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河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的天然毒素，其选择性作用于电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs），可强效阻滞神经、肌肉兴奋传导，导致神经和肌肉的麻痹，甚至死亡[1]。基于VGSCs在体内的广泛分布和作用，TTX的药用价值也备受关注，尤其在麻醉、镇痛、戒断等方面，一直是研究的热点[2-6]。TTX对多种疼痛尤其是炎性疼痛和神经病理性疼痛表现出优异的镇痛效果，临床试验也表明，TTX在治疗无法控制的中、重度癌症相关疼痛方面有良好的疗效，且不会产生耐药性和成瘾性，具有较好的应用前景[7-8]。然而，目前对TTX的急性镇痛研究较少，有报道认为TTX对急性疼痛的镇痛效应较弱[7,9]。但也有研究表明，TTX在小鼠甩尾实验、醋酸扭体实验中有显著镇痛效应。为明确TTX的急性镇痛效应，本研究拟通过4种急性疼痛模型，即扭体实验、福尔马林刺激实验、热板实验和甩尾实验，进一步评估TTX对急性疼痛的镇痛效果，为其安全、合理应用提供实验支持。
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ICR小鼠，体重18～22 g，Wistar大鼠，雄性，体重150～180 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物合格证号：SCXK（京）2019-0008。动物经适应性饲养4～7 d后开始进行实验。
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TTX（批号：E2011088，上海阿拉丁试剂有限公司）；盐酸吗啡（批号：20110601，青海制药厂有限公司）；花生四烯酸检测试剂盒（批号：202101，江苏雨桐生物科技有限公司）；冰醋酸（批号：C10309476，上海麦克林生化科技有限公司）；甲醛溶液（福尔马林，批号：030430，北京化学试剂公司）。
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DK-S28型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；YLS-6B智能热板仪（济南益延科技发展有限公司）；5424R型离心机（德国Eppendorf公司）；Synergy HTX酶标仪（美国BioTeK公司）。
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小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只，实验前禁食12 h，自由饮水。给药组分别肌内注射0.5、1、2、4、8 μg/kg的TTX或1 mg/kg吗啡，对照组肌内注射等体积的生理盐水，给药后40 min，小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液（0.1 ml/10 g），记录15 min内的扭体次数，以小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起等行为为扭体反应阳性。计算各组疼痛抑制率，公式为：
$$\begin{array}{c} {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) =\\ \displaystyle\frac{{{\text{生理盐水平均扭体数}} - {\text{给药平均扭体数}}}}{{\text{生理盐水平均扭体数}}} \times 100\% \end{array} $$ -
受试大鼠进行“疼痛反应累积分值”预筛实验，试验时，在大鼠左后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50 μl后，分别观察1 ～10 min（Ⅰ相）和10 ～40 min（Ⅱ相）内大鼠的疼痛反应。表现为舔、咬、抖足为3分，提足为2分，轻触地面但不负重行走时跛行为1分，正常负重，行走自如为0分。记录各时间段出现上述各级反应的秒数乘以相应反应的分值，以乘积之和为疼痛反应累积分值，公式为：疼痛反应累积分值＝跛行时间×1+提足时间×2+舔咬抖足时间×3。选择累积分值评分相近的动物进行实验。
动物恢复7 d，然后重新分组，每组10只，进行正式实验，给药组分别肌内注射0.5 ～8 μg/kg的TTX或1 mg/kg吗啡，对照组注射等体积生理盐水，给药40 min后，在大鼠右后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50 μl，再次观察I相和II相疼痛反应，并计算各组的疼痛反应累积分值和疼痛抑制率。疼痛抑制率计算公式为：
