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烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

汪东昇 郑斯莉 程明和 缪朝玉

张灵娜, 王天宇, 洪婉凤, 陶春, 宋洪涛. 以硝化纤维为膜材的伤口敷料的制备及处方优化[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 301-306. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201910082
引用本文: 汪东昇, 郑斯莉, 程明和, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
ZHANG Lingna, WANG Tianyu, HONG Wanfeng, TAO Chun, SONG Hongtao. Preparation and formulation optimization of wound dressings with nitrocellu-lose as membrane material[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 301-306. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201910082
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006

烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
基金项目: 上海市科委生物医药领域科技支撑项目(16431901400);国家自然科学基金重点项目(81730098)
详细信息
    作者简介:

    汪东昇,硕士研究生,Email:wangdongsheng126@126.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R965

Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock

  • 摘要:   目的  探究烟酰胺单核苷酸(NMN)对脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克小鼠死亡率的影响。  方法  将10周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分组,均腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模。NMN腹腔注射给药,分为3种方式:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg。观察记录每组小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线。  结果  与溶剂对照组相比,造模后0.5 h或造模前0.5 h给予不同剂量NMN,均不能改善小鼠死亡率或延缓死亡时间;造模后0.5 h和12 h两次给予NMN会加速小鼠死亡,增加小鼠死亡率。两个厂家的NMN产品效果类似。  结论  NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠不具有治疗作用,小鼠内毒素休克发生后进行NMN多次给药会增加死亡率。
  • 皮肤是人体最大的器官,日常生活中难免受到损伤形成伤口,如轻微的皮肤擦伤、割伤和烧伤等。对于日常的小伤口,一般可以任其自愈,但若稍不注意沾水或接触外界细菌,则容易造成感染,影响伤口愈合,甚至造成溃烂。我们常用的创面处理方法有:使用创可贴覆盖;双氧水或碘伏消毒处理;纱布包扎等。这些处理方法存在着防水透气性差、撕除时疼痛和使用不便等问题。20世纪60年代,Winter博士的研究证实了湿润的伤口环境有助于上皮组织更快的形成,并以此为依据提出了“湿性愈合”的概念[1]。这一研究提高了人们对伤口护理的认识,也为研发封闭敷料奠定了基础。由于传统的敷料不能在伤口处使用较长时间,也不能为伤口愈合提供一个湿润的环境,因此,各种高科技的湿性疗法的伤口护理产品层出不穷。在日本及美国等发达国家,出现以硝化纤维为主要材料的新型创伤敷料[2-4],可用于密封小型伤口甚至保护烧伤创面。此类创伤敷料在使用前为液体形态,涂抹在伤口后有机溶剂迅速挥发,短时间覆盖伤口形成保护膜,具有防水、杀菌、预防伤口感染等优点[5-7]。本研究拟以市售小林液体创可贴为基础,以硝化纤维为膜材,优化处方,制备一种性能更为优良的液体创伤敷料。

    Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Shimadzu HS-20气相色谱仪(日本Shimadzu公司);拉力试验机(上海和晟仪器有限公司);AL204型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);D2400型纯水/超纯水一体机(美国明澈公司);25型无极调速电动搅拌机(江苏江阴科技器械厂)。

    小林液体创可贴(日本小林制药株式会社);硝化纤维(衡水东方化工有限公司);蓖麻油、樟脑、苯甲醇、乙酸丁酯、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇(均为国药集团化学试剂有限公司);棕榈酸异丙酯(IPP,青岛优索化学科技有限公司);乙酸乙酯(上海联试试剂有限公司)。

    2.1.1   苯甲醇的含量测定

    采用高效液相色谱法测定,色谱条件:采用Agilent 1200高效液相色谱仪;色谱柱:ODS-C18色谱柱;流动相:甲醇-水(50∶50 V/V);流速:1.0 ml/min;进样量:20 μl;柱温:40 ℃;检测波长:257 nm。

