors such as low pressure, low oxygen and cold in the plateau environment, people who enter the plateau rapidly are susceptible to digestive system diseases, such as upper abdominal pain, loss of appetite, nausea and vomiting and other gastrointestinal dysfunction, which seriously affect the health and work ability of people who enter the plateau rapidly. The gastrointestinal dysfunction caused by the rapid advance to the plateau is mainly reflected in three aspects: gastrointestinal motility dysfunction, impaired mucosal barrier function, and intestinal flora imbalance. At present, the pathogenesis of gastrointestinal dysfunction is still not very clear, and there are fewer drugs for targeted prevention and treatment. Gastrointestinal hormones, oxygen free radicals, inflammatory factors, intestinal flora and other factors, as well as the protective effects of related drugs were reviewed in this paper to provide treatment options and theoretical basis for the prevention and treatment of the gastrointestinal emergency response caused by entering the plateau.
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慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
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表 1 保护胃肠道功能的药物及相关机制
改善胃肠道功能的
药物类型复方名（药物名称） 作用效果及机理 改善胃肠道运动
功能的药物丹皮-蒲公英配伍[31] 提升小肠推进率，降低胃残留率，改善胃肠动力障碍。 大承气汤改良方[32] 促进MTL释放，改善肠梗阻小鼠的胃肠道运动功能，减轻炎症反应，调节肠道菌群。 胃理气方[33] 升高C-kit、SCF的mRNA及蛋白的表达水平，上调SCF/C-kit信号通路相关蛋白表达。 白术内酯I（Atractylenolide-1）[34] 激活SCF/C-kit信号通路，调节氧化应激反应，抑制Cajal间质细胞的凋亡，改善胃运动功能。 阿奇霉素[35] 激动胃动素受体，诱发大幅度的胃推进型收缩，且药物相互作用及副作用少。 普鲁卡必利[36] 高选择性 5-羟色胺4 (5-HT4) 受体激动剂，与受体结合后，抑制环状平滑肌松弛和胆碱能传递，增强乙酰胆碱的释放，促进胃肠蠕动和黏液分泌。 改善胃肠道黏膜
屏障功能的药物肠黏膜抗氧化活性肽[37] 清除自由基，提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）活性，保护肠黏膜。 香连丸[38] 促进DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的自噬作用，抑制炎症反应，保护肠上皮屏障。 阿菠萝素[39] 调节自噬途径，抑制肠上皮细胞凋亡，改善肠上皮屏障及屏障稳态。 微囊化阿霉素（NLC-DOX）[40] 改善绒毛高度和隐窝深度，降低炎症因子表达，保持肠道通透性，增加紧密连接蛋白跨膜蛋白(ZO-1)和胞浆附着蛋白(Occludin)的表达。 Emu Oil Combined with Lyprinol™[41] 小肠中部的隐窝深度标准化，降低了肠 髓过氧化物酶（MPO）水平，减轻肠道炎症，保护肠黏膜。 Dissotis rotundifolia[42] 减少出血、水肿和白细胞浸润以及提升谷胱甘肽（GSH）水平，降低MDA 水平，增强过氧化氢酶 (CAT) 和SOD 酶水平，保护胃黏膜。 Rosmarinic Acid[43] 降低溃疡指数、减少胃液分泌量和降低酸度，通过抗炎和抗凋亡机制保护胃黏膜。 维持肠道菌群稳定
的药物多酚（绿茶多酚、姜黄素、白藜芦醇和槲皮素）[44] 促进有益细菌种的产生和生长，对抗胃肠道损伤。 益生菌[45] 防止胃肠道应激反应和肠道菌群失调的发生，减轻胃肠道反应的症状。 粪便菌群移植[46] 调节肠道菌群的组成与稳定及SCFAs的生成。 rhein[47] 调节肠道微生物群，间接改变肠道中的嘌呤代谢，从而缓解肠道炎症，保护肠道。 
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