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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是一种经典辅酶，对线粒体电子转移反应至关重要，在许多生物学功能中起着关键作用[1]。烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD生物合成的关键中间体。NMN在心脑血管疾病、肝肾功能、血管和内皮功能，以及免疫和炎症、衰老等各类疾病治疗方面都具有相当强的潜力[2]，常被人称为“万能药”。NMN能够通过口服、静脉注射、腹腔注射（小鼠）等多种给药途径进入体内，通常具有较高的安全性。在急性毒性实验中，小鼠连续7 d给予最大灌胃剂量和饱和浓度的NMN，每天1次，耐受性良好，除血清丙氨酸氨基转移酶略有升高外，其余生物标志物基本保持不变，而相同处理条件下的比格犬，会有轻度的肌酐和尿酸升高[3]；在长期给药实验中，小鼠连续12个月给予100和300 mg/kg的NMN，均未出现不良反应[4]。在出血性休克治疗方面，对出血性休克大鼠模型，术前连续5 d的NMN饮水给药和术后静脉推注NMN均能缩短休克复苏时间和提高复苏后的存活率[5]。据报道[6-9]，在炎症治疗方面，NMN及相关代谢产物烟酰胺核糖、烟酰胺都具有一定抗炎作用。
内毒素休克是由感染引起的全身炎症反应综合征，会导致各系统衰竭，包括循环系统、呼吸系统、血液系统，损害肝脏和肾脏功能[10]。相关研究显示，最佳的治疗时间在发病6 h内，能够提高患者的生存率，降低病死率[11]。目前临床内毒素休克以药物治疗为主（如血管活性药物、激素、抗菌素等）[12]，同时辅以液体复苏、脑神经保护、吸氧等常规治疗。为便于对内毒素休克开展研究治疗，通常使用LPS进行内毒素休克动物造模，LPS是G-菌细胞壁外膜上的主要成分，也叫内毒素，能引起严重的炎症级联反应，是G-菌的主要致病成分之一[13]。
目前，NMN对内毒素休克的治疗作用尚未知。本研究旨在探究NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠模型的死亡率影响，为阐明NMN在内毒素休克治疗方面的作用提供线索。
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烟酰胺单核苷酸[NMN，纯度≥95%，−25～−15 ℃保存，邦泰生物工程（深圳）有限公司]；烟酰胺单核苷酸[NMN~，纯度≥95%，2～8 ℃保存，尚科生物医药（上海）有限公司]；脂多糖（LPS，美国Sigma公司）；BT25S精密电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；独立通风系统（上海鸣励实验室科技发展有限公司）。
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SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠(西普尔-必凯实验动物有限公司)。实验前在相对洁净的环境下使用独立通风系统，将动物适应性饲养2周。期间动物自由饮水、进食。笼具内温度22～26 ℃、湿度40%～70%，笼内维持正压20～25 Pa，每小时换气次数60～70次，室内明暗交替12 h（8:00～20:00照明）。
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根据不同实验目的，将C57BL/6J小鼠随机分为给药组和对照组。腹腔注射LPS（10 mg/kg）进行内毒素休克造模，在造模前或者造模后进行NMN腹腔注射给药，给药方式分为单次给药和两次给药方式。具体分成5个实验：①造模后0.5 h给药，剂量为10、30、100、300 mg/kg；②造模前0.5 h给药，剂量为30、100、300、600 mg/kg；③造模后0.5 h和12 h两次给药，每次300 mg/kg；④造模后0.5 h和12 h分别用2种不同厂家的NMN给药，剂量为300 mg/kg；⑤造模前0.5 h用不同厂家的NMN给药，剂量为300 mg/kg。
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使用Log-rank检验，对给药组和溶剂对照组的生存曲线进行比较，P<0.05为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism8软件对数据进行统计分析。
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如图1所示，LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN组小鼠首次出现死亡的时间比生理盐水组更早，整个观察期间给药组小鼠死亡的总体趋势要稍快于生理盐水组，且在观察末期存活的动物数量略少。但两组生存曲线之间比较无统计学差异（P=0.2161）。因此，LPS造模后0.5 h给予300 mg/kg NMN不具有治疗内毒素休克的作用，甚至有轻微增加内毒素休克死亡率的趋势。