$$\begin{array}{c} {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) =\\ \displaystyle \frac{{{\text{生理盐水组疼痛反应均值}} - {\text{给药组疼痛反应均值}}}}{{\text{生理盐水组疼痛反应均值}}} \times 100\% \end{array}$$ -
受试动物均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠尾下部垂直浸入（52±0.5）℃的恒温水浴中，浸入长度为3 cm左右，以尾回缩出水面的潜伏期为测痛指标，给药前间隔5 min测定2次，以其均值作为基础痛阈。选择基础痛阈相近（3～7 s）的动物作为合格动物进行实验。筛选后动物恢复24 h，重新分成7组，每组10只，进行正式实验。小鼠肌内注射TTX（0.5～8 μg/kg）、吗啡（1 mg/kg）或等体积生理盐水，给药后40 min，进行痛阈测定，间隔5 min测定2次，以其均值作为给药后痛阈。为防止尾部烫伤，若痛阈超过14 s则停止水浴，以14 s计算。疼痛抑制率计算公式为：
$$ {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) = \frac{{{\text{给药后痛阈}} - {\text{基础痛阈}}}}{{14 - {\text{基础痛阈}}}} \times 100\% $$ -
受试小鼠为雌性，均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠放在预热至（55±0.5）℃金属板上，恒温，以小鼠舔足反应或跳跃反应的潜伏期为痛阈指标。每只动物测定间隔5 min，测定2次，取其平均值作为基础痛阈值。选择基础痛阈相近（5～20 s）的小鼠进行正式试验。筛选后小鼠恢复24 h以上，重新分为7组，每组10只，进行正式实验。小鼠肌内注射TTX（0.5～8 μg/kg）、吗啡（1 mg/kg）或等体积生理盐水，给药40 min后，进行痛阈测定。间隔5 min测定2次，以其均值作为给药后痛阈值。为防止足部烫伤，若痛阈值超过40 s则停止测定，以40 s计算。疼痛抑制率计算公式为：
$$ {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) = \frac{{{\text{给药后痛阈}} - {\text{基础痛阈}}}}{{40 - {\text{基础痛阈}}}} \times 100\% $$ -
为进一步阐明TTX对醋酸扭体和福尔马林疼痛模型的镇痛机制，进行血清相关炎性介质的测定。将小鼠分为5组：空白对照组（只注射生理盐水），醋酸对照组（肌内注射生理盐水40 min后，腹腔注射0.6%的醋酸），TTX组（肌内分别注射1、2、8 μg/kg TTX 40 min后，腹腔注射0.6%的醋酸），每组10只，待测定镇痛效应后，小鼠眼眶取血；大鼠分组参照小鼠，注射生理盐水或TTX 40 min后足底注射福尔马林，待测定镇痛效应后，眼内眦取血；血液静置30 min后，3 000 r/min离心15 min，取上清液，用花生四烯酸Elisa试剂盒测定血清中花生四烯酸含量。
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实验数据以（
$\bar x $ ±s）表示。用SPSS15.0统计分析软件进行统计学处理，组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）和t检验，以P<0.05为差异有显著性。 -
0.6%的醋酸可诱导小鼠扭体反应，15 min内平均扭体次数为（35.1±9.8）次，如图1所示。1 mg/kg盐酸吗啡显著抑制醋酸诱导的扭体反应，0.5～8 μg/kg的TTX呈剂量依赖性地降低醋酸诱导的小鼠扭体次数，最高抑制率约为81.26%。TTX抑制醋酸诱导疼痛效应的半数效应剂量（ED50）为1.51 μg/kg，95%置信区间（CI）为1.16 ～1.93 μg/kg，表明TTX对醋酸诱导的小鼠扭体疼痛模型具有较好的镇痛效果。
图 1 TTX对醋酸诱导小鼠扭体反应的抑制作用（
$ \bar x $ ±s，n=10） -
TTX 4 μg/kg和8 μg/kg剂量组对福尔马林致大鼠Ⅰ相疼痛反应累积分值与生理盐水组相比有显著差异（P<0.01），当TTX给药剂量为2～8 μg/kg 时，对福尔马林致大鼠Ⅱ相疼痛反应累积分值与阴性对照组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01)（图2）。结果表明，吗啡及TTX对福尔马林致大鼠Ⅰ相、Ⅱ相疼痛反应均有明显的镇痛作用，TTX的最高疼痛抑制率分别为85.58%、88.05%。TTX抑制福尔马林致大鼠Ⅰ相、Ⅱ相疼痛反应的ED50值（95% CI）分别为4.12 μg/kg（3.22～5.25 μg/kg）、4.00 μg/kg（2.18 ～9.12 μg/kg）。
