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三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）临床特点表现为转移能力强、复发率高和患者预后差，是目前威胁女性健康常见的恶性肿瘤之一[1-3]。由于其细胞表面不表达孕酮受体、雌激素受体以及表皮生长因子受体，使得常规靶向疗法对TNBC收效甚微，目前临床治疗手段仍以传统的化疗为主。然而TNBC除了不表达多种激素受体外，往往也伴随着乳腺癌基因（breast cancer gene，BRCA）等多种基因的突变[4-6]，导致其成为一种高度异质性的肿瘤类型，易对化疗药物产生抗性，进一步增加了治疗难度。
代谢旺盛的肿瘤细胞能量供应高度依赖有氧糖酵解产生的ATP，越来越多的研究表明，线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）对肿瘤细胞糖类、脂类及蛋白质类三大营养物质的相互转化和氧化还原反应的平衡有着重要的作用[7-8]。在多种流行病学、临床和实验室研究中证实，糖代谢抑制剂、线粒体呼吸链阻滞剂等具有显著的抗肿瘤作用[9]。因此，在正常细胞可承受范围内，靶向破坏肿瘤细胞的糖代谢以及干扰呼吸链的电子传递，是目前肿瘤治疗的新策略。
二甲双胍以其良好的安全性和耐受性，在糖尿病临床治疗中被广泛应用[10]。越来越多的研究表明，以二甲双胍为代表的双胍类药物对多种肿瘤具有抑制作用[11-12]。苯乙双胍是比二甲双胍作用强50倍的线粒体复合物I抑制剂[13]。然而，苯乙双胍作为一种抗肿瘤药物却难以获得各国药品管理部门的批准，主要原因是其副作用会产生大量的乳酸，易引起严重的乳酸性酸血症[14-16]。因此，联用其他辅助药物以降低苯乙双胍的使用剂量，在可控的不良反应内达到有效的抗肿瘤作用，是目前肿瘤临床治疗研究的新策略。
笔者将以肿瘤细胞能量代谢为突破点，研究低剂量的苯乙双胍联合己糖激酶抑制剂2-DG对TNBC的治疗作用，为将来针对TNBC的耐药和复发而进行的临床治疗提供新的策略。
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40只SPF级雌性6周龄BALB/c小鼠，体质量（20±2）g，购自浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2016-0002。小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1和人三阴性乳腺癌细胞系MBA-MD-231（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）。
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苯乙双胍（Selleck公司）；2-脱氧葡萄糖（Sigma公司）；RNA反转录试剂盒（ABI公司）；FITC-annexin Ⅴ/PI凋亡染色试剂盒（BD公司）；葡萄糖含量检测试剂盒、乳酸含量（LA）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；海马细胞线粒体压力检测试剂盒（Agilent公司）。
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分别将1×105个4T1或MDA-MB-231细胞接种到6孔板中，每组设3个复孔。实验分为空白对照组、苯乙双胍（100 μmol/L）组、2-DG（2 mmol/L）组和联用组（苯乙双胍：10 μmol/L；2-DG：200 μmol/L）。作用48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，获得单细胞悬液，用于后续的细胞增殖和凋亡检测。
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药物处理细胞48 h后，收集各组细胞悬液，4℃ 500×g离心5 min。弃上清液，每管加入1 ml冷PBS重悬细胞，离心后弃上清液，清洗细胞。加入100 μl 1×偶联缓冲液重悬细胞，然后每管分别加入2 μl annexin Ⅴ和PI，4℃避光孵育30 min。加入400 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况。
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各组细胞处理48 h后，收集细胞培养上清液，分别用葡萄糖含量检测试剂盒和乳酸含量检测试剂盒测定葡萄糖和乳酸浓度，同时收集细胞并计数。
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用海马细胞线粒体压力检测试剂盒测定4T1或MDA-MB-231细胞的线粒体OCR。细胞用药物预处理24 h，在评估前8 h，以6×105个细胞/孔的最佳培养密度将细胞转移到XF微板上，使细胞贴壁。用调节好pH 7.4的培养基对细胞进行清洗，在无CO2培养箱中平衡1 h。ABC孔分别加入寡霉素、线粒体解偶联剂（FCCP）、鱼藤酮和抗霉素A后，上机检测。
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分为空白（PBS）组、苯乙双胍（1 mg/kg）组、2-DG（5 mg/kg）组和联用组（苯乙双胍：0.1 mg/kg；2-DG：0.5 mg/kg），每组10只小鼠。1×105个 4T1细胞原位接种到BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内，待肿瘤生长至5 mm×5 mm左右时，荷瘤小鼠开始给药治疗，并每天测量肿瘤的大小。各给药组小鼠按50 μl体积瘤内注射给予，对照组给予等体积的PBS，每2 d给药1次。连续给药10次后，观察荷瘤小鼠的肿瘤大小并记录各组小鼠的死亡时间。
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采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验数据用(
$\bar x $ ±s )表示，两组间比较用t检验，多组的组间比较采用单因素方差分析，动物生存时间比较采用Kaplan-Meier法。 -
