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河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的天然毒素，其选择性作用于电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels，VGSCs），可强效阻滞神经、肌肉兴奋传导，导致神经和肌肉的麻痹，甚至死亡[1]。基于VGSCs在体内的广泛分布和作用，TTX的药用价值也备受关注，尤其在麻醉、镇痛、戒断等方面，一直是研究的热点[2-6]。TTX对多种疼痛尤其是炎性疼痛和神经病理性疼痛表现出优异的镇痛效果，临床试验也表明，TTX在治疗无法控制的中、重度癌症相关疼痛方面有良好的疗效，且不会产生耐药性和成瘾性，具有较好的应用前景[7-8]。然而，目前对TTX的急性镇痛研究较少，有报道认为TTX对急性疼痛的镇痛效应较弱[7,9]。但也有研究表明，TTX在小鼠甩尾实验、醋酸扭体实验中有显著镇痛效应。为明确TTX的急性镇痛效应，本研究拟通过4种急性疼痛模型，即扭体实验、福尔马林刺激实验、热板实验和甩尾实验，进一步评估TTX对急性疼痛的镇痛效果，为其安全、合理应用提供实验支持。
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ICR小鼠，体重18～22 g，Wistar大鼠，雄性，体重150～180 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物合格证号：SCXK（京）2019-0008。动物经适应性饲养4～7 d后开始进行实验。
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TTX（批号：E2011088，上海阿拉丁试剂有限公司）；盐酸吗啡（批号：20110601，青海制药厂有限公司）；花生四烯酸检测试剂盒（批号：202101，江苏雨桐生物科技有限公司）；冰醋酸（批号：C10309476，上海麦克林生化科技有限公司）；甲醛溶液（福尔马林，批号：030430，北京化学试剂公司）。
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DK-S28型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；YLS-6B智能热板仪（济南益延科技发展有限公司）；5424R型离心机（德国Eppendorf公司）；Synergy HTX酶标仪（美国BioTeK公司）。
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小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只，实验前禁食12 h，自由饮水。给药组分别肌内注射0.5、1、2、4、8 μg/kg的TTX或1 mg/kg吗啡，对照组肌内注射等体积的生理盐水，给药后40 min，小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液（0.1 ml/10 g），记录15 min内的扭体次数，以小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起等行为为扭体反应阳性。计算各组疼痛抑制率，公式为：
$$\begin{array}{c} {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) =\\ \displaystyle\frac{{{\text{生理盐水平均扭体数}} - {\text{给药平均扭体数}}}}{{\text{生理盐水平均扭体数}}} \times 100\% \end{array} $$ -
受试大鼠进行“疼痛反应累积分值”预筛实验，试验时，在大鼠左后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50 μl后，分别观察1 ～10 min（Ⅰ相）和10 ～40 min（Ⅱ相）内大鼠的疼痛反应。表现为舔、咬、抖足为3分，提足为2分，轻触地面但不负重行走时跛行为1分，正常负重，行走自如为0分。记录各时间段出现上述各级反应的秒数乘以相应反应的分值，以乘积之和为疼痛反应累积分值，公式为：疼痛反应累积分值＝跛行时间×1+提足时间×2+舔咬抖足时间×3。选择累积分值评分相近的动物进行实验。
动物恢复7 d，然后重新分组，每组10只，进行正式实验，给药组分别肌内注射0.5 ～8 μg/kg的TTX或1 mg/kg吗啡，对照组注射等体积生理盐水，给药40 min后，在大鼠右后肢足趾部皮下注射2.5%的福尔马林溶液50 μl，再次观察I相和II相疼痛反应，并计算各组的疼痛反应累积分值和疼痛抑制率。疼痛抑制率计算公式为：
$$\begin{array}{c} {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) =\\ \displaystyle \frac{{{\text{生理盐水组疼痛反应均值}} - {\text{给药组疼痛反应均值}}}}{{\text{生理盐水组疼痛反应均值}}} \times 100\% \end{array}$$ -
受试动物均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠尾下部垂直浸入（52±0.5）℃的恒温水浴中，浸入长度为3 cm左右，以尾回缩出水面的潜伏期为测痛指标，给药前间隔5 min测定2次，以其均值作为基础痛阈。选择基础痛阈相近（3～7 s）的动物作为合格动物进行实验。筛选后动物恢复24 h，重新分成7组，每组10只，进行正式实验。小鼠肌内注射TTX（0.5～8 μg/kg）、吗啡（1 mg/kg）或等体积生理盐水，给药后40 min，进行痛阈测定，间隔5 min测定2次，以其均值作为给药后痛阈。为防止尾部烫伤，若痛阈超过14 s则停止水浴，以14 s计算。疼痛抑制率计算公式为：