    标准曲线的绘制:精密称定苯甲醇对照品151.3 mg置于100 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度;精密量取上述溶液1、2、2.5、3、4 ml于25 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。市售产品(供试品)溶液的配制:精密称定244.3 mg市售产品于50 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度。

    实验结果:色谱图良好,苯甲醇对照品及市售产品均在5.87 min附近有峰且峰型良好。标准曲线回归方程为:Y = 13040X + 212.7 (r=0.999);经计算得市售产品苯甲醇的使用量为4.0%。

    2.1.2   溶剂组成的测定

    采用气相色谱法测定,色谱条件:采用 HS-20气相色谱仪;色谱柱:DB-624毛细管柱;载气:H2 50 ml/min;空气450 ml/min;进样量:1 μl;柱温:40 ℃/min持续3 min,10 ℃程序升温至200 ℃,持续1 min;检测器温度:250 ℃;气化室温度:220 ℃;FID检测器。

    标准曲线的绘制:精密称定异丙醇1.0077 g,乙酸乙酯0.9933 g,乙酸丁酯1.0014 g于100 ml容量瓶中,加入适量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合均匀,用DMF稀释至刻度。分别取上述溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 ml置于25 ml容量瓶中,用DMF稀释至刻度。

    市售产品(供试品)溶液的配制:精密称定1.186 0 g市售产品于100 ml容量品中,加入适量的DMF超声溶解,用DMF稀释至刻度,精密量取1 ml上述液体于10 ml容量瓶中,用DMF稀释至刻度。

    实验结果:色谱图良好,异丙醇对照品及市售产品均在6.84 min附近有峰且峰型良好,乙酸乙酯对照品及市售产品均在9.25 min附近有峰且峰型良好,乙酸丁酯对照品及市售产品均在14.07 min附近有峰且峰型良好;苯甲醇标准曲线、乙酸乙酯标准曲线和乙酸丁酯标准曲线的回归方程分别为:

    Y = 20152X + 2.692, r=1.000

    Y = 15311X + 33.45 ,r=0.999

    Y = 24428X – 17.33, r=0.999

    经计算得市售产品中异丙醇的使用量为35.1%,乙酸乙酯的使用量为21.4%,乙酸丁酯的使用量为5.3%。即三者使用比例为:6.6∶4∶1。

    2.2.1   液体创伤敷料的制备方法

    采用硝化纤维(4%~8%)作为成膜材料,蓖麻油(1%~9%)为增塑剂,苯甲醇(4%)为抑菌剂,棕榈酸异丙酯(IPP,2%)为皮肤柔润剂,樟脑(0.3%)为芳香剂,以异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯(三者比例为6.6∶4∶1)作为溶剂制备创伤敷料。制备方法如下:于50 ml烧杯中精密称定处方量蓖麻油、苯甲醇、IPP、樟脑,加入上述3种混合溶剂使混合均匀,加入处方量硝化纤维,密封静置过夜待硝化纤维充分溶解,过夜后搅拌使硝化纤维混合均匀,超声除气泡即得。

    2.2.2   敷料薄膜的制备方法

    精密称定2 g按“2.2.1”项制备的液体创伤敷料,加入20 ml乙酸乙酯稀释使之混合均匀、黏度下降并充分溶解。将此液体置于90 mm培养皿中待溶剂挥干后可见均一透明无色薄膜。所制薄膜外观如图1所示。

    按照中华人民共和国医药行业标准YY/T 0471-2004对直接接触类创伤敷料,进行舒适性、防水性、透气性的考察。舒适性考察主要为考察敷料薄膜的抗张强度及断点伸长百分率[8-9];防水性考察薄膜的防水能力;透气性考察薄膜的水蒸气透过率(MVTR)[10]。抗张强度及断点伸长百分率的考察运用拉伸试验机,并采用公式1、公式2进行计算;防水性的考察采用倒杯法,记录24 h后的重量差异,如图2所示,以公式3进行计算;MVTR的考察方法:在西林瓶中加入蒸馏水,用薄膜覆盖密封,使水液面距薄膜(5±1)mm,置干燥器中,记录24 h后的重量差异,以公式4进行计算。