为检测苯乙双胍对线粒体呼吸的影响，将100 μmol/L苯乙双胍分别作用于4T1和MDA-MB-231细胞，24 h后收获细胞，海马生物能量分析仪检测细胞OCR水平。结果表明，苯乙双胍孵育24 h后，MDA-MB-231或4T1细胞线粒体OCR与空白组相比显著降低（图1）。
图 1 苯乙双胍对三阴性乳腺癌细胞OCR的影响
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100 μmol/L苯乙双胍处理4T1和MDA-MB-231细胞48 h后，检测细胞上清液中己糖激酶表达量、葡萄糖以及乳酸浓度。结果显示，4T1和MDA-MB-231细胞上清液中己糖激酶表达量，苯乙双胍给药组（4.6±0.17，3.73±0.21，n=3）明显高于空白组（1±0.15，1±0.12, n=3），组间有显著性差异（P<0. 001），表明苯乙双胍可在基因水平显著上调己糖激酶的表达（图2A）；4T1和MDA-MB-231细胞上清中葡萄糖消耗量，苯乙双胍给药组（356±31，397±42，n=3）μg/105个细胞明显高于空白组（289±25，301±32，n=3）μg/105细胞，组间有显著性差异（P < 0. 05），表明苯乙双胍能促进细胞摄取更多的葡萄糖，致使培养基中葡萄糖含量显著增加（图2B）；4T1和MDA-MB-231细胞上清中乳酸浓度，苯乙双胍给药组（5.59±0.52, 7.83±0.78, n=3）μmol/L明显高于空白组（2.37±0.18，4.01±0.45，n=3）μmol/L，组间有显著性差异（P < 0.01），表明苯乙双胍能显著促进培养上清液中乳酸的产生（图2C）。
图 2 苯乙双胍对MDA-MB-231和4T1细胞有氧糖酵解的影响 (`x±s , n = 3)
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由于苯乙双胍可上调4T1和MDA-MB-231细胞的有氧糖酵解，因此当我们联用低剂量的己糖激酶抑制剂2-DG时，三阴性乳腺癌细胞会发生什么变化呢？结果显示，与空白组相比，单用苯乙双胍或2-DG均能显著降低4T1与MDA-MB-231细胞存活率（P<0.01）（表1，图3）；与苯乙双胍或2-DG单药组相比，苯乙双胍联用2-DG，即使降低90%剂量，仍然可以显著降低4T1与MDA-MB-231细胞的存活率（P<0.001）（表1，图3），以上结果表明，苯乙双胍联用2-DG能显著促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡。与此同时，检测细胞上清液中的乳酸含量，相比苯乙双胍组（5.59±0.52，7.83±0.78，n=3）μmol/L，苯乙双胍与2-DG联用组（3.46±0.37，5.18±0.62，n=3）μmol/L细胞的乳酸产量也大幅下降（P < 0.01）（图4）。
表 1 苯乙双胍联合2-DG对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响[`x±s , n = 3，存活率（%）]
组别 4T1 MDA-MB-231 空白组（PBS） 96.37±2.31 97.63±1.46 苯乙双胍组（100 μmol/L） 86.70±1.83 * 85.53±1.46 ** 2-DG（2 mmol/L） 81.27±2.16** 80.67±4.07** 苯乙双胍+2-DG组(苯乙双胍:
10 μmol/L，2-DG: 200 μmol/L)64.63±2.28*** 51.97±2.29*** *P<0. 05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较 
图 3 苯乙双胍联合2-DG对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响 (`x±s , n=3)
图 4 苯乙双胍联合2-DG分别对MDA-MB-231和4T1细胞乳酸产生的影响(x±s , n=3)
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为了进一步验证苯乙双胍联合2-DG在体内抗肿瘤的效果，我们将4T1细胞原位接种到小鼠乳腺脂肪垫中，并分别给予单药治疗或联合治疗，观察肿瘤的生长速度以及荷瘤小鼠的生存时间。结果显示，与苯乙双胍或2-DG单药组相比，苯乙双胍联合2-DG组可显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速度（P<0.01）（图5A）。此外，苯乙双胍联合2-DG组荷瘤小鼠中位生存时间为72.5 d，高于苯乙双胍组（57 d）、2-DG组（55.5 d）、空白组组（50.5 d），差异有统计学意义（P<0.01）（图5B），表明苯乙双胍联合2-DG可以延长荷瘤小鼠生存时间。
图 5 苯乙双胍联合2-DG对4T1细胞造模小鼠肿瘤体积和生存时间的影响(`x±s , n=10)
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二甲双胍等双胍类糖尿病治疗药物，能够通过抑制线粒体复合物I来降低细胞内ATP水平。线粒体复合物I的损伤会降低NADH氧化为NAD+，这是维持TCA循环功能的关键反应，并最终导致抑制氧化磷酸化。前期研究表明，二甲双胍表现出显著的抗肿瘤作用。苯乙双胍与二甲双胍具有非常相似的代谢特征，而苯乙双胍的效力更强[17-18]。由于乳酸性酸中毒病死率高，2型糖尿病临床治疗不再使用苯乙双胍作为一线药物[19]。 然而作为一种抗癌药物，因其较低的有效剂量和较短的疗程，与糖尿病临床治疗大有不同，苯乙双胍被认为最有希望替代二甲双胍的双胍类药物[20-22]。
本研究采用小鼠三阴性乳腺癌细胞系4T1和人三阴性乳腺癌细胞系MBA-MD-231作为研究对象，发现苯乙双胍可显著抑制其线粒体氧化磷酸化，并上调肿瘤细胞的糖酵解。当加入己糖激酶抑制剂2-DG时，糖酵解途径被阻断，肿瘤细胞被迫使用氧化磷酸化来获取ATP，在此情况下，细胞对苯乙双胍更加敏感。基于该项发现，采用苯乙双胍联用2-DG治疗三阴性乳腺癌细胞。动物体内外结果表明，苯乙双胍联用2-DG可显著增加4T1细胞和MBA-MD-231细胞的死亡率，并延长荷瘤小鼠的生存时间。除了对这两种糖代谢方式双重抑制作用外，联用2-DG带来的另一个优势是可大大降低苯乙双胍的使用剂量，从而减轻苯乙双胍代谢产生的乳酸对机体的不良作用。