$$ {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) = \frac{{{\text{给药后痛阈}} - {\text{基础痛阈}}}}{{14 - {\text{基础痛阈}}}} \times 100\% $$ -
受试小鼠为雌性，均进行“基础痛阈”预筛实验，实验时，将小鼠放在预热至（55±0.5）℃金属板上，恒温，以小鼠舔足反应或跳跃反应的潜伏期为痛阈指标。每只动物测定间隔5 min，测定2次，取其平均值作为基础痛阈值。选择基础痛阈相近（5～20 s）的小鼠进行正式试验。筛选后小鼠恢复24 h以上，重新分为7组，每组10只，进行正式实验。小鼠肌内注射TTX（0.5～8 μg/kg）、吗啡（1 mg/kg）或等体积生理盐水，给药40 min后，进行痛阈测定。间隔5 min测定2次，以其均值作为给药后痛阈值。为防止足部烫伤，若痛阈值超过40 s则停止测定，以40 s计算。疼痛抑制率计算公式为：
$$ {\text{疼痛抑制率}}\left( \% \right) = \frac{{{\text{给药后痛阈}} - {\text{基础痛阈}}}}{{40 - {\text{基础痛阈}}}} \times 100\% $$ -
为进一步阐明TTX对醋酸扭体和福尔马林疼痛模型的镇痛机制，进行血清相关炎性介质的测定。将小鼠分为5组：空白对照组（只注射生理盐水），醋酸对照组（肌内注射生理盐水40 min后，腹腔注射0.6%的醋酸），TTX组（肌内分别注射1、2、8 μg/kg TTX 40 min后，腹腔注射0.6%的醋酸），每组10只，待测定镇痛效应后，小鼠眼眶取血；大鼠分组参照小鼠，注射生理盐水或TTX 40 min后足底注射福尔马林，待测定镇痛效应后，眼内眦取血；血液静置30 min后，3 000 r/min离心15 min，取上清液，用花生四烯酸Elisa试剂盒测定血清中花生四烯酸含量。
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实验数据以（
$\bar x $ ±s）表示。用SPSS15.0统计分析软件进行统计学处理，组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）和t检验，以P<0.05为差异有显著性。 -
0.6%的醋酸可诱导小鼠扭体反应，15 min内平均扭体次数为（35.1±9.8）次，如图1所示。1 mg/kg盐酸吗啡显著抑制醋酸诱导的扭体反应，0.5～8 μg/kg的TTX呈剂量依赖性地降低醋酸诱导的小鼠扭体次数，最高抑制率约为81.26%。TTX抑制醋酸诱导疼痛效应的半数效应剂量（ED50）为1.51 μg/kg，95%置信区间（CI）为1.16 ～1.93 μg/kg，表明TTX对醋酸诱导的小鼠扭体疼痛模型具有较好的镇痛效果。
图 1 TTX对醋酸诱导小鼠扭体反应的抑制作用（
$ \bar x $ ±s，n=10） -
TTX 4 μg/kg和8 μg/kg剂量组对福尔马林致大鼠Ⅰ相疼痛反应累积分值与生理盐水组相比有显著差异（P<0.01），当TTX给药剂量为2～8 μg/kg 时，对福尔马林致大鼠Ⅱ相疼痛反应累积分值与阴性对照组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01)（图2）。结果表明，吗啡及TTX对福尔马林致大鼠Ⅰ相、Ⅱ相疼痛反应均有明显的镇痛作用，TTX的最高疼痛抑制率分别为85.58%、88.05%。TTX抑制福尔马林致大鼠Ⅰ相、Ⅱ相疼痛反应的ED50值（95% CI）分别为4.12 μg/kg（3.22～5.25 μg/kg）、4.00 μg/kg（2.18 ～9.12 μg/kg）。
图 2 TTX对福尔马林诱导大鼠疼痛的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10） -
图3结果显示，1 mg/kg吗啡显著延长小鼠的甩尾时间，TTX在0.5～8 μg/kg的剂量范围，1 μg/kg镇痛效果达峰值，最高疼痛抑制率仅为25.0%，随着给药剂量增加，其镇痛效应并未提高，表明TTX对小鼠甩尾疼痛模型的镇痛效应较弱。
图 3 TTX对小鼠甩尾疼痛模型的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10） -
吗啡可显著延长小鼠热板时间（P<0.01），TTX在0.5 ～8 μg/kg的给药剂量范围，0.5 μg/kg剂量组与给药前相比无显著性差异，其余各剂量组可明显增加小鼠的痛阈值（P<0.05或P<0.01）（图4），但疼痛抑制率最高仅为19.79%，镇痛效应偏低，表明TTX对小鼠热板疼痛模型的镇痛效应较弱。
图 4 TTX对小鼠热板疼痛模型的镇痛作用（
$\bar x $ ±s，n=10）将4种模型计算得到的疼痛抑制率作图，如图5所示，TTX对动物扭体及福尔马林疼痛模型具有较好的镇痛效果，疼痛抑制率可达80%以上。在甩尾和热板模型上，TTX虽表现出一定的镇痛效果，但疼痛抑制率较低，整体镇痛效果偏弱。
图 5 TTX对4种疼痛模型的量效关系曲线
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对动物血清测定结果显示，与正常空白对照小鼠对比，腹腔注射0.6%的醋酸可显著提高血清中炎性介质花生四烯酸的水平（P<0.01），然而，TTX各剂量组血清花生四烯酸含量与醋酸对照组（TTX 0 μg/kg剂量组）比较，未有显著改变（P>0.05）。2.5%的福尔马林能显著升高大鼠血清花生四烯酸的含量（P<0.05），但TTX各剂量组未表现出对花生四烯酸的显著抑制作用（图6）。
图 6 TTX对醋酸（A）和福尔马林（B）诱导的花生四烯酸释放量的影响（
$\bar x $ ±s，n=10） -