图 1 LPS造模后300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=10）
实验进一步考察了LPS造模后0.5 h给予多个不同剂量NMN对内毒素休克死亡率的影响，如图2所示，与生理盐水组相比，10、30、100、300 mg/kg NMN给药组的小鼠首次出现死亡的时间均接近，各组中位生存时间：300、100、30、10 mg/kg给药组分别为51、55、41和38 h，生理盐水组为37 h。整个观察期间NMN给药各组死亡速度较生理盐水组稍缓，其中放缓趋势最明显的是100 mg/kg剂量组，但均不具有统计学意义（P=0.4334），表明小鼠在LPS造模后0.5 h单次给予NMN不能改善内毒素休克死亡率或减缓死亡速度。
图 2 LPS造模后不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=14）
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在LPS造模前0.5 h进行NMN给药。如图3所示，300 mg/kg NMN预防给药组小鼠首次出现死亡的时间稍早于生理盐水组，而2组死亡的总体趋势相近，前者的中位生存时间为83 h，后者为91 h，生存曲线比较无统计学差异（P=0.5946），故LPS造模前0.5 h给予300 mg/kg NMN不能改善内毒素休克小鼠的死亡率，不具有防治作用。
图 3 LPS造模前300 mg/kg NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响
随后又进行多个不同剂量NMN单次预给药实验。如图4所示，NMN 30、100、300、600 mg/kg组与生理盐水组小鼠首次出现死亡的时间均相近，之后各组死亡趋势也类似，各组中位生存时间分别是：NMN给药组30 mg/kg为34 h、100 mg/kg为43 h、300 mg/kg为40 h、600 mg/kg为55 h，生理盐水组为37 h，各组生存曲线也无统计学意义。结果表明，在造模前进行NMN单次预给药对于LPS构建的内毒素休克模型无明显改善生存率的作用。
图 4 LPS造模前不同剂量NMN单次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=15）
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考虑到NMN在体内的代谢速度较快，能够迅速入血进入各个组织器官并代谢为活性分子NAD，而NAD被证明在多种炎症性疾病中具有保护作用，因此，观察NMN的2次给药是否对内毒素休克有治疗效果。
如图5所示，2次重复实验结果均表明，LPS造模后0.5 h和12 h，给予2次NMN（每次300 mg/kg）治疗组小鼠其首次出现死亡的时间早于生理盐水组；之后，NMN治疗组小鼠死亡速度明显快于对照组，且观察末期NMN治疗组小鼠存活率不及对照组一半，2次重复实验的生存曲线间均具有统计学差异（P=0.0404；P=0.0038）。因此，该结果表明，LPS造模后2次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。
图 5 LPS造模后两次NMN给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响（n=10）
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不同厂家生产的NMN因药物纯度、杂质成分不同等，可能导致治疗效果有差别。为排除非药物分子本身因素如厂家生产工艺因素，进一步明确上述NMN治疗内毒素休克的作用，接着引入另一厂家生产的NMN（以下均简称NMN~），并同时测试比较两家NMN产品治疗内毒素休克的效果。
实验首先对LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN（每次300 mg/kg）增加内毒素休克死亡率的作用进行了验证。如图6所示，NMN给药组和NMN~给药组这2组小鼠首次出现死亡的时间和观察末期小鼠存活数都接近，整个观察期小鼠死亡趋势非常相似，与生理盐水对照组相比，两组都明显加重内毒素休克小鼠的死亡率，与对照组的生存曲线间均有统计学差异（P=0.0499；P=0.0260）。3组中位生存时间分别是：NMN给药组57.5 h、NMN~给药组51.5 h、生理盐水组106.5 h。此外，该结果与上述单个NMN产品连续2次给药效果类似（图5）。因此，两家NMN产品效果基本相同，也进一步证明了LPS造模后0.5 h和12 h的2次给予NMN（每次300 mg/kg）确实可加重内毒素休克病情，加速小鼠的死亡。