综上所述，通过苯乙双胍联用2-DG，可显著增强苯乙双胍对三阴性乳腺癌的凋亡作用，并降低其使用剂量，减轻不良反应，这一发现为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的策略。
Hexokinase inhibitor 2-deoxyglucose combined with phenformin induces cell apoptosis of triple-negative breast cancer
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摘要:
目的 探讨降糖药物苯乙双胍联合己糖激酶抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）对三阴性乳腺癌细胞4T1和MDA-MB-231凋亡作用的影响。 方法 苯乙双胍单独或联合2-DG处理4T1与MDA-MB-231细胞48 h，用SRB法检测细胞的增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，试剂盒检测培养上清液中葡萄糖消耗量和乳酸含量，多功能化学发光仪检测线粒体呼吸链复合物I活性，海马能量检测仪测定细胞线粒体耗氧量(OCR)。 结果 苯乙双胍组的4T1与MDA-MB-231细胞上清液己糖激酶表达量（4.6±0.17，3.73±0.21），葡萄糖消耗量（356±31，397±42）μg/105个细胞，乳酸浓度（5.59±0.52，7.83±0.78）μmol/L均高于空白组的已糖激酶表达量（1±0.15，1±0.12），葡萄糖消耗量（289±25，301±32）μg/105个细胞，乳酸浓度（2.37±0.18，4.01±0.45）μmol/L（P < 0.01）；苯乙双胍联用2-DG组的细胞存活率（64.63±2.28，51.97±2.29）% ，即使降低90%剂量，仍高于苯乙双胍组（86.70±1.83，85.53±1.46）%（P<0.001），两药联用极大地促进了4T1与MDA-MB-231细胞的凋亡，此外，相比于苯乙双胍组（5.59±0.52，7.83±0.78）μmol/L，苯乙双胍与2-DG联用组（3.46±0.37，5.18±0.62）μmol/L细胞的乳酸产量也大大下降（P<0.01）；与苯乙双胍或2-DG单药组相比，苯乙双胍联合2-DG组可显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速度（P<0.01）；苯乙双胍联合2-DG组荷瘤小鼠中位生存时间72.5 d，高于苯乙双胍组57 d、2-DG组55.5 d（P<0.01），苯乙双胍联合2-DG可以延长荷瘤小鼠生存时间。 结论 己糖激酶抑制剂2-DG显著增强了苯乙双胍对三阴性乳腺癌细胞的治疗作用。 Abstract:Objective To investigate the effect of phenformin combined with hexokinase inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG) on the treatment of triple-negative breast cancer cell lines 4T1 and MDA-MB-231. Methods Following treatment with phenformin, 2-DG or phenformin combined with 2-DG on 4T1 and MDA-MB-231 cells for 48 h, the cell proliferation in each group was detected by SRB and the apoptosis of cells was detected by flow cytometry. The concentration of glucose and lactic acid in cell culture supernatant was detected by ELISA. The activity of mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ was detected by FlexStation3 and the mitochondrial oxygen consumption (OCR) was assayed with the Seahorse X Fe Analyzer. Results The hexokinase expression (4.6±0.17,3.73±0.21), glucose consumption (356±31, 397±42) μg/105 cells , Lactic acid concentration (5.59±0.52, 7.83±0.78) μmol/L in the supernatant of 4T1 and MDA-MB-231 cells in Phenformin group were higher than that in control group ( 1±0.15, 1±0.12 ) , ( 289±25, 301±32) μg/105cells , ( 2.37±0.18, 4.01±0.45) μmol/L (P < 0.01). Even if the dose was reduced by 90%, the cell viability of phenformin combined with 2-DG group (64.63±2.28, 51.97±2.29) % was still higher than that of phenformin group (86.70±1.83, 85.53±1.46) % (P<0.001). The combination of the two drugs significantly promoted the apoptosis of 4T1 and MDA-MB-231. In addition, compared with the phenformin group (5.59±0.52, 7.83±0.78) μmol/L, the phenformin combined with 2-DG group (3.46±0.37, 5.18±0.62) μmol/L cell lactic