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微丸是指直径小于2.5 mm(或0.5～1.5 mm)的球形或类球形固体剂型[1]。相比传统的中药水煎剂和化学药片剂，微丸具有能够提高药物与胃肠道的接触面积，增加药物的生物利用度；载药范围宽，流动性好，体积小等特点；且单个微丸的缺陷不影响制剂的整体释放效果，尤其适用于复方制剂的配伍，同时能够提高药物的稳定性[2-4]。
溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的自身免疫性疾病[5]。传统的UC治疗药物包括肾上腺皮质激素类（如泼尼松）、氨基水杨酸类（如美沙拉嗪）和免疫抑制剂类（如硫唑嘌呤）等，上述药物针对轻重度患者均有较好的治疗效果，但只能缓解症状，且长期应用副作用较大[6-7]。中医药在治疗溃疡性结肠炎方面独具优势，但剂型的落后、给药方式的局限在很大程度上影响了中药疗效的发挥[8-9]。本研究选择中药临床验方“白术黄连方[10]”为模型方剂，根据其组方特点和药物成分特性，以膜控型包衣微丸为给药载体，将其处方中的药物分别制备成“胃溶微丸”和“肠溶微丸”，进一步组合成结肠靶向给药胶囊，以期为临床溃疡性结肠炎的治疗提供一种新的有效制剂，同时为复方中药新药开发提供方法学借鉴。
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101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；FlexStream™ MP1流化床、NICA™ E140挤出机、NICA™ S450滚圆机（德国基伊埃技术设备有限公司）；RCZ-6C3型药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）。
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白术挥发油（批号：XC20170225）、黄连提取物（批号：XC20170113）、防风提取物（批号：XC20170216）购自西安小草植物科技有限公司；盐酸小檗碱对照品（按含C20H18ClNO4计为86.7%，批号：5UVU-ZFW7）购自中国食品药品检定研究院；β-环糊精（β-CD，曲阜市天利药用辅料有限公司，批号：161202）；微晶纤维素（MCC，湖州市菱湖新望化学有限公司，批号：P101D0516N09）；无水乳糖（DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co.KG，Germany，批号：10147P9）；交联聚维酮（PVPP XL-10，上海源叶生物科技有限公司，批号：B22A7S19749）；丙烯酸树脂EUDRAGIT® L30D-55（以下简称L30，批号：B170314162）、丙烯酸树脂EUDRAGIT® FS30D（以下简称FS30，批号：C170265001）购自Evonic Rolm GmbH公司；羟丙甲基纤维素（HPMC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1717099）；柠檬酸三乙酯（TEC，上海昌为医药辅料技术有限公司，批号：170712）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
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色谱柱：依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（0.5%三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。
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精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中作为储备液，将此储备液用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，进样测定。取少量肠溶微丸研碎，称取一定量粉末，加入甲醇，超声提取30 min，3 000 r/min离心后取上清，定容后过0.45 μm滤膜得到供试品溶液。同法制备空白辅料溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在（0.05～50.00）μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=100 513X−5 262.7（r=0.999 9）。甲醇、空白辅料对肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定没有干扰，专属性良好（图1）。取浓度为10.0、20.0和50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液连续进样6次，连续测定3 d，记录色谱图峰面积，得到3个浓度的盐酸小檗碱的日内精密度结果分别为0.19%、0.42%、1.52%，日间精密度分别为0.58%、1.43%、1.28%。称取适量黄连提取物，分别加入浓度为10.0、20.0、50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，超声提取30 min，3000 r/min离心后取上清液，定容后过0.45 μm滤膜，进样测定，记录色谱图峰面积，加样回收率RSD分别为0.85%、1.90%、0.60%，表明该方法可用于肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定。
图 1 盐酸小檗碱的HPLC图