    图  1  薄膜外观图
    图  2  防水性测试方法
    $$ {\text{抗张强度}}= {\rm{F}}/{\rm{S}}\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\;\;\;\;\; $$ (1)
    $$ {\text{断点伸长百分率}} = {{\rm{L}}_{{\rm{max}}}}/{{\rm{L}}_{\rm{o}}} \times 100 {\text%} $$ (2)
    $$ {\text{水分损失率}}= \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/{{\rm{M}}_{\rm{W}}}\quad\;\;\; $$ (3)
    $$ {\text{水蒸气透过率}} = \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/\left( {{\rm{s}} \times t} \right) $$ (4)

    式中,F为拉伸力;S为薄膜面积;Lmax为拉伸最大距离;L0为初始膜长;M0为初始西林瓶重量;M24h为24 h后西林瓶重量;MW为西林瓶内水重量;s为瓶口面积;t为时间24 h。

    分别采用4%、6%、8%的硝化纤维制备液体创伤敷料,对所制的薄膜进行评价,其断点伸长百分率、防水性能考察的水透过率及MVTR值随着硝化纤维用量的增加呈下降趋势,抗张强度随着硝化纤维用量的增加呈上升趋势。其考察结果如图3~图6所示:

    图  3  不同用量硝化纤维的伸长率
    图  4  不同用量硝化纤维的抗张强度
    图  5  不同用量硝化纤维的MVTR值
    图  6  不同用量硝化纤维的水损失率

    图3图4可知,硝化纤维的用量为4%、6%时,断点伸长百分率在170%以上,可认为薄膜韧性较好,在伤口表面有较好的舒适性,而硝化纤维用量为8%时,其断点伸长百分率较低,不足150%;在硝化纤维用量为4%时,所制薄膜过薄,导致其抗张强度较差,不及2.0 MPa。从图5可知,MVTR值在0.3~0.6 mg/(cm2·h)之间,随硝化纤维用量增加而减小,但均具有一定的透气性;由图6可知,三个不同梯度的硝化纤维在24 h内其水损失率均在2.5%以下,可认为防水性良好。综上考察结果,本次采用的硝化纤维用量为6%。

    确定硝化纤维使用量为6%后,分别采用1%、5%、9%用量的蓖麻油制备液体创伤敷料,对所制的薄膜进行评价,由图7图8可知,其断点伸长百分率随蓖麻油用量增加呈上升趋势,在蓖麻油使用量为1%时断点伸长百分率较差,不及150%,在5%~9%上升趋势明显且在蓖麻油用量为9%时达到190%,断点伸长百分率值数据较为理想;抗张强度随蓖麻油用量未呈明显下降趋势,反而是在蓖麻油使用量为5%时具有最大的抗张强度,而伸长率较好的9%用量蓖麻油处方抗张强度明显较小,在2.5 MPa左右,故蓖麻油用量选用浓度为5%。

    图  7  不同用量蓖麻油的伸长率

    关于蓖麻油对防水性能和透气性能的影响如图9图10所示,蓖麻油用量为1%时其MVTR值明显高于5%和9%时,且其水损失率也高于5%和9%时,由于5%与9%的防水性没有太大的差异。由此可以得出的结论是,随着蓖麻油的加入,创伤敷料的透气性变差,同时其防水性能却有所增强,1%用量蓖麻油透气性能极佳,但机械性能及防水性相对较差,又因其水损失率24 h也没有达到5%,也可以认为其防水性能良好。所以下一步的考察尽量满足透气性的需求。