图 2 TTX对福尔马林诱导大鼠疼痛的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10） -
图3结果显示，1 mg/kg吗啡显著延长小鼠的甩尾时间，TTX在0.5～8 μg/kg的剂量范围，1 μg/kg镇痛效果达峰值，最高疼痛抑制率仅为25.0%，随着给药剂量增加，其镇痛效应并未提高，表明TTX对小鼠甩尾疼痛模型的镇痛效应较弱。
图 3 TTX对小鼠甩尾疼痛模型的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10） -
吗啡可显著延长小鼠热板时间（P<0.01），TTX在0.5 ～8 μg/kg的给药剂量范围，0.5 μg/kg剂量组与给药前相比无显著性差异，其余各剂量组可明显增加小鼠的痛阈值（P<0.05或P<0.01）（图4），但疼痛抑制率最高仅为19.79%，镇痛效应偏低，表明TTX对小鼠热板疼痛模型的镇痛效应较弱。
图 4 TTX对小鼠热板疼痛模型的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10）将4种模型计算得到的疼痛抑制率作图，如图5所示，TTX对动物扭体及福尔马林疼痛模型具有较好的镇痛效果，疼痛抑制率可达80%以上。在甩尾和热板模型上，TTX虽表现出一定的镇痛效果，但疼痛抑制率较低，整体镇痛效果偏弱。
图 5 TTX对4种疼痛模型的量效关系曲线
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对动物血清测定结果显示，与正常空白对照小鼠对比，腹腔注射0.6%的醋酸可显著提高血清中炎性介质花生四烯酸的水平（P<0.01），然而，TTX各剂量组血清花生四烯酸含量与醋酸对照组（TTX 0 μg/kg剂量组）比较，未有显著改变（P>0.05）。2.5%的福尔马林能显著升高大鼠血清花生四烯酸的含量（P<0.05），但TTX各剂量组未表现出对花生四烯酸的显著抑制作用（图6）。
图 6 TTX对醋酸（A）和福尔马林（B）诱导的花生四烯酸释放量的影响（
$\bar x $ ±s，n=10） -
目前，机体内已发现9种VGSCs亚型（Nav1.1～Nav1.9），根据对TTX的敏感性，又分为TTX敏感型钠通道和TTX非敏感型钠通道。其中Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7属于TTX敏感型钠通道，纳摩尔浓度的TTX即可抑制其电流。因此，TTX是已知毒性最大的神经毒素之一，其小鼠口服、皮下注射和腹腔注射的半数致死剂量分别为532、12.5和10.7 μg/kg，对人类的毒性剂量尚不明确[9]。本研究中应用的TTX剂量为0.5～8 μg/kg，各剂量组肌内注射后未观察到明显不良反应，且实验过程中及实验后14 d内无动物死亡。目前，报道的与疼痛相关的TTX敏感型钠通道有Nav1.1、Nav1.7、Nav1.3。近期的一项研究发现，激活脊根神经节Nav1.1通道会提升机械超敏小鼠的疼痛行为，且不会引起神经炎症[10]。Nav1.3通道参与外周和中枢神经系统对各种损伤的疼痛信号传导，应用Nav1.3反义核苷酸降低通道的表达，会减轻大鼠和小鼠的坐骨神经和脊髓损伤的疼痛反应[11-12]。Nav1.7通道在疼痛敏感性形成方面起重要作用，炎症反应如各种损伤、截肢或外科手术，导致Nav1.7的过度表达，Nav1.7基因敲除的小鼠对机械和热创伤性疼痛痛阈降低[2]。
TTX对多种疼痛尤其是炎症性疼痛和神经病理性疼痛的镇痛效应得到了广泛验证。低剂量TTX可显著降低脊神经结扎动物的疼痛行为，剂量依赖性地抑制角叉菜胶引起的机械性痛觉过敏、热痛觉过敏以及化疗药物诱导的神经病理性疼痛[7, 9]。近期研究也发现，TTX可有效抑制辣椒素等刺激诱发的内脏痛[13]。然而，TTX在急性疼痛治疗效果方面存在较大争议。本研究与其他研究结果都显示，TTX可有效抑制醋酸诱导的小鼠扭体次数[14-16]。Marcil等[16]的研究表明，TTX腹腔注射不能抑制福尔马林诱导的大鼠Ⅰ相疼痛反应，且只有高剂量TTX（6 μg/kg）显著抑制Ⅱ相疼痛反应。而徐英等[15]研究通过肌内注射TTX，可显著降低2.5%福尔马林注射后5 min内的疼痛反应。本研究结果也表明，TTX对福尔马林刺激引起的Ⅰ相和Ⅱ相疼痛均有较强的镇痛作用。