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载药量、填充剂比例、润湿剂和黏合剂的用量对微丸的成型起到至关重要的作用。因此，我们采用单因素筛选的方法对上述4个因素进行了考察，评价的指标分别为微丸的圆整度、目标微丸的收率和物料黏性。
根据处方，黄连提取物与防风提取物的比例为15∶12。固定MCC：乳糖=5∶2，PVPP用量5%，水为润湿剂，6% HPMC为黏合剂。考察载药量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响，结果见表1。
表 1 载药量对微丸特性的影响
载药量（%） 圆整度(θ/°) 收率（%） 物料黏性 27 21.2 95.76 黏性适中，手握成团，轻压即散 40.5 23.7 89.64 黏性略大，易捏合成团 54 24.1 74.38 黏性极大，易黏附于器壁 同样采用单因素筛选的方法分别对填充剂比例、润湿剂用量和黏合剂用量进行了考察。固定载药量为27%，以水为润湿剂，PVPP用量为5%，6% HPMC为黏合剂，考察MCC与乳糖之比对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，6% HPMC为黏合剂，考察润湿剂的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，水为润湿剂，考察黏合剂6% HPMC的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响。
根据单因素实验的结果，综合考虑微丸圆整度、收率和物料黏性等因素，最终确定优化后的丸芯处方为：载药量27%，PVPP 5%，MCC与乳糖之比5∶2，润湿剂占干物料比重30%，黏合剂占干物料比重20%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方配比合理。
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选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交实验，对工艺参数进行优化。按照表2分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，18～30目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）作为评价指标。
表 2 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 96.24 23.0 50.24 2 20 700 5 93.33 21.5 50.33 3 20 900 7 82.68 22.0 38.68 4 30 500 5 95.41 24.0 47.41 5 30 700 7 92.70 21.0 50.70 6 30 900 3 81.02 24.0 33.02 7 40 500 7 93.82 22.5 48.82 8 40 700 3 93.24 23.0 47.24 9 40 900 5 83.54 25.0 33.54 均值1 46.417 48.823 43.500 均值2 43.710 49.423 43.760 均值3 43.200 35.080 46.067 极差 3.217 14.343 2.567 结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>A>C，表3方差分析结果表明，3个因素对综合评分并无显著影响(P>0.05)。考虑到实际实验过程中较大的滚圆速度有利于减少微丸细粉的产生并提高生产效率，最终确定优化后的工艺参数为A1B2C3，即挤出速度20 Hz，滚圆速度700 r/min，滚圆时间7 min。
表 3 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 17.933 2 0.127 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 394.970 2 2.789 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 11.976 2 0.085 5.140 P>0.05 误差 424.88 6 -
药物在溶出时，完整的包衣膜决定了微丸内部和介质之间存在一定的渗透压差。丸芯内外压差对药物的释放影响作用较大，因此，在处方筛选过程中，必须考察丸芯的隔离情况[11]。包制隔离衣后，也使后续包制的肠溶衣膜厚度更加均匀，保证了包衣过程的连续性。固定丸芯原辅料比例不变，分别考察了隔离衣增重为2%、4%、6%和8%时肠溶微丸中盐酸小檗碱的释放情况，累积释放曲线如图2A。结果表明隔离衣增重对累积释放度的影响不显著，最终采用4%的HPMC溶液进行隔离衣的包制，包衣增重为丸芯重量的2%。
图 2 对肠溶微丸累积释放度产生影响的几种因素
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聚合物比例、增塑剂用量和包衣增重是调节膜控型微丸释药速率的3个关键因素。因此，同样采用单因素筛选的方法对上述3个因素进行考察，并绘制不同参数下的累积释放曲线。
固定微丸的隔离衣增重为2%，肠溶衣增重为15%，考察聚合物不同比例对盐酸小檗碱累积释放度的影响，累积释放曲线如图2B所示，结果表明，当L30与FS30之比为1∶2，符合对累积释放度设定的标准。
固定L30与FS30之比为1∶2，包衣增重为15%，考察增塑剂用量占干聚物比例为5%、10%、15%、20%和25%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响。图2C结果表明，当增塑剂用量为10%～25%时，药物释放基本满足给定的标准，但实际操作中发现增塑剂用量变大时，微丸包衣难度加大，易产生粘连现象。最终将增塑剂用量定为10%，既能满足释放要求，又能保证较高的生产效率。