目前，机体内已发现9种VGSCs亚型（Nav1.1～Nav1.9），根据对TTX的敏感性，又分为TTX敏感型钠通道和TTX非敏感型钠通道。其中Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7属于TTX敏感型钠通道，纳摩尔浓度的TTX即可抑制其电流。因此，TTX是已知毒性最大的神经毒素之一，其小鼠口服、皮下注射和腹腔注射的半数致死剂量分别为532、12.5和10.7 μg/kg，对人类的毒性剂量尚不明确[9]。本研究中应用的TTX剂量为0.5～8 μg/kg，各剂量组肌内注射后未观察到明显不良反应，且实验过程中及实验后14 d内无动物死亡。目前，报道的与疼痛相关的TTX敏感型钠通道有Nav1.1、Nav1.7、Nav1.3。近期的一项研究发现，激活脊根神经节Nav1.1通道会提升机械超敏小鼠的疼痛行为，且不会引起神经炎症[10]。Nav1.3通道参与外周和中枢神经系统对各种损伤的疼痛信号传导，应用Nav1.3反义核苷酸降低通道的表达，会减轻大鼠和小鼠的坐骨神经和脊髓损伤的疼痛反应[11-12]。Nav1.7通道在疼痛敏感性形成方面起重要作用，炎症反应如各种损伤、截肢或外科手术，导致Nav1.7的过度表达，Nav1.7基因敲除的小鼠对机械和热创伤性疼痛痛阈降低[2]。
TTX对多种疼痛尤其是炎症性疼痛和神经病理性疼痛的镇痛效应得到了广泛验证。低剂量TTX可显著降低脊神经结扎动物的疼痛行为，剂量依赖性地抑制角叉菜胶引起的机械性痛觉过敏、热痛觉过敏以及化疗药物诱导的神经病理性疼痛[7, 9]。近期研究也发现，TTX可有效抑制辣椒素等刺激诱发的内脏痛[13]。然而，TTX在急性疼痛治疗效果方面存在较大争议。本研究与其他研究结果都显示，TTX可有效抑制醋酸诱导的小鼠扭体次数[14-16]。Marcil等[16]的研究表明，TTX腹腔注射不能抑制福尔马林诱导的大鼠Ⅰ相疼痛反应，且只有高剂量TTX（6 μg/kg）显著抑制Ⅱ相疼痛反应。而徐英等[15]研究通过肌内注射TTX，可显著降低2.5%福尔马林注射后5 min内的疼痛反应。本研究结果也表明，TTX对福尔马林刺激引起的Ⅰ相和Ⅱ相疼痛均有较强的镇痛作用。
TTX对两种模型镇痛作用的机制可能与TTX的炎性疼痛抑制作用相关。小鼠扭体模型中，腹腔注射醋酸可刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积较长时间的炎性疼痛；足底皮下注射福尔马林引起的反应分为2个时相：0～10 min出现者为Ⅰ相（早期相），10 ～60 min出现的反应为Ⅱ相（迟发相）。Ⅰ相反应主要是刺激C纤维所致，Ⅱ相反应有炎症机制参与[17]。因此，为进一步明确TTX的镇痛效应与化学物质导致的炎性疼痛是否相关，本研究进行了血清花生四烯酸的测定，结果显示，醋酸和福尔马林均能显著提高动物血清中的花生四烯酸的水平，表明两者诱导的疼痛反应有炎性机制参与，但TTX并不能降低血清花生四烯酸水平，推测其可能是通过阻断炎性介质介导的疼痛反应产生镇痛效果，但不抑制炎性介质的产生或释放。
在急性物理性疼痛方面，虽然有研究显示TTX对热板和甩尾模型具有一定镇痛效应，但对两种模型的镇痛效应不一致，可能与足底和尾部的神经分布数量、类型差异相关[14]。然而，也有报道表明，皮下注射1～6 μg/kg TTX对热刺激、冷刺激及机械刺激导致的急性疼痛的抑制作用并不明显[18-20]。本研究发现，TTX通过肌内注射途径给药，对小鼠热板和甩尾疼痛模型镇痛效应较弱，TTX可能对热刺激引起的急性疼痛的镇痛作用较弱，但此结论还需要通过更多的给药途径和疼痛模型进一步验证和阐明。
本研究分别通过化学诱导和物理刺激方法，建立了4种急性疼痛模型并评估TTX的镇痛作用，结果表明TTX对醋酸和福尔马林诱导的化学诱导疼痛模型具有良好的镇痛效果，其作用可能与阻断化学物质诱导的炎性疼痛相关；而对热诱导（热板和热水）的物理刺激疼痛模型的镇痛效果较弱。本研究结果为TTX的安全、合理应用提供了进一步的实验支持。
Comparative study on analgesic effect of tetrodotoxin in four acute pain models
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摘要:
目的 评估河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）对4种急性疼痛模型的镇痛效果，为其合理应用提供实验支持。 方法 动物肌内注射1 mg/kg盐酸吗啡或不同剂量TTX，TTX剂量为0、0.5、1、2、4、8 μg/kg，给药后40 min，分别进行醋酸扭体实验、福尔马林刺激实验、热板实验和甩尾实验，记录动物疼痛反应或痛阈，计算疼痛抑制率；取动物血清，Elisa法测定花生四烯酸含量。 结果 盐酸吗啡对4种急性疼痛模型均有显著镇痛效应；TTX可减少醋酸诱导的小鼠扭体次数，降低福尔马林诱导的大鼠I相和II相疼痛反应，对两种疼痛模型的最高疼痛抑制率均达到80.00%以上；TTX在甩尾实验和热板实验中有一定的镇痛作用，最高疼痛抑制率分别为25.00%、19.79%。醋酸和福尔马林均能导致动物血清花生四烯酸升高，但是TTX对花生四烯酸无显著抑制作用。 结论 TTX对醋酸和福尔马林诱导的化学性刺激疼痛模型具有良好的镇痛效果，而对热诱导（热板和热水）的物理性刺激疼痛模型的镇痛效果较弱，TTX可能通过阻断炎性介质介导的疼痛反应产生镇痛效果。 Abstract:Objective To evaluate the analgesic effect of tetrodotoxin (TTX) in four types of acute pain models and provide experimental support for its rational application. Methods Mice or rats were intramuscularly pretreated with morphine (1 mg/kg) or TTX (0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 μg/kg) 40 min before acetic acid writhing test, formalin stimulation test, hot plate test or tail flick test. Pain