TTX对两种模型镇痛作用的机制可能与TTX的炎性疼痛抑制作用相关。小鼠扭体模型中，腹腔注射醋酸可刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积较长时间的炎性疼痛；足底皮下注射福尔马林引起的反应分为2个时相：0～10 min出现者为Ⅰ相（早期相），10 ～60 min出现的反应为Ⅱ相（迟发相）。Ⅰ相反应主要是刺激C纤维所致，Ⅱ相反应有炎症机制参与[17]。因此，为进一步明确TTX的镇痛效应与化学物质导致的炎性疼痛是否相关，本研究进行了血清花生四烯酸的测定，结果显示，醋酸和福尔马林均能显著提高动物血清中的花生四烯酸的水平，表明两者诱导的疼痛反应有炎性机制参与，但TTX并不能降低血清花生四烯酸水平，推测其可能是通过阻断炎性介质介导的疼痛反应产生镇痛效果，但不抑制炎性介质的产生或释放。
在急性物理性疼痛方面，虽然有研究显示TTX对热板和甩尾模型具有一定镇痛效应，但对两种模型的镇痛效应不一致，可能与足底和尾部的神经分布数量、类型差异相关[14]。然而，也有报道表明，皮下注射1～6 μg/kg TTX对热刺激、冷刺激及机械刺激导致的急性疼痛的抑制作用并不明显[18-20]。本研究发现，TTX通过肌内注射途径给药，对小鼠热板和甩尾疼痛模型镇痛效应较弱，TTX可能对热刺激引起的急性疼痛的镇痛作用较弱，但此结论还需要通过更多的给药途径和疼痛模型进一步验证和阐明。
本研究分别通过化学诱导和物理刺激方法，建立了4种急性疼痛模型并评估TTX的镇痛作用，结果表明TTX对醋酸和福尔马林诱导的化学诱导疼痛模型具有良好的镇痛效果，其作用可能与阻断化学物质诱导的炎性疼痛相关；而对热诱导（热板和热水）的物理刺激疼痛模型的镇痛效果较弱。本研究结果为TTX的安全、合理应用提供了进一步的实验支持。
Comparative study on analgesic effect of tetrodotoxin in four acute pain models
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摘要:
目的 评估河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）对4种急性疼痛模型的镇痛效果，为其合理应用提供实验支持。 方法 动物肌内注射1 mg/kg盐酸吗啡或不同剂量TTX，TTX剂量为0、0.5、1、2、4、8 μg/kg，给药后40 min，分别进行醋酸扭体实验、福尔马林刺激实验、热板实验和甩尾实验，记录动物疼痛反应或痛阈，计算疼痛抑制率；取动物血清，Elisa法测定花生四烯酸含量。 结果 盐酸吗啡对4种急性疼痛模型均有显著镇痛效应；TTX可减少醋酸诱导的小鼠扭体次数，降低福尔马林诱导的大鼠I相和II相疼痛反应，对两种疼痛模型的最高疼痛抑制率均达到80.00%以上；TTX在甩尾实验和热板实验中有一定的镇痛作用，最高疼痛抑制率分别为25.00%、19.79%。醋酸和福尔马林均能导致动物血清花生四烯酸升高，但是TTX对花生四烯酸无显著抑制作用。 结论 TTX对醋酸和福尔马林诱导的化学性刺激疼痛模型具有良好的镇痛效果，而对热诱导（热板和热水）的物理性刺激疼痛模型的镇痛效果较弱，TTX可能通过阻断炎性介质介导的疼痛反应产生镇痛效果。 Abstract:Objective To evaluate the analgesic effect of tetrodotoxin (TTX) in four types of acute pain models and provide experimental support for its rational application. Methods Mice or rats were intramuscularly pretreated with morphine (1 mg/kg) or TTX (0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 μg/kg) 40 min before acetic acid writhing test, formalin stimulation test, hot plate test or tail flick test. Pain response or pain threshold were recorded, and inhibition rate was calculated during the tests. The arachidonic acid of serum was determined by Elisa. Results Significant analgesic effects were observed with morphine in all four acute pain models. TTX dose-dependently reduced the number of writhing induced by acetic acid and inhibited the pain response induced by formalin during phase