acid production also greatly reduced (P<0.01). Compared with the phenformin or 2-DG single-drug group, the phenformin combined with 2-DG group can significantly inhibit the growth rate of tumors in tumor-bearing mice (P<0.01). The median survival time of tumor-bearing mice in the phenformin combined with 2-DG group was 72.5 d, which was higher than that in the phenformin group 57 d and 2-DG group 55.5 d (P<0.01). Conclusion Hexokinase inhibitor 2-DG significantly enhances the therapeutic effects of phenformin on triple-negative breast cancer cells. -
1. GMP检查总体情况概述
1.1 企业数量及其分布地区
截至2018年12月31日，安徽省中药饮片生产企业有226家，分布于安徽省内16个市区，其中，亳州市176家，阜阳市16家，占全省中药饮片生产企业总数比重分别为78%和7%。
1.2 检查结果
2014−2018年安徽省共组织涉及中药饮片生产范围的药品GMP现场检查293家次。其中，通过GMP检查243家次，未通过GMP检查50家次，不合格率为17.10%，详见表1。
表 1 2014−2018年中药饮片GMP认证检查结果（厂家/次数）年份 年检查总次数 认证通过 未认证通过 不合格率（%） 2014 58 51 7 12.10 2015 74 64 10 13.50 2016 49 43 6 12.20 2017 45 30 15 33.30 2018 67 55 12 17.90 总计 293 243 50 17.10 2. 缺陷项目构成情况
对50家次未通过的GMP现场检查报告进行分析，共发现严重缺陷66项，主要缺陷134项。依据《药品生产现场检查风险评定指导原则》，其中5家次GMP现场检查存在多项主要缺陷相互关联，经综合分析表明，质量管理体系中某一系统不能有效运行，合并升级为严重缺陷项。
2.1 严重缺陷项目
依据药品GMP及中药饮片等附录对缺陷进行分类，发现严重缺陷条款数量最多的GMP章节为总则（15项），其后依次为机构与人员（11项）、质量管理（9项）、质量控制与保证（8项）等，其中，涉及中药饮片附录章节依次为原则（2项），质量管理（1项），见表2。
表 2 严重缺陷项目分布情况GMP章节 严重缺陷
（项）涉及GMP
条款出现频次
(次)所占比例
（%，n=66）总则 15 第2、4条 151 22.73 质量管理 9 第7、9、11、12、14条 92 13.64 机构与人员 11 第18、20、25条 113 16.67 厂房与设施 5 第38、40、46条 5 7.58 物料与产品 1 第103条 1 1.52 确认与验证 2 第138、140条 2 3.03 文件管理 5 第150、159、163、175条 5 7.58 质量控制与保证 8 第217、222、223、243条 84 12.12 中药饮片附录 3 第7、51条 3 4.55 计算机化系统附录 2 第14条 2 3.03 合并升级 5 5 7.58 注：1 第2条出现频次为6次，第4条出现频次为9次；2 第12条出现频次为4次；3 第18条出现频次为6次，第20条出现频次为4次；4 第223条出现频次为4次。 对66项严重缺陷汇总分析发现，企业存在生产检验记录和数据不真实，在未通过检查的场所生产中药饮片，人员、设施、设备与企业的生产经营规模不完全适应，存在关键岗位人员兼职或者不能有效履行职责，生产记录或原始数据不能追溯，验证生产品种没有涵盖申请认证范围，物料管理混乱，许可检查中发现的缺陷项目未进行整改等问题。
2.2 主要缺陷项目
依据GMP正文及中药饮片等附录对134项主要缺陷进行分类，发现主要缺陷条款数量最多的GMP章节为机构与人员（22项），其后依次为质量控制与保证（21项）、文件管理（19项）、中药饮片附录（19项）、确认与验证（16项）、生产管理（8项）等，其中，涉及中药饮片附录章节依次为人员（1项）、厂房与设施（5项）、物料与产品（1项）、确认与验证（6项）、文件管理（3项）、生产管理（1项）、质量管理（2项），见表3。
表 3 主要缺陷项目分布情况GMP章节 主要缺陷（项） GMP条款 出现频次(次) 所占比例（%，n=134） 质量管理 6 第12、13、14条 6 4.48 机构与人员 22 第17、18、22、23、24、25、27条 221 16.42 厂房与设施 3 第38、44、47条 3 2.24 设备 5 第81、84、86、90条 5 3.73 物料与产品 7 第103、106、112条 7 5.22 确认与验证 16 第139、140、142、143、144、148、149条 162 11.94 文件管理 19 第150、152、155、158、159、161、164、170、173、180、183条 193 14.18 生产管理 8 第184、188、191、196条 84 5.97 质量控制与保证 21 第217、220、222、223、225、226、228、230、241、242、248、250条 215 15.67 自检 2 第309条 2 1.49 中药饮片附录 19 第11、23、24、25、34、39、40、41、43、44、47、52条 19 14.18 确认与验证附录 2 第23、25条 2 1.49 计算机化系统附录 3 第14、16条 3 2.24 取样附录 1 第5条 1 0.75 注：1 第18条出现频次为6次，第27条出现频次为7次；2 第139、140条出现频次均为4次；3 第150条出现频次为4次；4 第184条出现频次为5次；5 第223条出现频次为6次。 对134项主要缺陷汇总分析发现，企业存在以下问题：关键岗位人员职责不清；对某方面的操作知识了解不够，未能完全履行职责；开展培训的内容针对性不强，与该岗位的要求不相适应；缺乏对照品或对照药材不能对品种进行全项检验；偏差未采取有效的纠正和预防措施；未对检验方法进行确认，不能保证检验结果的准确性；工艺规程缺少关键的控制参数；生产检验记录不及时、不准确；确认与验证工作不充分等。