response or pain threshold were recorded, and inhibition rate was calculated during the tests. The arachidonic acid of serum was determined by Elisa. Results Significant analgesic effects were observed with morphine in all four acute pain models. TTX dose-dependently reduced the number of writhing induced by acetic acid and inhibited the pain response induced by formalin during phase I and phase II, with the highest inhibition rate of more than 80.00% in two pain models. TTX showed analgesic effect in tail flick test and hot plate test, with the highest inhibition rate of 25.00% and 19.79%, respectively. Both acetic acid and formalin increased arachidonic acid in animal serum, but TTX had no significant inhibitory effect on the releasing of arachidonic acid. Conclusion TTX showed significant analgesic effect in the chemical stimulation pain models induced by acetic acid and formalin, but limited analgesic effect was observed on the physical stimulation pain model induced by heat (hot plate and hot water). TTX may produce analgesic effect by blocking the inflammatory mediators mediating pain response. -
Key words:
- tetrodotoxin /
- morphine hydrochloride /
- analgesic effect /
- acute pain models
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骨质疏松症是一种全身性骨代谢疾病，其典型特征是骨密度下降、骨脆性增加和骨微环境被破坏[1]。骨稳态失衡是其发生的主要病理学基础。骨稳态是指成骨细胞行使的骨形成功能和破骨细胞行使的骨吸收功能处在一个相对平衡的过程[2]。破骨细胞分化及其功能的过度活化是导致骨稳态失衡的重要因素[3]。中国骨质疏松症流行病学调查显示，我国50岁以上人群骨质疏松发病率为19.2%，65岁以上人群发病率为32%[4]。目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂，其在抑制骨吸收的同时，也干扰骨形成进程。因而发掘更好的治疗骨质疏松的药物是迫切需要的。
骨髓来源的巨噬细胞(BMMs)向破骨细胞分化需要重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的持续刺激[5]。M-CSF增加了早期BMMs的增殖，RANKL与受体RANK结合激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，进而激活细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)和NF-κB抑制物激酶(IKKs)，活化的ASK1和IKKs磷酸化JNK、ERK和P38以及NF-κB特异性抑制因子IκB特定部位的丝氨酸，激活MAPK和NF-κB信号。活化的MAPK和NF-κB使c-Fos、NFATc1表达增加，促进DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK等破骨细胞特异性基因的转录与表达，导致破骨细胞分化[6]。研究表明，减弱破骨细胞分化及功能，能够有效地治疗骨质疏松症[7]。
冬虫夏草是一味传统中药，有增强免疫、抗炎、抗氧化和延缓衰老等作用[8]。先前的研究表明，富含锶的冬虫夏草菌丝发酵液对去卵巢骨质疏松大鼠有良好的治疗效果，其机制是提高了血清中的雌二醇水平，但是该研究仅基于整体水平解释了冬虫夏草作用于骨质疏松症的机制，对冬虫夏草的菌种也未作鉴定，并且野生的冬虫夏草提取液在骨质疏松症中的作用也未见报道[9-11]。本研究旨在探讨冬虫夏草提取液(CSE)对去卵巢小鼠的治疗作用以及对破骨细胞分化和功能的影响，为CSE防治骨质疏松症提供实验依据。
1. 材料
1.1 动物
SPF级雌性C57BL/6小鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司），12周龄24只，6周龄7只，体质量20～22 g，合格证号：SCXK（沪）2018-0006。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批号JZLLSC2019-0194），且遵循中国伦理委员会指导原则。
1.2 试剂