    图  8  不同用量蓖麻油的抗张强度
    图  9  不同用量蓖麻油的MVTR值
    图  10  不同用量蓖麻油的水损失率

    综合断点伸长百分率、抗张强度、MVTR值、水损失率,在保证机械强度的同时尽量满足其透气性的要求。拟在1%~5%之间再另设梯度进行考察。拟定蓖麻油使用量为2%、3%、4%时对上述指标再行考察。

    图11图12可知处方断点伸长百分率及抗张强度在1%~5%范围内随蓖麻油用量的增加总体上均有一定的上升趋势。断点伸长百分率在蓖麻油用量为1%、2%时相差不大,在2%~5%时有明显的上升趋势;抗张强度在蓖麻油用量1%、2%时和4%、5%时相差不大,在蓖麻油用量从2%~4%时有明显的上升趋势。

    图  11  不同用量蓖麻油的伸长率
    图  12  不同用量蓖麻油的抗张强度

    图13图14可知在蓖麻油用量为1%~5%范围内MVTR值及水损失率随处方中蓖麻油用量的增加而呈下降趋势。

    综合以上几个因素对处方中的蓖麻油用量进行考察,从所制薄膜的机械性能来看,在蓖麻油用量为1%~3%时,断点伸长百分率不及160%,抗张强度较差,不及3.60 MPa,故此用量不予考虑,从所制薄膜的防水透气效果来看,4%、5%用量均有一定的透气效果,且防水性测试结果显示二者水损失率均不超过2.50%。综上考虑,确定蓖麻油的使用量为4%。

    图  13  不同用量蓖麻油的MVTR值
    图  14  不同用量蓖麻油的水损失率

    本文对市售产品的抑菌剂含量及溶剂组成进行了分析,以此作为基础对自制的液体创伤敷料进行单因素考察,确定了硝化纤维的最终用量为6%,蓖麻油的使用量为4%,所成薄膜具有良好的机械性能,具有透气性的同时又有着良好的防水效果。硝化纤维为主要的成膜材料,其用量对几个评价指标均有影响,其主要原因是其使用量的不同可造成所成薄膜的厚度不同,即创伤敷料薄膜厚度与硝化纤维用量成正比,其膜的厚度必然影响各项指标性能。蓖麻油作为增塑剂,对处方的影响主要在于:蓖麻油的加入能改变硝化纤维聚合物链之间的结构,使链与链之间的作用力产生变化从而在一定程度上影响薄膜的塑性。其次,蓖麻油的加入,可能堵塞了硝化纤维薄膜的纳米孔道,故呈现出其用量增加透气性能下降的趋势。

    皮肤创伤,在临床和日常生活中都较为常见,伤口愈合的速度一定程度上取决于创伤表面环境,创伤表面环境需保持一定的潮湿性,即湿润表面可以加速伤口愈合,因此良好的创伤敷料,应具有一定的透气性,对于日常伤口来说,由于伤口表面的复杂,使用在创伤表面的敷料也应具有一定的机械性能。本实验主要探讨了硝化纤维和蓖麻油的用量对创伤敷料性能的影响,为下一步制备性能更加优良的创伤敷料提供研究基础。

  • 图  1  LPS造模后300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    图  2  LPS造模后不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    图  3  LPS造模前300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响

    图  4  LPS造模前不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    图  5  LPS造模后两次NMN给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    *P<0.05、**P<0.01,与生理盐水组比较。

    图  6  不同厂家NMN两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    *P<0.05,与生理盐水组比较。

    图  7  不同厂家NMN预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-02-05
  • 修回日期:  2021-03-10
  • 网络出版日期:  2021-03-31
  • 刊出日期:  2021-03-25

烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
    基金项目:  上海市科委生物医药领域科技支撑项目(16431901400);国家自然科学基金重点项目(81730098)
    作者简介:

    汪东昇,硕士研究生,Email:wangdongsheng126@126.com

    通讯作者: 缪朝玉,教授,博士生导师,研究方向:心脑血管药理学,Email:cymiao@smmu.edu.cn
  • 中图分类号: R965

摘要:   目的  探究烟酰胺单核苷酸(NMN)对脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克小鼠死亡率的影响。  方法  将10周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分组,均腹腔注射LPS(10 mg/kg)造模。NMN腹腔注射给药,分为3种方式:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg。观察记录每组小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线。  结果  与溶剂对照组相比,造模后0.5 h或造模前0.5 h给予不同剂量NMN,均不能改善小鼠死亡率或延缓死亡时间;造模后0.5 h和12 h两次给予NMN会加速小鼠死亡,增加小鼠死亡率。两个厂家的NMN产品效果类似。  结论  NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠不具有治疗作用,小鼠内毒素休克发生后进行NMN多次给药会增加死亡率。

English Abstract

张灵娜, 王天宇, 洪婉凤, 陶春, 宋洪涛. 以硝化纤维为膜材的伤口敷料的制备及处方优化[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 301-306. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201910082
引用本文: 汪东昇, 郑斯莉, 程明和, 缪朝玉. 烟酰胺单核苷酸对内毒素休克小鼠死亡率的影响[J]. 药学实践与服务, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
ZHANG Lingna, WANG Tianyu, HONG Wanfeng, TAO Chun, SONG Hongtao. Preparation and formulation optimization of wound dressings with nitrocellu-lose as membrane material[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 301-306. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201910082
Citation: WANG Dongsheng, ZHENG Sili, CHENG Minghe, MIAO Chaoyu. Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2021, 39(2): 134-137, 142. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202102006
  • 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种经典辅酶,对线粒体电子转移反应至关重要,在许多生物学功能中起着关键作用[1]。烟酰胺单核苷酸(NMN)是NAD生物合成的关键中间体。NMN在心脑血管疾病、肝肾功能、血管和内皮功能,以及免疫和炎症、衰老等各类疾病治疗方面都具有相当强的潜力[2],常被人称为“万能药”。NMN能够通过口服、静脉注射、腹腔注射(小鼠)等多种给药途径进入体内,通常具有较高的安全性。在急性毒性实验中,小鼠连续7 d给予最大灌胃剂量和饱和浓度的NMN,每天1次,耐受性良好,除血清丙氨酸氨基转移酶略有升高外,其余生物标志物基本保持不变,而相同处理条件下的比格犬,会有轻度的肌酐和尿酸升高[3];在长期给药实验中,小鼠连续12个月给予100和300 mg/kg的NMN,均未出现不良反应[4]。在出血性休克治疗方面,对出血性休克大鼠模型,术前连续5 d的NMN饮水给药和术后静脉推注NMN均能缩短休克复苏时间和提高复苏后的存活率[5]。据报道[6-9],在炎症治疗方面,NMN及相关代谢产物烟酰胺核糖、烟酰胺都具有一定抗炎作用。

    内毒素休克是由感染引起的全身炎症反应综合征,会导致各系统衰竭,包括循环系统、呼吸系统、血液系统,损害肝脏和肾脏功能[10]。相关研究显示,最佳的治疗时间在发病6 h内,能够提高患者的生存率,降低病死率[11]。目前临床内毒素休克以药物治疗为主(如血管活性药物、激素、抗菌素等)[12],同时辅以液体复苏、脑神经保护、吸氧等常规治疗。为便于对内毒素休克开展研究治疗,通常使用LPS进行内毒素休克动物造模,LPS是G-菌细胞壁外膜上的主要成分,也叫内毒素,能引起严重的炎症级联反应,是G-菌的主要致病成分之一[13]

    目前,NMN对内毒素休克的治疗作用尚未知。本研究旨在探究NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠模型的死亡率影响,为阐明NMN在内毒素休克治疗方面的作用提供线索。