3. 存在的主要问题
从缺陷项目的构成情况和频次可以看出，缺陷相对集中在质量管理及质量控制与保证、机构与人员、文件与生产管理、确认与验证、物料与产品5个方面。以上统计数据一定程度上反映了目前中药饮片生产企业实施新修订药品 GMP过程中普遍存在的一些问题。
3.1 质量管理体系不能有效实施
在GMP检查过程中发现，部分中药饮片企业法人和负责人思想重视程度不够，法律意识淡薄，社会责任感不强，认为中药饮片标准不高也不会产生安全问题，忽略了饮片是用于临床的药品。这类中药饮片生产企业在执行GMP的各个环节中，违反GMP要求的情况频繁发生，如在GMP车间外生产中药饮片；不按炮制工艺进行生产；生产检验记录和数据不真实，质量把关流于形式，提升企业法人和负责人法律意识是保证中药饮片质量的基石。
3.2 不重视人才与培训
GMP现场检查过程中，多次发现关键人员生产负责人和质量负责人实际履职能力不足，采购、验收、仓储以及检验人员不熟悉药材的分类种属，药材鉴别能力较弱，检验人员检验基本技能差。对药品生产、质量有关的关键岗位人员培训不到位，培训次数少、时间短。另外，培训目的性不强，培训形式单一，内容简单，不分层次和岗位，培训效果不理想，同时也未对培训效果进行评估。企业还未认识到在药品生产中“人、机、料、法、环”最关键的生产要素是人，只有保证有足够的训练有素的人员，才能使质量管理体系顺利运行。
3.3 文件与实际生产结合不足
重生产、轻管理的现象还是普遍存在，企业制订的文件缺乏可操作性，工艺规程未根据工艺验证内容进行修订，批记录设计不合理，如缺少工艺参数、设备编号、生产操作过程等信息；记录填写、修改不规范。原因是企业的负责人及质量管理人员对文件管理的重要性认识不足，特别是质量保证人员没有充分发挥其在企业生产中的管理作用，使相关受控文件没有得到有效的执行。
3.4 对确认与验证认识不足
从目前来看，确认与验证仍然是企业的一个薄弱环节。检查中发现多数企业在验证工作中带有盲目性或应对性。为了认证而验证，方案及验证内容粗糙，有些仅做一组数据，没有重现性，验证的结果不能证明设备操作的可靠性和工艺规程的合理性。
3.5 中药材供应商的审计流于形式
部分企业的中药材供应商管理不完善，供应商的审计走形式，供应商档案信息过于简单，没有对直接从农户购入中药材质量进行评估并建立质量档案，不能从物料源头抓起，保证药品的质量。
4. 做好中药饮片GMP 生产和监管工作的建议
4.1 深入贯彻新修订《药品管理法》落实企业等各方责任
必须全面提升企业法人和负责人法律意识，药品生产企业是药品质量的责任主体，必须履行药品生产经营的各项法律法规和技术规范，必须对自己生产经营的产品质量安全承担法律责任，在强化责任中落实“四个最严”。
2019年颁布实施的新修订的《药品管理法》对药品违法行为处罚等都作出更严格的要求。一是切实“处罚到人”。明确对严重影响质量安全的违法行为，在对违法主体依法处罚的同时，对其法人、主要责任人、直接负责的主管人员和其他责任人员也予以处罚，包括没收违法行为发生期间其所获收入、罚款、一定期限甚至终身禁业，并可以处以拘留。二是提高财产罚幅度，处罚额度全面提升。三是专条规定刑事责任。设专条强调药品违法行为构成犯罪的，要依法追究刑事责任，立场鲜明地保持对药品安全犯罪行为的强力震慑和高压态势[1]。
4.2 注重引进中药饮片生产和质量管理人才与实际培训效果
药品生产各要素中最关键的要素是人，尤其是生产负责人和质量负责人。由于中药材品种繁多、来源复杂，各地用药习惯不同，药典和地方规范炮制过程时有不同，同物异名、同名异物的现象多，因此，中药材的验收、鉴别、检验以及中药饮片的炮制生产过程是一项技术性、经验性很强的工作[2]。2010版中药饮片附录对生产和质量管理部门负责人专业、学历、从业经验、年限做出明确要求，要求质量保证和控制人员具备中药材和中药饮片质量控制和鉴别真伪优劣的实际能力，要求采购、仓储验收人员明确中药材鉴别要求以及储存养护知识。
企业应积极引进中药生产和质量管理专业人才，制定切实可行的培训计划，针对不同岗位、不同层次的人员开展培训。培训内容包含法律法规、专业知识、操作技能等，让员工明白做什么、怎么做、达到什么标准。培训是提高企业员工素质的有效途径和手段，只有积极开展注重实效的培训，使最基层的员工到高管层全体人员真正理解GMP的精髓，才能真正执行好GMP，更好地保证产品质量。
4.3 建立符合自身实际的文件体系与保证质量体系有效运行
一个有效的文件管理体系能够很好地指导生产实践。质量管理文件的制定者需深刻理解GMP条款，基于风险管理和企业实际，反复修订文件，确保系统文件具有规范性、系统性和可操作性，文字表达应清晰易懂，确保所有执行人员能获得相关岗位工作的详细指令并遵照执行。对于工艺规程和操作规程中的关键参数，要经过充分验证，确定关键控制点，并保证生产和质量全过程的记录可追溯，确保质量体系在企业中有效运行[3]。
4.4 从源头抓起加强中药材供应商的审计管理
中药材质量直接影响中药产品制剂，中药饮片质量优劣直接影响临床疗效，其供应商的选择和管理就显得尤为重要。中药生产企业应对中药材供应商做好供应商审计，形成合格供应商目录，对于发现不符合要求且有作假、掺假、以次充好的，取消其供货资格。为确保药品质量，中药饮片生产企业必须建立良好的物料管理体系，从源头抓起，保证药品的质量。
4.5 有针对性做好生产管理工作
通过对缺陷项目进行统计分析不难发现，部分缺陷项目属于“细节问题”，不被人们所重视，往往正是这些“细节问题”增加了药品质量风险事件的发生率。企业必须按照法定标准和各省、自治区、直辖市中药炮制规范制定工艺规程，并按照工艺规程编写标准操作规程和批生产记录，在生产过程中，及时填写批生产记录、数据完整、内容真实，由操作人及复核人签字，控制好生产过程中每一个环节[4]。
4.6 统一检查判定尺度，加强中药饮片生产监管
中药饮片GMP监管工作是一项对检查员工作技巧性、专业性、原则性较高的工作。这就需要充实人员，建立职业化检查员队伍，有针对性的加强培训，提高对GMP检查工作的认知水平，加深对GMP标准的理解，统一检查尺度[5]。
5. 结语
新修订的GMP已实施了10年。我国从GMP认证发展到GMP的持续符合性监管，提升的是管理理念，不变的是GMP在药品生产中的重要作用。中药饮片生产企业应提高法律意识，加强诚信建设，注重人员培训，根据中药饮片的生产特点，真正将GMP的思想贯彻到实处，提高硬件配置水平，建立规范的文件体系并控制实际执行情况，持续合规生产，最大程度地降低药品生产风险，而GMP监管应突出专业性和职业化，切实保证中药饮片质量安全。