图 6 不同厂家NMN两次给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=14)
最后，实验又考察了两家NMN产品预防给药效果，即在LPS造模前0.5 h进行NMN或NMN~给药。如图7所示，NMN组、NMN~组、生理盐水组3组小鼠首次出现死亡的时间及之后每组小鼠死亡的速度都相近，直至每组均剩20%小鼠存活（第71小时）。之后，生理盐水组小鼠不再死亡，而NMN组、NMN~组小鼠陆续死亡殆尽。3组中位生存时间分别是：NMN给药组40 h、NMN~给药组45 h、生理盐水组37 h。可见，两家NMN产品作用相似，对LPS所致的内毒素休克无治疗效果，且与生理盐水组比较时均有加重内毒素休克死亡率的趋势，但是均无统计学意义（P=0.6447；P=0.9725）。该结果与上述NMN单次预防给药的实验结果相一致(图3和图4)。
图 7 不同厂家NMN预防给药对内毒素休克小鼠生存时间的影响(n=15)
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目前NMN是保健品领域的开发热点，以抗衰老以及各类疾病治疗作用为目的，在国内外已有不少人开始服用NMN[14]。但是NMN对内毒素休克的作用尚未知，对患有这种疾病的患者能否服用NMN亦不清楚。
根据现有的研究报道，NMN在小鼠疾病模型其腹腔注射给药的有效剂量为10～600 mg/kg[2, 4]。本实验中，我们测试了不同NMN剂量尤其是300 mg/kg时对小鼠内毒素休克的治疗效果，结果显示，小鼠在LPS造模后0.5 h或造模前0.5 h单次给予不同剂量NMN均无明显改善生存率的作用，不具有治疗效果；甚至在LPS造模后两次NMN给药明显增加小鼠内毒素休克死亡率。为排除厂家生产工艺等因素，我们又同时用两个厂家生产的NMN产品进行实验，以重复上述结果，最终再次证明LPS造模后两次给予NMN确实可加速小鼠的死亡，增加死亡率。
因此，本次实验结果表明，NMN在某些疾病尚未证明其安全性的情况下，应谨慎推广，尤其是内毒素休克的患者，应慎用甚至是禁用NMN治疗。
Effect of nicotinamide mononucleotide on mortality of mice with endotoxic shock
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摘要:
目的 探究烟酰胺单核苷酸（NMN）对脂多糖（LPS）诱导的内毒素休克小鼠死亡率的影响。 方法 将10周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分组，均腹腔注射LPS（10 mg/kg）造模。NMN腹腔注射给药，分为3种方式：①造模后0.5 h给药，剂量为10、30、100、300 mg/kg；②造模前0.5 h给药，剂量为30、100、300、600 mg/kg；③造模后0.5 h和12 h两次给药，每次300 mg/kg。观察记录每组小鼠的死亡情况，并绘制生存曲线。 结果 与溶剂对照组相比，造模后0.5 h或造模前0.5 h给予不同剂量NMN，均不能改善小鼠死亡率或延缓死亡时间；造模后0.5 h和12 h两次给予NMN会加速小鼠死亡，增加小鼠死亡率。两个厂家的NMN产品效果类似。 结论 NMN对LPS诱导的内毒素休克小鼠不具有治疗作用，小鼠内毒素休克发生后进行NMN多次给药会增加死亡率。 Abstract:Objective To study the effect of nicotinamide mononucleotide (NMN) on the mortality of the lipopoly-saccharide (LPS)-induced endotoxic shock mouse model. Methods 10-week-old C57BL/6J male mice were randomly divided into groups, and were injected intraperitoneally (i.p.) with LPS (10 mg/kg) to induce endotoxic shock models. NMN was i.p. injected in three ways: (1) 0.5 h after modeling, doses of 10, 30, 100 and 300 mg/kg; (2) 0.5 h before modeling, doses of 30, 100, 300 and 600 mg/kg; or (3) 0.5 and 12 h after modeling, dose of 300 mg/kg each time. The death times of each group were recorded, and the survival curves were drawn. Results Compared