I and phase II, with the highest inhibition rate of more than 80.00% in two pain models. TTX showed analgesic effect in tail flick test and hot plate test, with the highest inhibition rate of 25.00% and 19.79%, respectively. Both acetic acid and formalin increased arachidonic acid in animal serum, but TTX had no significant inhibitory effect on the releasing of arachidonic acid. Conclusion TTX showed significant analgesic effect in the chemical stimulation pain models induced by acetic acid and formalin, but limited analgesic effect was observed on the physical stimulation pain model induced by heat (hot plate and hot water). TTX may produce analgesic effect by blocking the inflammatory mediators mediating pain response. -
Key words:
- tetrodotoxin /
- morphine hydrochloride /
- analgesic effect /
- acute pain models
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皮肤是人体最大的器官，日常生活中难免受到损伤形成伤口，如轻微的皮肤擦伤、割伤和烧伤等。对于日常的小伤口，一般可以任其自愈，但若稍不注意沾水或接触外界细菌，则容易造成感染，影响伤口愈合，甚至造成溃烂。我们常用的创面处理方法有：使用创可贴覆盖；双氧水或碘伏消毒处理；纱布包扎等。这些处理方法存在着防水透气性差、撕除时疼痛和使用不便等问题。20世纪60年代，Winter博士的研究证实了湿润的伤口环境有助于上皮组织更快的形成，并以此为依据提出了“湿性愈合”的概念[1]。这一研究提高了人们对伤口护理的认识，也为研发封闭敷料奠定了基础。由于传统的敷料不能在伤口处使用较长时间，也不能为伤口愈合提供一个湿润的环境，因此，各种高科技的湿性疗法的伤口护理产品层出不穷。在日本及美国等发达国家，出现以硝化纤维为主要材料的新型创伤敷料[2-4]，可用于密封小型伤口甚至保护烧伤创面。此类创伤敷料在使用前为液体形态，涂抹在伤口后有机溶剂迅速挥发，短时间覆盖伤口形成保护膜，具有防水、杀菌、预防伤口感染等优点[5-7]。本研究拟以市售小林液体创可贴为基础，以硝化纤维为膜材，优化处方，制备一种性能更为优良的液体创伤敷料。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Shimadzu HS-20气相色谱仪（日本Shimadzu公司）；拉力试验机（上海和晟仪器有限公司）；AL204型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；D2400型纯水/超纯水一体机（美国明澈公司）；25型无极调速电动搅拌机（江苏江阴科技器械厂）。
1.2 试药
小林液体创可贴（日本小林制药株式会社）；硝化纤维（衡水东方化工有限公司）；蓖麻油、樟脑、苯甲醇、乙酸丁酯、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（均为国药集团化学试剂有限公司）；棕榈酸异丙酯（IPP，青岛优索化学科技有限公司）；乙酸乙酯（上海联试试剂有限公司）。
2. 方法与结果
2.1 市售产品小林液体创可贴中苯甲醇含量及溶剂组成的测定
2.1.1 苯甲醇的含量测定
采用高效液相色谱法测定，色谱条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱：ODS-C18色谱柱；流动相：甲醇-水（50∶50 V/V）；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：40 ℃；检测波长：257 nm。