α-MEM培养基（美国Hyclone，批号：SH30265.01）；胎牛血清（美国Gbico，批号：10099-141）；重组小鼠RANKL、M-CSF蛋白（美国R&D，批号：462-TEC-010、416-ML-010）；TRAP染色试剂盒（浙江卓腾生物公司）；RNAiso Plus、TB Green（日本Takara，批号：9109、RR420B）；p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38、P38和GAPDH兔单克隆抗体（美国CST，批号：4668、9252、4370、4695、4511、8690、5174）；山羊抗兔IgG H&L (IRDye® 800CW)预吸附二抗（美国Abcam，批号：ab216773）；冬虫夏草（上海雷允上药业有限公司）；羟基磷灰石涂板/96孔板（美国Corning，批号：3989）；小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素、骨碱性磷酸酶ELISA试剂盒（上海生工，批号：D721140、D721126、D721049）。
1.3 仪器
371型细胞培养箱（美国Thermo）；Cytation 5多功能酶标仪（美国Bio-Tek）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）；SA型近红外双色激光成像系统（美国odyssey）；TI-SR型倒置显微镜（日本Nikon）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰）。
2. 方法
2.1 CSE制备
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)药材产地为青海玉树，购自上海雷允上药业有限公司，经海军军医大学黄宝康教授鉴定。提取详情见引文[12]。
2.2 BMMs分离与培养
选取6周龄C57BL/6小鼠，使用颈椎脱臼法处死，取双侧股骨和胫骨，使用PBS将骨髓从骨髓腔中冲出，收集PBS并离心，弃上清液，使用α-MEM培养基重悬，于T75培养瓶内（含10%血清，1%青霉素-链霉素溶液及30 ng/ml M-CSF完全培养基）培养3 d。使用PBS清洗去除未贴壁细胞，加入适量新鲜完全培养基，直至细胞数量达到5×106个[13]。
2.3 CCK-8法检测BMMs细胞活性
在96孔板中，BMMs以8×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/ml CSE干预处理，培养48 h或96 h，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h后在波长480 nm处检测吸光度。
2.4 体外破骨细胞分化实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，阴性对照组不加入RANKL；每2 d更换一次培养基，直至第5天对破骨细胞进行TRAP染色。
将同样密度的BMMs接种于96孔板，孵育过夜；记过夜后为第1天，分别于第1、3、5天加入1 mg/ml CSE干预处理，每2 d更换一次培养基至第7天（仅加药1次，之后更换培养基均不加CSE），进行TRAP染色[14]。
2.5 F-actin环染色和骨吸收实验
在96孔板中，BMMs以6×103个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基。第5天用鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行染色。
骨吸收实验：BMMs以5×105个/孔的密度接种于6孔板，孵育过夜；加入含50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF完全培养基，每2 d换液，至第4天出现小的破骨样细胞，胰酶消化以8×103个/孔密度重新接种至羟基磷灰石涂板内，并且加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE处理。培养3 d后，用次氯酸钠洗去细胞，PBS清洗后晾干，于光学显微镜下拍照，统计每个孔的骨陷窝面积[15]。
2.6 q-PCR检测
在12孔板中，BMMs以5×104个/孔的密度接种，孵育过夜；分别加入0、0.5、1、2 mg/ml CSE干预处理，同时加入50 ng/ml RANKL和30 ng/ml M-CSF，每2 d更换一次培养基至第5天。抽提RNA，逆转录后使用q-PCR检测DC-STAMP、ATP6V0d2、TRAP、CTSK、NFATc1基因的表达，引物序列详情见引文[16]。
2.7 蛋白印迹法检测
在6孔板中，BMMs以5×105个/孔的密度接种，孵育过夜；使用无血清的α-MEM培养基饥饿细胞1 h，实验组更换含1 mg/ml的CSE的完全培养基，对照组更换含相同体积PBS的完全培养基，孵育3 h；均使用50 ng/ml RANKL刺激5、10、20、30、60 min，未被刺激的细胞作为0 min。刺激完成后，抽提总蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，室温下荧光素偶联的二抗孵育1 h，用odyssey成像系统扫膜，分析JNK(1∶2000)、p-JNK(1∶2000)、ERK(1∶2000)、p-ERK(1∶2000)、P38(1∶2000)、p-P38(1∶2000)的表达。
2.8 动物造模、分组及给药
在24只12周龄小鼠中随机挑选6只作为假手术组（Sham组），其余小鼠使用异氟烷气麻，去除背部毛发，切开皮肤和背膜，使卵巢暴露，切除双侧卵巢并使用可吸收缝合线结扎、缝合（假手术组仅切开背部皮肤和腹膜）[14]。术后1周，按照文献报道方法[17]，将卵巢切除小鼠随机分为3组：模型组（OVX组）、CSE低剂量组、CSE高剂量组，每组6只。术后7 d开始给药，由预实验确定给药浓度为312.5和625 mg/kg，按照每只200 μl/d连续灌胃给药6周。
2.9 HE染色和TRAP染色
小鼠处死后取双侧股骨，4%多聚甲醛固定后进行脱钙处理，之后常规脱水、石蜡包埋，切成4 μm切片，分别进行HE染色和TRAP染色。统计破骨细胞数量/骨表面积（N. Oc/BS）、破骨细胞面积/骨表面积（Oc. S/BS）和骨体积/组织体积（BV/TV）。