with the solvent control group, NMN at different doses given 0.5 h after or before modeling didn’t improve the survival rate or delay the death time of endotoxic shock mice; But when given at 0.5 and 12 h 300 mg/kg after modeling, NMN accelerated the death of mice and increased the mortality of mice. NMN products by two manufacturers showed similar effects. Conclusion NMN has no therapeutic effect on LPS-induced endotoxic shock, and repeated administration of NMN after endotoxic shock will increase the mortality. -
Key words:
- nicotinamide mononucleotide /
- lipopolysaccharide /
- endotoxic shock /
- mortality
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慢性脑缺血(CCI)是指各种原因引发的长期大脑血灌流量不足，在血管性痴呆和阿尔茨海默病等神经系统疾病的发展过程发挥重要作用[1-2]。长期慢性脑缺血会导致慢性神经炎症、海马自噬异常、脑部神经元凋亡[3-4]，为此，CCI已经严重威胁人类的健康。肠道被称为人类的“第二大脑”，肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠互动（即脑-肠轴）与机体的神经系统密切相关[5]。研究证明中枢系统疾病会导致肠道菌群失调[6]，患者发生脑卒中后，不仅会出现胃肠道并发症，还会发生肠道菌群失调，例如肠道菌群中的阿克曼菌属（Akkermansia）会发生变化[7]。同时，肠道菌群失调也推动了脑卒中等疾病的发展，文献报道厚壁菌门增加与认知功能损伤有一定的关联[8-9]。因此，肠道菌群参与了脑部神经系统疾病的进展。中药复方虎杖清脉饮是上海市著名中医脉管病专家奚九一教授数十年临床诊治经验的总结，临床上对辩证属“热郁毒聚，脉滞络痹”的脑小血管损伤疗效显著。有报道虎杖清脉饮通过调节p38和NF-κB信号通路，抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的损伤[10]，提示虎杖清脉饮具有抗炎和抗凋亡作用。然而，虎杖清脉饮对慢性脑缺血的治疗作用缺乏临床前研究，作用机制尚不清楚。因此，本实验研究虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠认知功能的影响，并基于肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为防治慢性脑缺血提供新的思路。
1. 材料
1.1 动物
24只C57BL/6J雄性小鼠(20±5) g，购自常州卡文斯实验动物有限公司（动物合格证号：202112546）。饲养于海军军医大学药学系动物房，饲养条件为温度（24 ± 2） ℃，相对湿度70 %，每天光照时间为08:00至20:00，自由进食饮水。所有操作均符合海军军医大学实验动物伦理要求。
1.2 药物及试剂
虎杖清脉饮由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供。由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎七味常用中药制备[10]。所有药品粉碎成粗粉，蒸馏水浸泡，煮沸2次，每次40 min，合并滤液，浓缩至0.675 g/ml。银杏叶提取物由上海阿拉丁生物化学技术有限公司提供。
1.3 仪器与设备
Morris 水迷宫（上海奥尔科特生物科技有限公司）；组织脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；倒置生物显微镜（日本尼康）；病理切片机（上海俫卡仪器有限公司）；DYY-6C 型核酸电泳仪、ND2000 型光度计、9700 型PCR 仪、Quantus™型高灵敏荧光计、Miseq PE300测序平台（美吉生物公司）。
2. 方法
2.1 双侧颈总动脉狭窄模型（BCAS）的建立及动物分组