标准曲线的绘制：精密称定苯甲醇对照品151.3 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度；精密量取上述溶液1、2、2.5、3、4 ml于25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定244.3 mg市售产品于50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，苯甲醇对照品及市售产品均在5.87 min附近有峰且峰型良好。标准曲线回归方程为：Y = 13040X + 212.7 (r=0.999)；经计算得市售产品苯甲醇的使用量为4.0%。
2.1.2 溶剂组成的测定
采用气相色谱法测定，色谱条件：采用 HS-20气相色谱仪；色谱柱：DB-624毛细管柱；载气：H2 50 ml/min；空气450 ml/min；进样量：1 μl；柱温：40 ℃/min持续3 min，10 ℃程序升温至200 ℃，持续1 min；检测器温度：250 ℃；气化室温度：220 ℃；FID检测器。
标准曲线的绘制：精密称定异丙醇1.0077 g，乙酸乙酯0.9933 g，乙酸丁酯1.0014 g于100 ml容量瓶中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合均匀，用DMF稀释至刻度。分别取上述溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 ml置于25 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定1.186 0 g市售产品于100 ml容量品中，加入适量的DMF超声溶解，用DMF稀释至刻度，精密量取1 ml上述液体于10 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，异丙醇对照品及市售产品均在6.84 min附近有峰且峰型良好，乙酸乙酯对照品及市售产品均在9.25 min附近有峰且峰型良好，乙酸丁酯对照品及市售产品均在14.07 min附近有峰且峰型良好；苯甲醇标准曲线、乙酸乙酯标准曲线和乙酸丁酯标准曲线的回归方程分别为：
Y = 20152X + 2.692， r=1.000
Y = 15311X + 33.45 ，r=0.999
Y = 24428X – 17.33， r=0.999
经计算得市售产品中异丙醇的使用量为35.1%，乙酸乙酯的使用量为21.4%，乙酸丁酯的使用量为5.3%。即三者使用比例为：6.6∶4∶1。
2.2 液体创伤敷料及敷料薄膜的制备
2.2.1 液体创伤敷料的制备方法
采用硝化纤维（4%~8%）作为成膜材料，蓖麻油（1%~9%）为增塑剂，苯甲醇（4%）为抑菌剂，棕榈酸异丙酯（IPP，2%）为皮肤柔润剂，樟脑（0.3%）为芳香剂，以异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯（三者比例为6.6∶4∶1）作为溶剂制备创伤敷料。制备方法如下：于50 ml烧杯中精密称定处方量蓖麻油、苯甲醇、IPP、樟脑，加入上述3种混合溶剂使混合均匀，加入处方量硝化纤维，密封静置过夜待硝化纤维充分溶解，过夜后搅拌使硝化纤维混合均匀，超声除气泡即得。
2.2.2 敷料薄膜的制备方法
精密称定2 g按“2.2.1”项制备的液体创伤敷料，加入20 ml乙酸乙酯稀释使之混合均匀、黏度下降并充分溶解。将此液体置于90 mm培养皿中待溶剂挥干后可见均一透明无色薄膜。所制薄膜外观如图1所示。
2.3 评价指标的确立
按照中华人民共和国医药行业标准YY/T 0471-2004对直接接触类创伤敷料，进行舒适性、防水性、透气性的考察。舒适性考察主要为考察敷料薄膜的抗张强度及断点伸长百分率[8-9]；防水性考察薄膜的防水能力；透气性考察薄膜的水蒸气透过率（MVTR）[10]。抗张强度及断点伸长百分率的考察运用拉伸试验机，并采用公式1、公式2进行计算；防水性的考察采用倒杯法，记录24 h后的重量差异，如图2所示，以公式3进行计算；MVTR的考察方法：在西林瓶中加入蒸馏水，用薄膜覆盖密封，使水液面距薄膜（5±1）mm，置干燥器中，记录24 h后的重量差异，以公式4进行计算。
$$ {\text{抗张强度}}= {\rm{F}}/{\rm{S}}\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\;\;\;\;\; $$ (1) $$ {\text{断点伸长百分率}} = {{\rm{L}}_{{\rm{max}}}}/{{\rm{L}}_{\rm{o}}} \times 100 {\text%} $$ (2) $$ {\text{水分损失率}}= \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/{{\rm{M}}_{\rm{W}}}\quad\;\;\; $$ (3) $$ {\text{水蒸气透过率}} = \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/\left( {{\rm{s}} \times t} \right) $$ (4) 式中，F为拉伸力；S为薄膜面积；Lmax为拉伸最大距离；L0为初始膜长；M0为初始西林瓶重量；M24h为24 h后西林瓶重量；MW为西林瓶内水重量；s为瓶口面积；t为时间24 h。