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图 2 苯乙双胍对MDA-MB-231和4T1细胞有氧糖酵解的影响 (`x±s , n = 3)
注：A. 己糖激酶mRNA表达量；B. 葡萄糖消耗量；C. 乳酸浓度；*P<0.05, ** P<0.01，*** P < 0. 001 ，与空白组比较
图 3 苯乙双胍联合2-DG对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响 (`x±s , n=3)
注：A. 苯乙双胍（100 μmol/L）、2-DG（2 mmol/L）、苯乙双胍（100 ng/ml）联合2-DG（20 nmol/L）处理MDA-MB-231，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；B. 苯乙双胍（100 μmol/L）、2-DG（2 mmol/L）、苯乙双胍（100 ng/ml）联合2-DG（20 nmol/L）处理4T1，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；* P < 0. 05, ** P<0. 01, *** P<0. 001，与空白组比较
图 5 苯乙双胍联合2-DG对4T1细胞造模小鼠肿瘤体积和生存时间的影响(`x±s , n=10)
注：A. 1×105个 4T1细胞原位接种到BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内，待肿瘤生长至5 mm×5 mm左右时，荷瘤小鼠开始给药治疗，测量每日肿瘤体积，**P <0.01，与苯乙双胍组比较；B. 4T1细胞造模小鼠给药后的生存时间；**P<0.01，与2-DG组比较
表 1 苯乙双胍联合2-DG对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响[`x±s , n = 3，存活率（%）]
组别 4T1 MDA-MB-231 空白组（PBS） 96.37±2.31 97.63±1.46 苯乙双胍组（100 μmol/L） 86.70±1.83 * 85.53±1.46 ** 2-DG（2 mmol/L） 81.27±2.16** 80.67±4.07** 苯乙双胍+2-DG组(苯乙双胍:
10 μmol/L，2-DG: 200 μmol/L)64.63±2.28*** 51.97±2.29*** *P<0. 05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较 
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[1] GARRIDO-CASTRO A C, WINER E P. Predicting breast cancer therapeutic response[J]. Nat Med,2018,24(5):535-537. doi: 10.1038/s41591-018-0033-7 [2] KROP I, ISMAILA N, ANDRE F, et al. Use of biomarkers to guide decisions on adjuvant systemic therapy for women with early-stage invasive breast cancer: American Society Of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline focused update[J]. J Clin Oncol,2017,35(24):2838-2847. doi: 10.1200/JCO.2017.74.0472 [3] SAVAS P, SALGADO R, DENKERT C, et al. Clinical relevance of host immunity in breast cancer: from TILs to the clinic[J]. Nat Rev Clin Oncol,2016,13(4):228-241. doi: 10.1038/nrclinonc.2015.215 [4] VAN 'T VEER L J, DAI H Y, VAN DE VIJVER M J, et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer[J]. Nature,2002,415(6871):530-536. doi: 10.1038/415530a [5] BROWN L C, SALGADO R, LUEN S J, et al. Tumor-infiltrating lymphocyctes in triple-negative breast cancer: update for 2020[J]. Cancer J,2021,27(1):25-31. doi: 10.1097/PPO.0000000000000501 [6] INCORVAIA L, FANALE D, BONO M, et al. BRCA1/2 pathogenic variants in triple-negative versus luminal-like breast cancers: genotype-phenotype correlation in a cohort of 531 patients[J]. Ther Adv Med Oncol, 2020, 12: 1758835920975326. [7] ZACKSENHAUS E, SHRESTHA M, LIU J C, et al. Mitochondrial OXPHOS induced by RB1 deficiency in breast cancer: implications for anabolic metabolism, stemness, and metastasis[J]. Trends Cancer,2017,3(11):768-779. doi: 10.1016/j.trecan.2017.09.002 [8] LORD S R, CHENG W C, LIU D, et