24只小鼠适应性饲养7 d后，随机分为4组：假手术组、模型组、阳性药组（银杏叶提取物）、虎杖清脉饮组，每组6只。小鼠腹腔注射1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）麻醉，并暴露颈总动脉(CCAs)。在体视显微镜下，将微型弹簧圈(钢丝直径0.08 mm，线圈内径0.18 mm，螺距0.5 mm，总长度2.5 mm)螺旋旋转固定在双侧颈总动脉上致颈总动脉狭窄使脑慢性灌注不足，建立BCAS模型。然后缝合手术部位，并对术后小鼠进行护理，直到它们意识清醒。造模6 w后，各组开始进行灌胃给药12 w。阳性药组给予银杏叶提取物（GBE）30 mg/kg，虎杖清脉饮组（HZQMY）给予虎杖清脉饮13.5 mg/kg，假手术组（Sham）和模型组（BCAS）给予等量生理盐水处理。
2.2 水迷宫实验
Morris水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第6 d的空间探索实验。定位航行实验：主要用于测试小鼠的空间学习能力。实验历时5 d，每天每只小鼠训练3次。训练时随机选择一个象限开始，按顺时针方向训练3次。每次将该象限的池壁中点作为入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，尽量保持每次入水方式的一致，减少人为影响。小鼠每次分别从不同象限入水寻找逃逸平台，若小鼠找到登上平台，并停留5 s以上，则计时结束，水迷宫装置自动记录小鼠从入水到寻台成功的时间，即为逃避潜伏期。如果在60 s后仍未登上平台，计时也将停止，将小鼠人为引上平台休息1 min，且当次的逃避潜伏期记录为60 s。
空间探索实验：主要用于测试小鼠的空间记忆能力。在定位航行实验结束的第2d，撤除平台，选择与第四象限最远的第二象限池壁中点为小鼠入水点，将小鼠面向池壁轻轻放入池中，使小鼠自由游泳60 s并记录这60 s内小鼠在原平台的停留时间、穿过原平台所在位置的次数作为判断小鼠空间记忆能力差异的指标。
2.3 LFB染色
治疗结束后，每组各取6只小鼠，用1 %戊巴比妥钠（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，4 %多聚甲醛灌注后，取脑石蜡包埋，切片，厚度5 μm，用于LFB(Luxol Fast Blue stain)染色。将石蜡切片常规脱蜡至水，加入LFB染色液于60 ℃烤箱染色3 h。95 %乙醇洗去多余染色液，蒸馏水冲洗。Luxol分化液分化15 s，70 %乙醇分色。重复分化步骤，直至胼胝体和皮质之间形成鲜明对比。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下采集图片。
2.4 肠道菌群测序分析
末次给药后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，处死方法符合动物福利伦理要求，无菌条件下取盲肠内容物，置于液氮中速冻保存。送至美吉生物技术股份有限公司进行DNA提取，合格样品进一步进行高通量测序。
2.5 数据处理与分析
运用美吉生物信息云（https://cloud.majorbio.com/）进行数据的处理，利用美吉生信云UParse软件（v7.0.1090）进行OTU（operational taxonomic units）分析、Alpha多样性分析、稀释曲线分析；利用美吉生信云tax_summary_a文件夹中的数据表和R语言（version 3.3.1）工具统计和作图进行物种组成分析；利用Qiime计算Beta多样性距离矩阵；利用美吉生信云进行线性判别分析（LEfSe），计算多级物种之间的差异。
2.6 统计分析
采用统计软件SPSS 19.0、GraphPad 9.0进行分析。符合正态分布的计量数据以（
$\bar{x}$ ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA)。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。3. 结果
3.1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响
如图1A所示，假手术组小鼠从水迷宫实验第1 d开始到第5 d，逃避潜伏期在不断减少。而模型组小鼠随天数的增加，找到平台的时长并没有明显缩短，并且与假手术组相比，第4天和第5天逃避潜伏期有显著性差异（P<0.05），各给药组小鼠逃避潜伏期在逐渐减少，第5天阳性药组、虎杖清脉饮组与模型组之间的逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。如图1B所示，模型组小鼠的跨越平台次数显著少于假手术组（P<0.01）。而虎杖清脉饮组的跨越平台次数显著大于模型组（P<0.01）。如图1C所示，模型组小鼠的目标象限百分比显著少于假手术组（P<0.05），阳性药组和虎杖清脉饮组的目标象限百分比均显著大于模型组（P<0.05），提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的学习记忆能力。如图1D所示，假手术组中，小鼠胼胝体的LFB染色，髓鞘排列整齐，无水肿、碎裂及空泡的形成。模型组，LFB着色浅，髓鞘崩解，部分髓鞘空泡化。经银杏叶提取物和虎杖清脉饮治疗，髓鞘病变减轻，染色加深，提示虎杖清脉饮可以改善慢性脑缺血小鼠的白质损伤。