2.10 ELISA法检测血清生化指标
小鼠处死前统一摘除小鼠左眼取血，将全血收集并在4 ℃静置30 min，之后在4 ℃下2 000 r/min离心20 min，吸取上清液置于−80 ℃冰箱中保存。按照Elisa试剂盒《用户操作手册》检测血清中TRAP、ALP、BGP含量。
2.11 统计学方法
使用Image J统计破骨细胞面积和个数、F-actin环面积和环内核数、骨陷窝面积、蛋白条带灰度值、N. Oc/BS、Oc. S/BS和BV/TV。使用SPSS 21.0统计学软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差（
$\bar x $ ±s）表示，多组间比较使用方差分析，以P<0.05认为差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 CSE对BMMs细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与空白组比较，CSE浓度范围在0.125～4 mg/ml时，48 h内和96 h内CSE对BMMs无细胞毒性（图1）。据此结果选择0.5、1、2 mg/ml作为之后的细胞实验浓度。
3.2 CSE对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响
TRAP染色显示，与空白组比较，RANKL组的BMMs分化为成熟的TRAP阳性多核巨噬细胞（有完整的圆形状细胞形态且细胞核数目≥3）。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的TRAP阳性多核巨噬细胞数量明显减少，且呈剂量依赖的方式下降，并且破骨细胞的大小也被显著抑制（图2A-C）。结果表明CSE不仅抑制破骨细胞的分化也阻碍了破骨细胞前体细胞的融合。
图 2 CSE对破骨细胞分化的影响（n=3）A.破骨细胞图像（×40）；B.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）面积百分比；C.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数；D.不同时间段加入CSE处理后的破骨细胞图像（×40）；E.加药时间示意图；F.每孔TRAP阳性多核细胞（细胞核数≥3）个数**P<0.01，与RANKL组比较在RANKL持续刺激的BMMs中按时段加入CSE。染色结果显示，与空白组比较，0 d组的BMMs几乎全部分化为成熟的破骨细胞，数量多，且形状完整。与0 d组比较，给予CSE1～3 d组的BMMs分化为成熟破骨细胞的数量最少，3～5 d组其次，5～7 d组最多（图2D、2E、2F）。结果表明CSE对破骨细胞生成的任一阶段均有作用，在早期阶段作用最为明显。
3.3 CSE对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响
鬼笔环肽和DAPI染色显示，RANKL组的F-actin环形成完整，数量多且面积大，环内细胞核数量多。与RANKL组比较，CSE不同剂量组的F-actin环数量和大小均下降，环内细胞核数量也明显减少（图3A、3B、3C）。
图 3 CSE对破骨细胞F-actin环形成和骨吸收功能的影响（n=3）A.F-actin环和细胞核共聚焦图像（×100）；B.每孔内F-actin环面积百分比；C.单个F-actin环内细胞核个数；D.骨陷窝图像（×40）；E.每孔未吸收面积百分比**P<0.01，与RANKL组比较骨板吸收显示，RANKL组未被吸收面积为70%， 1 mg/ml CSE组未被吸收面积为85%，2 mg/ml CSE组为95%，与RANKL组比较，不同剂量的CSE均有效的减少了骨板吸收的面积（图3D、3E）。结果表明CSE显著抑制了成熟破骨细胞骨吸收的功能。
3.4 CSE对RANKL诱导的破骨细胞特异性基因表达的影响
q-PCR结果显示，与RANKL组比较，CSE中、高剂量组显著性地抑制了破骨细胞特异性基因TRAP、CTSK、ATP6V0d2、DC-STAMP和NFATc1的表达，且呈剂量依赖性（图4）。这与CSE抑制破骨细胞分化及功能的结果相一致。
图 4 CSE对破骨细胞特异性基因表达的影响（n=3）A.TRAP；B.CTSK; C.ATP6V0d2; D.DC-STAMP; E.NFATc1*P<0.05，**P<0.01，与RANKL组比较3.5 CSE对破骨细胞分化过程中MAPK通路的影响
Wsetern-blot结果显示，RANKL组各时间段JNK、ERK和P38蛋白磷酸化显著。与RANKL组比较， CSE组p-JNK蛋白表达在第10～30 min明显下降，p-ERK蛋白表达在第20～60 min明显下降和p-P38蛋白表达在第10～60 min明显下降，见图5。结果表明在破骨细胞的分化过程中，CSE作用于MAPK通路JNK、ERK和P38的磷酸化。
3.6 CSE对卵巢切除小鼠的影响
HE和TRAP染色显示，与假手术组比较，OVX组小鼠的骨小梁数目和面积明显减少（BV/TV值下降）且间距变大，骨小梁表面破骨细胞数量增多、面积变大（N. Oc/BS、Oc. S/BS值上升）。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠的骨小梁数目和面积均增加（BV/TV值上升）且间距减小，骨小梁表面破骨细胞数量减少、面积变小（N. Oc/BS、Oc. S/BS值下降），见图6。结果表明，CSE可以增加卵巢切除小鼠骨小梁数目，抑制破骨细胞活性，缓解骨量流失。
图 6 CSE对去卵巢小鼠股骨破骨细胞数量和骨小梁的影响（n=6）A.HE染色和TRAP染色；B.BV/TV；C.Oc. S/BS；D.N. Oc/BS；**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较3.7 CSE对TRAP、ALP、BGP含量的影响