al. Integrated pharmacodynamic analysis identifies two metabolic adaption pathways to metformin in breast cancer[J]. Cell Metab,2018,28(5):679-688.e4. doi: 10.1016/j.cmet.2018.08.021 [9] ICARD P, LOI M, WU Z R, et al. Metabolic strategies for inhibiting cancer development[J]. Adv Nutr,2021:nmaa174. [10] FLORY J, LIPSKA K. Metformin for type 2 diabetes-reply[J]. JAMA,2019,322(13):1313. [11] SCHULTEN H J. Pleiotropic effects of metformin on cancer[J]. Int J Mol Sci,2018,19(10):E2850. doi: 10.3390/ijms19102850 [12] CIOCE M, PULITO C, STRANO S, et al. Metformin: metabolic rewiring faces tumor heterogeneity[J]. Cells,2020,9(11):E2439. doi: 10.3390/cells9112439 [13] DYKENS J A, JAMIESON J, MARROQUIN L, et al. Biguanide-induced mitochondrial dysfunction yields increased lactate production and cytotoxicity of aerobically-poised HepG2 cells and human hepatocytes in vitro[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2008,233(2):203-210. doi: 10.1016/j.taap.2008.08.013 [14] ENIA G, GAROZZO M, ZOCCALI C. Lactic acidosis induced by phenformin is still a public health problem in Italy[J]. BMJ,1997,315(7120):1466-1467. doi: 10.1136/bmj.315.7120.1466 [15] GARCÍA RUBIÑO M E, CARRILLO E, RUIZ ALCALÁ G, et al. Phenformin as an anticancer agent: challenges and prospects[J]. Int J Mol Sci,2019,20(13):E3316. doi: 10.3390/ijms20133316 [16] BERNIER G M, MILLER M, SPRINGATE C S. Lactic acidosis and phenformin hydrochloride[J]. JAMA,1963,184:43-46. [17] KONG H, RECZEK C R, MCELROY G S, et al. Metabolic determinants of cellular fitness dependent on mitochondrial reactive oxygen species[J]. Sci Adv,2020,6(45):eabb7272. doi: 10.1126/sciadv.abb7272 [18] MASOUD R, REYES-CASTELLANOS G, LAC S, et al. Targeting mitochondrial complex I overcomes chemoresistance in high OXPHOS pancreatic cancer[J]. Cell Rep Med,2020,1(8):100143. doi: 10.1016/j.xcrm.2020.100143 [19] OWEN M R, DORAN E, HALESTRAP A P. Evidence that metformin exerts its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain[J]. Biochem J, 2000, 348(Pt 3): 607-614. [20] FEARNLEY G R, CHAKRABARTI R, EVANS J F. Effect of ethyloestrenol combined with phenformin or with metformin on platelet stickiness and serum-cholesterol in patients with occlusive vascular disease[J]. Lancet,1968,2(7576):1004-1007. [21] SHACKELFORD D B, ABT E, GERKEN L, et al. LKB1 inactivation dictates therapeutic response of non-small cell lung cancer to the metabolism drug phenformin[J]. Cancer Cell,2013,23(2):143-158. doi: 10.1016/j.ccr.2012.12.008 [22] DI MAGNO L, MANNI S, DI PASTENA F, et al. Phenformin inhibits hedgehog-dependent tumor growth through a complex I-independent redox/corepressor module[J]. Cell Rep,2020,30(6):1735-1752. doi: 10.1016/j.celrep.2020.01.024 期刊类型引用(26)
1. 项艳，蓝艳，胡珍. 中药饮片质量控制关键技术体系的构建. 中医药管理杂志. 2024(03): 157-159 . 