图 1 虎杖清脉饮对小鼠学习记忆能力和白质损伤的影响（n=6，$ \bar{x} $ ±s）Sham-假手术组；BCAS-模型组；GBE-阳性药组；HZQMY-虎杖清脉饮组（下同）A.小鼠的逃避潜伏期；B.平台穿越次数；C.目标象限百分比；D. 小鼠脑组织 LFB染色；* P <0.05，** P <0.01，与假手术比较；# P <0.05，## P <0.01，与模型组比较3.2 小鼠肠道菌群物种注释与评估
各组小鼠肠道菌群优化后序列数目为964830，碱基数目为398083175，平均长度为412 bp，序列长度分布在400~440 bp内。图2A为3组小鼠肠道微生物等级丰度曲线，从丰度曲线可以看到各组在缓慢平稳下降，说明各组小鼠肠道菌群物种丰富度高并且分布均匀。图2B、2C所示，总物种曲线可分析样本包含的物种总和，共享物种曲线可分析样本共享物种数目，本研究各组总数目和共享项目增加或减少趋势均逐步减缓并趋于平坦，表明各组样本量满足评估物种丰富度和核心物种数的要求。
3.3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析
如图3A、3B、3C所示，丰富度实际观测值指数、物种丰富度ACE指数和物种丰富度Chao1指数可解释生物群落丰富度。相较于假手术组，模型组小鼠肠道菌群丰富度显著下降（P<0.05）；相较于模型组，虎杖清脉饮组肠道菌群丰富度显著升高（P<0.05），说明虎杖清脉饮可以提升模型组小鼠肠道菌群的丰富度。如图3D所示，3组小鼠肠道菌群的Shannon均匀度测量指数无明显差异。综上，模型组慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度明显下降，虎杖清脉饮可提升慢性脑缺血小鼠菌群的物种丰富度。
图 3 各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分析（n=6，$ \bar{{x}} $ ±s）A .丰富度实际观测值指数；B. 物种丰富度ACE指数；C. 物种丰富度Chao1指数；D. Shannon均匀度测量指数；* P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.4 小鼠肠道菌群Beta多样性分析
通过主成分分析（PCA）各组小鼠样本菌群群落组成差异，运用反差分解，在图中通过距离反映不同组之间的组成差异，如样本物种组成越相似，反映在主成分分析图中的距离越近。假手术组和模型组聚集在一起，说明模型组对肠道菌群的影响较小。而虎杖清脉饮组与模型组距离较远，说明慢性脑缺血小鼠肠道菌群改变较小，虎杖清脉饮具有调控模型组小鼠肠道菌群组成的作用（图4）。
3.5 小鼠肠道菌群物种组成及差异分析
3.5.1 基于门水平差异性分析
门水平上，3组小鼠肠道中占主导地位的微生物主要有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、放线菌门（Actinobacteriota），其中后壁菌门和拟杆菌门为优势门类（图5A）。由图5B所示，各组小鼠肠道菌群中髌骨细菌门
和弯曲菌门丰度有显著性差异（P<0.05）。如图5C所示，相较于假手术组，模型组疣微菌门丰度显著升高（P<0.05）。如图5D所示，相较于模型组，虎杖清脉饮组小鼠的疣微菌门丰度显著降低（P<0.05），髌骨细菌门丰度显著增加（P<0.05）。门水平差异性分析显示，慢性脑缺血小鼠疣微菌门丰富度增加；虎杖清脉饮降低慢性脑缺血小鼠疣微菌门和增加髌骨细菌门的群落丰度。 
图 5 各组小鼠肠道菌群门水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度； B.各组样本门水平群落丰度差异；C. Sham组与BCAS组菌门群落丰度差异；D. BCAS组与HZQMY组菌门群落丰度差异；* P<0.05，与假手术比较；# P<0.05，与模型组比较3.5.2 基于属水平差异性分析
属水平上，3组小鼠肠道中优势菌为毛螺菌科_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae和乳杆菌属(Lactobacillus)等（图6A）。如图6B所示，3组小鼠的肠道菌群中，阿克曼菌属（Akkermansia）、绿脓杆菌（Turicibacter）、嗜木聚糖真杆菌属（Eubacterium_xylanoPhilum_group）、异杆菌属（Allobaculum）、丹毒荚膜菌属（Erysipelatoclostridium）、回肠杆菌（Ileibacterium）、乳酸球菌属（Lactococcus）群落丰度具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。如图6C所示，与假手术组相比，模型组阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著上升（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著下降（P<0.05，P<0.01）。如图6D所示，与模型组相比，虎杖清脉饮组的阿克曼菌属、丹毒荚膜菌属丰度显著下降（P<0.05）；嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、回肠杆菌和乳酸球菌属丰度显著上升（P<0.05，P<0.01）。