ELISA结果显示，与假手术组比较，OVX组小鼠血清中的TRAP含量明显增加，BGP含量明显减少，ALP含量无明显变化；CSE高剂量组小鼠血清中的TRAP、BGP含量无明显变化， ALP含量明显增加。与OVX组比较，CSE低剂量和高剂量组小鼠血清中的ALP、BGP含量明显增加，TRAP含量明显减少（图7）。结果表明，CSE可以调节骨代谢相关指标，具有平衡骨稳态作用。
图 7 CSE对TRAP、ALP和BGP含量的影响（n=6）A.TRAP；B.ALP；C.BGP；*P＜0.05，**P<0.01，与OVX组比较；##P<0.01，与假手术组比较4. 讨论
骨质疏松症是一种与年龄相关的骨代谢疾病，骨重建失衡是其发生的主要原因，因绝经造成的骨质疏松占骨质疏松症的绝大部分。研究表明，雌激素对骨骼的生长、发育和维持至关重要，因雌激素缺失致使RANKL介导的信号通路过度活化，进而使破骨细胞功能异常，是绝经后骨质疏松症主要原因[18]。因而抑制破骨细胞的分化及其功能是治疗骨质疏松的有效途径[19]。在本研究中，我们发现CSE通过抑制MAPK信号通路的激活来抑制RANKL介导的破骨细胞生成，同时对OVX小鼠的骨质流失具有良好的保护作用。
研究表明，在RANKL的刺激下，BMMs中的MAPK通路被激活，进而刺激破骨细胞特异性基因的表达，促进BMMs分化为破骨细胞[19-21]。NFATc1和DC-STAMP是破骨细胞分化和前体破骨细胞融合的主要调控者，TRAP、CTSK、ATP6V0d2是反映破骨细胞活性和骨吸收状态的特异性指标[22-23]。本研究表明，CSE显著抑制RANKL介导的破骨细胞分化，而且在破骨细胞分化的早期阶段作用最为明显。其机制是抑制JNK、ERK和P38的激活，进而抑制破骨细胞特异性基因的表达。
F-actin环是分化成熟的破骨细胞在骨面上极化，使骨架重排，F-actin紧密排列形成的一个环，是破骨细胞进行骨吸收的先决条件。因而阻碍破骨细胞前体细胞的融合，能够有效抑制F-actin环的形成和骨吸收功能[24]。本研究发现CSE显著性地抑制F-actin环的形成，并降低了环内细胞核数以及骨陷窝面积，这表明CSE阻碍了破骨细胞前体细胞的融合和骨吸收功能，与CSE抑制破骨细胞分化及其特异性基因表达的结果相一致。
我们构建了去卵巢小鼠模型模拟绝经后的骨质疏松症，经CSE灌胃给药6周后，采用HE和TRAP染色对小鼠股骨进行骨组织形态学分析以及ELISA检测血清中ALP、TRAP、BGP含量。TRAP是酸性磷酸酶的同工酶，其血清浓度可反映破骨细胞的活性[25]。ALP是一种磷酸单酯酶，由成骨细胞分泌，能有效地反映成骨细胞的活性[27]。BGP由成骨细胞合成及分泌，绝大部分的BGP随成骨细胞矿化在骨基质中沉积，仅有一小部分进入到血液循环[14]。血液中的BGP是成骨细胞分泌完成后直接进入血液，并非是破骨细胞降解骨基质而进入血液，因而检测血液中的BGP含量，对评判机体经药物治疗后变化有较大的参考价值。结果显示，CSE能有效缓解骨量丢失，表现在CSE各剂量组小鼠的骨小梁数量增多，间距减少，以及骨表面破骨细胞数量和面积减少，表明了CSE对去卵巢小鼠的骨量流失具有良好的保护作用。同时CSE提高了血清中ALP含量，使BGP和TRAP含量回归正常水平，说明其可抑制破骨细胞分化，减弱骨吸收功能，具有缓解骨量流失和调节骨代谢作用。
总之，本研究发现CSE在体外抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化及其骨吸收功能，其可能机制部分归因于CSE抑制了级联信号中ERK、JNK和P38的激活，在体内有效的缓解了因卵巢切除造成的骨量丢失，这为CSE防治骨质疏松症提供了初步的药理学证据。
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[1] 赖晓慧, 肖义军. 河豚毒素的研究进展[J]. 福建畜牧兽医, 2019, 41(4):23-24, 29. doi: 10.3969/j.issn.1003-4331.2019.04.010 [2] MELNIKOVA D, KHOTIMCHENKO Y, MAGARLAMOV T. Addressing the issue of tetrodotoxin targeting[J]. Mar Drugs,2018,16(10):352. doi: 10.3390/md16100352 [3] 于翠萍, 王长都, 安建雄, 等. 河豚毒素可能的镇痛机制及镇痛作用[J]. 中国处方药, 2009, 7(3):82-84. [4] MA R S Y, KAYANI K, WHYTE-OSHODI D, et al. Voltage gated sodium channels as therapeutic targets for chronic pain[J]. J Pain Res,2019,12:2709-2722. doi: 10.2147/JPR.S207610 [5] ZHAO C, LIU A D, SANTAMARIA C M, et al. Polymer-tetrodotoxin conjugates to induce prolonged duration local anesthesia with minimal toxicity[J]. Nat Commun,2019,10(1):2566. doi: 10.1038/s41467-019-10296-9 [6] LIU Q, SANTAMARIA C M, WEI T, et al. Hollow silica nanoparticles penetrate the peripheral nerve and enhance the nerve blockade from tetrodotoxin[J]. Nano Lett,2018,18(1):32-37. doi: 10.1021/acs.nanolett.7b02461 [7] NIETO F R, COBOS E J, TEJADA M Á, et al. Tetrodotoxin (TTX) as a therapeutic agent for pain[J]. Mar Drugs,2012,10(12):281-305. doi: 10.3390/md10020281 [8] HAGEN