    • 烟酰胺单核苷酸[NMN,纯度≥95%,−25~−15 ℃保存,邦泰生物工程(深圳)有限公司];烟酰胺单核苷酸[NMN~,纯度≥95%,2~8 ℃保存,尚科生物医药(上海)有限公司];脂多糖(LPS,美国Sigma公司);BT25S精密电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];独立通风系统(上海鸣励实验室科技发展有限公司)。

    • SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)。实验前在相对洁净的环境下使用独立通风系统,将动物适应性饲养2周。期间动物自由饮水、进食。笼具内温度22~26 ℃、湿度40%~70%,笼内维持正压20~25 Pa,每小时换气次数60~70次,室内明暗交替12 h(8:00~20:00照明)。

    • 根据不同实验目的,将C57BL/6J小鼠随机分为给药组和对照组。腹腔注射LPS(10 mg/kg)进行内毒素休克造模,在造模前或者造模后进行NMN腹腔注射给药,给药方式分为单次给药和两次给药方式。具体分成5个实验:①造模后0.5 h给药,剂量为10、30、100、300 mg/kg;②造模前0.5 h给药,剂量为30、100、300、600 mg/kg;③造模后0.5 h和12 h两次给药,每次300 mg/kg;④造模后0.5 h和12 h分别用2种不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg;⑤造模前0.5 h用不同厂家的NMN给药,剂量为300 mg/kg。

    • 使用Log-rank检验,对给药组和溶剂对照组的生存曲线进行比较,P<0.05为差异有统计学意义,使用GraphPad Prism8软件对数据进行统计分析。

    • 图1所示,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN组小鼠首次出现死亡的时间比生理盐水组更早,整个观察期间给药组小鼠死亡的总体趋势要稍快于生理盐水组,且在观察末期存活的动物数量略少。但两组生存曲线之间比较无统计学差异(P=0.2161)。因此,LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN不具有治疗内毒素休克的作用,甚至有轻微增加内毒素休克死亡率的趋势。

      图  1  LPS造模后300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

      实验进一步考察了LPS造模后0.5 h给予多个不同剂量NMN对内毒素休克死亡率的影响,如图2所示,与生理盐水组相比,10、30、100、300 mg/kg NMN给药组的小鼠首次出现死亡的时间均接近,各组中位生存时间:300、100、30、10 mg/kg给药组分别为51、55、41和38 h,生理盐水组为37 h。整个观察期间NMN给药各组死亡速度较生理盐水组稍缓,其中放缓趋势最明显的是100 mg/kg剂量组,但均不具有统计学意义(P=0.4334),表明小鼠在LPS造模后0.5 h单次给予NMN不能改善内毒素休克死亡率或减缓死亡速度。

      图  2  LPS造模后不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

    • 在LPS造模前0.5 h进行NMN给药。如图3所示,300 mg/kg NMN预防给药组小鼠首次出现死亡的时间稍早于生理盐水组,而2组死亡的总体趋势相近,前者的中位生存时间为83 h,后者为91 h,生存曲线比较无统计学差异(P=0.5946),故LPS造模前0.5 h给予300 mg/kg NMN不能改善内毒素休克小鼠的死亡率,不具有防治作用。

      图  3  LPS造模前300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响

      随后又进行多个不同剂量NMN单次预给药实验。如图4所示,NMN 30、100、300、600 mg/kg组与生理盐水组小鼠首次出现死亡的时间均相近,之后各组死亡趋势也类似,各组中位生存时间分别是:NMN给药组30 mg/kg为34 h、100 mg/kg为43 h、300 mg/kg为40 h、600 mg/kg为55 h,生理盐水组为37 h,各组生存曲线也无统计学意义。结果表明,在造模前进行NMN单次预给药对于LPS构建的内毒素休克模型无明显改善生存率的作用。

      图  4  LPS造模前不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    • 考虑到NMN在体内的代谢速度较快,能够迅速入血进入各个组织器官并代谢为活性分子NAD,而NAD被证明在多种炎症性疾病中具有保护作用,因此,观察NMN的2次给药是否对内毒素休克有治疗效果。