图 6 各组小鼠肠道菌群属水平组成及差异分析（n=6，$ \bar{x} $ ±s）A.各组样本的优势物种及其相对丰度；B.各组样本属水平群落丰度差异；C.假手术组与模型组菌属群落丰度差异；D.模型组与虎杖清脉饮组菌属群落丰度差异；* P<0.05，**P<0.01，与假手术比较；# P<0.05，## P<0.01，与模型组比较3.6 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析
如表1所示，LEfSe可以检测各组之间存在显著丰度差异特征。相较于假手术组，模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、疣微菌目（o_Verrucomicrobiales）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）等相对丰度显著上调；嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）、罗氏菌属（g_Roseburia）、回肠杆菌属（g_Ileibacterium）等相对丰度显著下调，表明慢性脑缺血小鼠上述肠道菌群丰度发生显著性变化。
表 1 各组小鼠肠道菌群LEfSe多级物种差异判别分析菌群 模型组vs
假手术组虎杖清脉饮组vs
模型组疣微菌门（P_Verrucomicrobiota） ↑ ↓ 疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae） ↑ ↓ 疣微菌目（o_Verrucomicrobiales） ↑ ↓ 克里斯滕菌目（o_Christensenellales） ↑ 阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae） ↑ ↓ 克里斯滕菌科（f_Christensenellaceae） ↑ 粪芽孢菌属（g_Coprobacillus） ↑ ↓ 阿克曼菌属（g_Akkermansia） ↑ ↓ 嗜胆菌属（g_Bilophila） ↑ 克里斯滕菌属
（g_Christensenellaceae_R-7_group）↑ 丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium） ↑ ↓ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↓ 罗氏菌属（g_Roseburia） ↓ 未分类克里斯滕森菌科（g_unclassified_f_Christensenellaceae） ↓ 异杆菌属（g_Allobaculum） ↓ ↑ 理研菌属（g_Rikenella） ↓ 绿脓杆菌属（g_Turicibacter） ↓ ↑ g_Tyzzerella ↓ 回肠杆菌属（g_Ileibacterium） ↓ 蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia） ↓ f_Tannerellaceae ↓ f_norank_o_Chloroplas ↓ g_norank_f_norank_o_Chloroplast ↓ 副杆菌属（g_Parabacteroides） ↓ o_PeptostrePtococcales-Tissierellales ↑ 髌骨细菌门（P_Patescibacteria） ↑ c_Saccharimonadia ↑ o_Saccharimonadales ↑ f_Saccharimonadaceae ↑ 丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae） ↑ 消化链球菌科（f_Peptostreptococcaceae） ↑ g_Candidatus_Saccharimonas ↑ g_UCG-005 ↑ g_Romboutsia ↑ 嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group） ↑ g_norank_f_Atopobiaceae ↑ 安德克氏菌属（g_Adlercreutzia） ↑ 分节丝状菌属（g_Candidatus_Arthromitus） ↑ g_Lachnospiraceae_UCG-006 ↑ g_NK4A214_group ↑ 注：↑表示相对丰度增加，↓表示相对丰度降低。 