2.4 硝化纤维用量的考察
分别采用4%、6%、8%的硝化纤维制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，其断点伸长百分率、防水性能考察的水透过率及MVTR值随着硝化纤维用量的增加呈下降趋势，抗张强度随着硝化纤维用量的增加呈上升趋势。其考察结果如图3~图6所示：
由图3、图4可知，硝化纤维的用量为4%、6%时，断点伸长百分率在170%以上，可认为薄膜韧性较好，在伤口表面有较好的舒适性，而硝化纤维用量为8%时，其断点伸长百分率较低，不足150%；在硝化纤维用量为4%时，所制薄膜过薄，导致其抗张强度较差，不及2.0 MPa。从图5可知，MVTR值在0.3~0.6 mg/(cm2·h)之间，随硝化纤维用量增加而减小，但均具有一定的透气性；由图6可知，三个不同梯度的硝化纤维在24 h内其水损失率均在2.5%以下，可认为防水性良好。综上考察结果，本次采用的硝化纤维用量为6%。
2.5 蓖麻油用量的考察
确定硝化纤维使用量为6%后，分别采用1%、5%、9%用量的蓖麻油制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，由图7、图8可知，其断点伸长百分率随蓖麻油用量增加呈上升趋势，在蓖麻油使用量为1%时断点伸长百分率较差，不及150%，在5%~9%上升趋势明显且在蓖麻油用量为9%时达到190%，断点伸长百分率值数据较为理想；抗张强度随蓖麻油用量未呈明显下降趋势，反而是在蓖麻油使用量为5%时具有最大的抗张强度，而伸长率较好的9%用量蓖麻油处方抗张强度明显较小，在2.5 MPa左右，故蓖麻油用量选用浓度为5%。
关于蓖麻油对防水性能和透气性能的影响如图9、图10所示，蓖麻油用量为1%时其MVTR值明显高于5%和9%时，且其水损失率也高于5%和9%时，由于5%与9%的防水性没有太大的差异。由此可以得出的结论是，随着蓖麻油的加入，创伤敷料的透气性变差，同时其防水性能却有所增强，1%用量蓖麻油透气性能极佳，但机械性能及防水性相对较差，又因其水损失率24 h也没有达到5%，也可以认为其防水性能良好。所以下一步的考察尽量满足透气性的需求。
综合断点伸长百分率、抗张强度、MVTR值、水损失率，在保证机械强度的同时尽量满足其透气性的要求。拟在1%~5%之间再另设梯度进行考察。拟定蓖麻油使用量为2%、3%、4%时对上述指标再行考察。
由图11、图12可知处方断点伸长百分率及抗张强度在1%~5%范围内随蓖麻油用量的增加总体上均有一定的上升趋势。断点伸长百分率在蓖麻油用量为1%、2%时相差不大，在2%~5%时有明显的上升趋势；抗张强度在蓖麻油用量1%、2%时和4%、5%时相差不大，在蓖麻油用量从2%~4%时有明显的上升趋势。
由图13、图14可知在蓖麻油用量为1%~5%范围内MVTR值及水损失率随处方中蓖麻油用量的增加而呈下降趋势。
综合以上几个因素对处方中的蓖麻油用量进行考察，从所制薄膜的机械性能来看，在蓖麻油用量为1%~3%时，断点伸长百分率不及160%，抗张强度较差，不及3.60 MPa，故此用量不予考虑，从所制薄膜的防水透气效果来看，4%、5%用量均有一定的透气效果，且防水性测试结果显示二者水损失率均不超过2.50%。综上考虑，确定蓖麻油的使用量为4%。
3. 讨论
本文对市售产品的抑菌剂含量及溶剂组成进行了分析，以此作为基础对自制的液体创伤敷料进行单因素考察，确定了硝化纤维的最终用量为6%，蓖麻油的使用量为4%，所成薄膜具有良好的机械性能，具有透气性的同时又有着良好的防水效果。硝化纤维为主要的成膜材料，其用量对几个评价指标均有影响，其主要原因是其使用量的不同可造成所成薄膜的厚度不同，即创伤敷料薄膜厚度与硝化纤维用量成正比，其膜的厚度必然影响各项指标性能。蓖麻油作为增塑剂，对处方的影响主要在于：蓖麻油的加入能改变硝化纤维聚合物链之间的结构，使链与链之间的作用力产生变化从而在一定程度上影响薄膜的塑性。其次，蓖麻油的加入，可能堵塞了硝化纤维薄膜的纳米孔道，故呈现出其用量增加透气性能下降的趋势。
皮肤创伤，在临床和日常生活中都较为常见，伤口愈合的速度一定程度上取决于创伤表面环境，创伤表面环境需保持一定的潮湿性，即湿润表面可以加速伤口愈合，因此良好的创伤敷料，应具有一定的透气性，对于日常伤口来说，由于伤口表面的复杂，使用在创伤表面的敷料也应具有一定的机械性能。本实验主要探讨了硝化纤维和蓖麻油的用量对创伤敷料性能的影响，为下一步制备性能更加优良的创伤敷料提供研究基础。
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