N A, CANTIN L, CONSTANT J, et al. Tetrodotoxin for moderate to severe cancer-related pain: a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-design trial[J]. Pain Res Manag,2017,2017:7212713. [9] LAGO J, RODRÍGUEZ L P, BLANCO L, et al. Tetrodotoxin, an extremely potent marine neurotoxin: distribution, toxicity, origin and therapeutical uses[J]. Mar Drugs,2015,13(10):6384-6406. doi: 10.3390/md13106384 [10] OSTEEN J D, HERZIG V, GILCHRIST J, et al. Selective spider toxins reveal a role for the Nav1.1 channel in mechanical pain[J]. Nature,2016,534(7608):494-499. doi: 10.1038/nature17976 [11] HAINS B C, SAAB C Y, KLEIN J P, et al. Altered sodium channel expression in second-order spinal sensory neurons contributes to pain after peripheral nerve injury[J]. J Neurosci,2004,24(20):4832-4839. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0300-04.2004 [12] HAINS B C, KLEIN J P, SAAB C Y, et al. Upregulation of sodium channel Nav1.3 and functional involvement in neuronal hyperexcitability associated with central neuropathic pain after spinal cord injury[J]. J Neurosci,2003,23(26):8881-8892. doi: 10.1523/JNEUROSCI.23-26-08881.2003 [13] GONZÁLEZ-CANO R, TEJADA M Á, ARTACHO-CORDÓN A, et al. Effects of tetrodotoxin in mouse models of visceral pain[J]. Mar Drugs,2017,15(6):E188. doi: 10.3390/md15060188 [14] 于丽华, 周力, 谢克勤. 河豚毒素对小鼠镇痛作用的实验研究[J]. 山东医科大学学报, 1999, 37(2):120-121, 126. [15] 徐英, 耿兴超, 韩继生, 等. 河豚毒素单用及与吗啡合用对大鼠福尔马林致痛的影响[J]. 中国海洋药物, 2003, 22(2):39-41, 56. doi: 10.3969/j.issn.1002-3461.2003.02.011 [16] MARCIL J, WALCZAK J S, GUINDON J, et al. Antinociceptive effects of tetrodotoxin (TTX) in rodents[J]. Br J Anaesth,2006,96(6):761-768. doi: 10.1093/bja/ael096 [17] 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. [18] KAYSER V, VIGUIER F, IOANNIDI M, et al. Differential anti-neuropathic pain effects of tetrodotoxin in sciatic nerve- versus infraorbital nerve-ligated rats - Behavioral, pharmacological and immunohistochemical investigations[J]. Neuropharmacology,2010,58(2):474-487. doi: 10.1016/j.neuropharm.2009.09.003 [19] ENTRENA J M, COBOS E J, NIETO F R, et al. Sigma-1 receptors are essential for capsaicin-induced mechanical hypersensitivity: studies with selective Sigma-1 ligands and Sigma-1 knockout mice[J]. Pain,2009,143(3):252-261. doi: 10.1016/j.pain.2009.03.011 [20] NIETO F R, ENTRENA J M, CENDÁN C M, et al. Tetrodotoxin inhibits the development and expression of neuropathic pain induced by paclitaxel in mice[J]. Pain,2008,137(3):520-531. doi: 10.1016/j.pain.2007.10.012 期刊类型引用(1)
1. 王楠. 小剂量口服避孕药对妇女血凝的影响研究. 实用妇科内分泌电子杂志. 2023(23): 82-84 . 
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