相较于模型组，虎杖清脉饮组疣微菌纲（c_Verrucomicrobiae）、蓝细菌纲（c_Cyanobacteriia）、疣微菌门（P_Verrucomicrobiota）、阿克曼菌科（f_Akkermansiaceae）、阿克曼菌属（g_Akkermansia）、粪芽孢菌属（g_Coprobacillus）、丹毒荚膜菌属（g_Erysipelatoclostridium）、副杆菌属（g_Parabacteroides）等相对丰度显著下调；丹毒丝菌科（f_Erysipelotrichaceae）、消化链球菌科（f_PeptostrePtococcaceae）、绿脓杆菌属（g_Turicibacter）、异杆菌属（g_Allobaculum）、嗜木聚糖真杆菌属（g_Eubacterium_xylanophilum_group）等相对丰度显著上调。说明虎杖清脉饮通过调节嗜木聚糖真杆菌属、异杆菌属、绿脓杆菌、疣微菌、阿克曼菌和丹毒荚膜菌的丰度，达到治疗慢性脑缺血的治疗作用。
4. 讨论
慢性脑缺血会损害脑血管，导致患者身体残疾、认知障碍或抑郁样行为。慢性脑缺血(CCI)被认为是血管性痴呆的一个病理生理标志[1-2]，它是血管认知障碍(VCI)最严重的阶段和形式，与推理、学习和记忆方面的问题有关[11-12]。
近年来，大量的研究展示了肠道微生物对人体的生长发育有重要作用，当肠道微生物失调时，可能造成神经功能缺陷，进而出现神经退行性疾病[13-14]。肠道微生物参与周围神经系统和中枢神经系统的双向调节，并通过脑-肠轴调节参与机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，进而影响多种神经系统疾病的发生[15-16]。研究显示，神经类疾病如阿尔兹海默症、抑郁症、帕金森疾病等都存在宿主肠道菌群紊乱的现象，并且发现肠道菌群能通过神经内分泌和自主神经实现脑-肠信号转导，从而参与调节宿主的神经-内分泌-免疫网络，影响宿主的情绪、认知或行为改变[17]。
虎杖清脉饮由虎杖、垂盆草、豨莶草、连翘、黄芪、鸡血藤和川芎组成，虎杖为君药，《药性论》曰：“虎杖，压一切热毒”。虎杖性味苦，寒，在方中起清热解毒、凉血祛瘀的功效。虎杖对神经具有保护作用，如虎杖苷可通过调控lncRNA-MALAT1发挥脑微血管内皮细胞保护作用；虎杖苷可以激活SIRT1信号通路减轻大鼠创伤性脑损伤[18]。连翘[19]、垂盆草及豨莶草[20-21]共为臣药。连翘味苦，微寒，属于清热解毒药，《医学衷中参西录》：连翘具升浮宣散之力，可流通气血。垂盆草味甘、淡，性凉，豨莶草性味辛、苦，寒，二者具有清热解毒，祛风通络之功。三药联用助虎杖清热解毒，又能增强通络的作用。鸡血藤[22]、黄芪共为方中佐药。鸡血藤温而不烈，活血祛瘀兼有补血功效；黄芪甘温，具有益气扶正之功，治久病气虚。三者可治血瘀气虚兼症，并能制君药和臣药苦寒，保护脾胃。川芎[23]辛温，既能祛风，又能行气活血，引诸药上行巅顶，为佐而兼使之用。其中的川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯等[24-25]化学成分有明显脑保护作用。诸药合用，共奏清热解毒、活血通络之功。本研究通过减少颈总动脉的血流量，成功建立慢性脑缺血小鼠的模型。
通过水迷宫实验和LFB染色表明虎杖清脉饮对小鼠慢性脑缺血具有保护作用，从肠道菌群的角度观察发现慢性脑缺血将会导致小鼠菌群的物种的丰富度有所下降，并且其中疣微菌门、阿克曼菌属和丹毒荚膜菌属相对丰度上升，而嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度下降；虎杖清脉饮具有增加小鼠肠道菌群物种丰富度的作用，以及回调因为慢性脑缺血而导致菌属变化的作用。阿克曼菌隶属于疣微菌门，是肠道微生物中唯一一个来自疣微菌门的细菌。阿克曼菌[26] 是一种以肠黏膜层中的黏蛋白为食，降解黏蛋白和黏液层。当艾克曼菌异常增加时，会导致肠道屏障的受损，进而诱发肠道炎症和LPS大量进入血液影响其他脏器。有相关文献报道[27] ，在中风患者的肠道艾克曼菌中异常增长。同时，丹毒荚膜菌[28]的丰度也随着帕金森患者胃肠功能障碍增加而增加，这与我们的实验结果相符。嗜木聚糖真杆菌和异杆菌[29-30] 属于短链脂肪酸产生菌，短链脂肪酸[31-32] 可以降低肠道的通透性以及加强肠道屏障的防御力，调节免疫细胞趋化性、活性氧（ROS）释放以及细胞因子释放而具有抗炎功能，短链脂肪酸也可以促进脑内海马神经的发生和延长。虎杖清脉饮减少阿克曼菌属的相对丰度；增加嗜木聚糖真杆菌属和异杆菌属的相对丰度，进而维持肠道屏障功能的完整性，降低机体内的炎症反应，保护血脑屏障[5]。综上所述，虎杖清脉饮对慢性脑缺血小鼠的治疗作用与其对慢性脑缺血小鼠肠道菌群失调的改善作用具有相关性。
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