百度学术2. 蒋瑜. 基于安全用药的中药饮片超量使用分析. 中医药管理杂志. 2024(10): 78-80 . 百度学术3. 蒋文文. 我院中药房中药饮片管理问题分析与优化措施. 中医药管理杂志. 2024(11): 80-82 . 百度学术4. 任冠桦，徐智毅，郑智敏，彭志伟. 中草药质量管理面临的若干问题与对策. 临床合理用药. 2024(23): 177-180 . 百度学术5. 章文霞，徐大丽，贺学锋，刘宇琴，刘蓉，黄洁，刘刚，马银霞. 药品生产企业现场检查缺陷项目分析及对策建议. 海峡药学. 2024(08): 127-130 . 百度学术6. 付晓蕾，张凤英，马定耀. 中药饮片变质的影响因素分析及管理对策. 医药前沿. 2024(23): 119-121 . 百度学术7. 沈小芬，王璟琨，何佳雯，徐佳立. 产地差异对中药药性的影响与管理办法. 中医药管理杂志. 2023(03): 133-135 . 百度学术8. 梁艳. 中药饮片配方质量管理在改善中药房处方合理性与用药安全性中的作用. 中医药管理杂志. 2023(08): 125-127 . 百度学术9. 黄健. 中药师干预在促进综合医院中药合理使用中的重要作用. 中医药管理杂志. 2023(14): 81-83 . 百度学术10. 颜雨雯. 影响中药饮片质量的因素分析与针对性质量控制对策. 中医药管理杂志. 2023(14): 141-143 . 百度学术11. 叶婷婷. 中药质量规范化管理在医院中药房开展的作用和影响. 中医药管理杂志. 2023(14): 149-151 . 百度学术12. 吴洪淼. 规范化管理在提升中药饮片管理质量中的作用. 中医药管理杂志. 2023(14): 136-138 . 百度学术13. 杨建英，应媛媛，刘冬梅. 基于JCI标准与理念构建高警讯中药饮片管理方案. 中医药管理杂志. 2023(15): 83-85 . 百度学术14. 沈佳. 双人核对管理模式在中药饮片仓库管理中的应用. 中医药管理杂志. 2023(16): 175-177 . 百度学术15. 乐海平，李金林. 中药饮片行业现状及发展对策探讨. 中国中医药现代远程教育. 2023(19): 206-208 . 百度学术16. 包中文，包凤君. 中药调剂管理在中药房调剂中的应用价值分析. 中国现代药物应用. 2023(18): 166-169 . 百度学术17. 何欣欣，江莉佳. 中药饮片应用的影响因素分析与管理措施. 中医药管理杂志. 2023(19): 172-174 . 百度学术18. 沈娜. 持续质量改进在提升中药房中药饮片养护合格率中的作用. 中医药管理杂志. 2023(21): 182-184 . 百度学术19. 张凤英，付晓蕾，马定耀. 品管圈活动在中药饮片质量管理中的应用效果. 中国当代医药. 2023(33): 110-113 . 百度学术20. 姚桂娟，庞玉扬，梁国强. 中药饮片质量现存问题及对策分析. 中国医药导刊. 2023(09): 966-970 . 百度学术21. 周火安. “智能+人工”审核模式在中药饮片监管中的应用研究. 黑龙江中医药. 2023(05): 400-402 . 百度学术22. 林玲，徐甜甜，卢韵琦. 中药制剂临床使用不良反应的分析与管理. 中医药管理杂志. 2022(06): 105-106 . 百度学术23. 潘国军，万志玲. 中药饮片质量的影响因素与质量控制对策. 中医药管理杂志. 2022(15): 231-232 . 百度学术24. 钱爱军. 中药特色质量管理模式在内科中药饮片中的应用价值. 北方药学. 2022(05): 112-115 . 百度学术25. 马小燕，高嘉敏，谢二磊. 2020年江西省药品生产企业检查缺陷项目分析及对策. 中国药业. 2021(23): 15-18 . 百度学术26. 贺宇. ABCD分类管理法在提高中药饮片库存周转率中的作用. 中医药管理杂志. 2021(24): 96-97 . 百度学术其他类型引用(1)
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