      图5所示,2次重复实验结果均表明,LPS造模后0.5 h和12 h,给予2次NMN(每次300 mg/kg)治疗组小鼠其首次出现死亡的时间早于生理盐水组;之后,NMN治疗组小鼠死亡速度明显快于对照组,且观察末期NMN治疗组小鼠存活率不及对照组一半,2次重复实验的生存曲线间均具有统计学差异(P=0.0404;P=0.0038)。因此,该结果表明,LPS造模后2次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。

      图  5  LPS造模后两次NMN给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=10)

    • 不同厂家生产的NMN因药物纯度、杂质成分不同等,可能导致治疗效果有差别。为排除非药物分子本身因素如厂家生产工艺因素,进一步明确上述NMN治疗内毒素休克的作用,接着引入另一厂家生产的NMN(以下均简称NMN~),并同时测试比较两家NMN产品治疗内毒素休克的效果。

      实验首先对LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)增加内毒素休克死亡率的作用进行了验证。如图6所示,NMN给药组和NMN~给药组这2组小鼠首次出现死亡的时间和观察末期小鼠存活数都接近,整个观察期小鼠死亡趋势非常相似,与生理盐水对照组相比,两组都明显加重内毒素休克小鼠的死亡率,与对照组的生存曲线间均有统计学差异(P=0.0499;P=0.0260)。3组中位生存时间分别是:NMN给药组57.5 h、NMN~给药组51.5 h、生理盐水组106.5 h。此外,该结果与上述单个NMN产品连续2次给药效果类似(图5)。因此,两家NMN产品效果基本相同,也进一步证明了LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN(每次300 mg/kg)确实可加重内毒素休克病情,加速小鼠的死亡。

      图  6  不同厂家NMN两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)

      最后,实验又考察了两家NMN产品预防给药效果,即在LPS造模前0.5 h进行NMN或NMN~给药。如图7所示,NMN组、NMN~组、生理盐水组3组小鼠首次出现死亡的时间及之后每组小鼠死亡的速度都相近,直至每组均剩20%小鼠存活(第71小时)。之后,生理盐水组小鼠不再死亡,而NMN组、NMN~组小鼠陆续死亡殆尽。3组中位生存时间分别是:NMN给药组40 h、NMN~给药组45 h、生理盐水组37 h。可见,两家NMN产品作用相似,对LPS所致的内毒素休克无治疗效果,且与生理盐水组比较时均有加重内毒素休克死亡率的趋势,但是均无统计学意义(P=0.6447;P=0.9725)。该结果与上述NMN单次预防给药的实验结果相一致(图3图4)。

      图  7  不同厂家NMN预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)

    • 目前NMN是保健品领域的开发热点,以抗衰老以及各类疾病治疗作用为目的,在国内外已有不少人开始服用NMN[14]。但是NMN对内毒素休克的作用尚未知,对患有这种疾病的患者能否服用NMN亦不清楚。

      根据现有的研究报道,NMN在小鼠疾病模型其腹腔注射给药的有效剂量为10~600 mg/kg[2, 4]。本实验中,我们测试了不同NMN剂量尤其是300 mg/kg时对小鼠内毒素休克的治疗效果,结果显示,小鼠在LPS造模后0.5 h或造模前0.5 h单次给予不同剂量NMN均无明显改善生存率的作用,不具有治疗效果;甚至在LPS造模后两次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。为排除厂家生产工艺等因素,我们又同时用两个厂家生产的NMN产品进行实验,以重复上述结果,最终再次证明LPS造模后两次给予NMN确实可加速小鼠的死亡,增加死亡率。

      因此,本次实验结果表明,NMN在某些疾病尚未证明其安全性的情况下,应谨慎推广,尤其是内毒素休克的患者,应慎用甚至是禁用NMN治疗。

参考文献 (14)

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