最后对包衣增重进行筛选，固定L30与FS30之比为1∶2，考察包衣增重为5%、10%、15%和20%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响，结果如图2D所示，当包衣增重为15%时，满足对累积释放度设定的标准。
根据单因素筛选的结果，最终确定包衣处方为：隔离衣增重2%，L30与FS30之比为1∶2，增塑剂用量10%，包衣增重为15%。按此处方制备3批微丸进行验证试验，工艺参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管直径3 mm，雾化压力1.8 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风温度32 ℃，进风量50 cm2，干燥温度28 ℃，干燥时间30 min。结果表明，据此条件制备的肠溶微丸满足对累积释放度设定的标准。
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采用饱和水溶液法制备包合物。称取规定量的β-CD加入10倍蒸馏水，置于70 ℃的恒温水浴锅中，搅拌使成饱和溶液。在30 ℃下边搅拌边缓慢滴加一定量（挥发油与β-CD之比为1∶6）白术挥发油（用无水乙醇预先配置成1∶1的溶液），恒温搅拌1.5 h，冷却至室温，在4 ℃冰箱中冷藏24 h，抽滤后用无水乙醇冲洗3次（每次10 ml），40 ℃干燥4～5 h即得白术挥发油β-CD包合物[12]。
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参照肠溶微丸的处方筛选过程，对胃溶微丸的处方同样进行单因素筛选。实验过程中发现，包合物由于粉末较为细腻，在与微晶纤维素和乳糖混合后，仅需加入少量水作为润湿剂就可以得到塑性良好的湿物料，且易于挤出-滚圆成丸，因此，胃溶微丸的处方中不再添加黏合剂。仅对载药量、填充剂比例和润湿剂用量进行考察。经单因素实验筛选后最终确定优化后胃溶微丸的丸芯处方为：载药量50%，PVPP5%，微晶纤维素与乳糖之比2∶1，润湿剂占干物料比重40%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方可行。
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同样选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交试验对工艺参数进行优化。按照表4分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，16～24目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）为评价指标。
表 4 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 87.31 24.5 38.31 2 20 700 5 90.12 24.0 42.12 3 20 900 7 82.88 24.5 33.88 4 30 500 5 93.90 27.0 39.90 5 30 700 7 90.68 25.5 39.68 6 30 900 3 81.01 23.0 35.01 7 40 500 7 96.08 25.5 45.08 8 40 700 3 90.20 27.0 36.20 9 40 900 5 80.36 26.5 27.36 均值1 38.103 41.097 36.507 均值2 38.197 39.333 36.460 均值3 36.213 32.083 39.547 极差 1.984 9.014 3.087 实验结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>C>A，方差分析结果（表5）表明，3个因素对综合评分并无显著性影响(P>0.05)。考虑到简化制备过程以降低成本，最终确定优化后的工艺参数为A1B1C2，即挤出速度20 Hz，滚圆速度500 r/min，滚圆时间5 min。
表 5 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 7.514 2 0.138 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 136.912 2 2.517 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 18.771 2 0.345 5.140 P>0.05 误差 163.20 6 -
配制浓度为4%的HPMC溶液，流化床底喷包衣进行胃溶衣的包制，包衣增重为2%。包衣参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管内径3 mm，雾化压力1.5 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风口温度45 ℃，进风量50 m3/h，干燥温度40 ℃，干燥时间30 min。
将胃溶微丸与肠溶微丸按照质量比1∶1的比例装入0号硬质胶囊，得到白术黄连微丸口服结肠靶向胶囊。
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按照《中国药典》2015版四部通则0931溶出度与释放度测定法第二法：桨法，评价肠溶微丸的释药特性。溶出介质体积为750 ml，转速100 r/min，温度（37±0.5）℃。分别在pH 1.2的人工胃液中释放2 h，pH 6.8的人工小肠液中释放4 h，pH7.6的人工结肠液中释放18 h，溶出介质体积均满足漏槽条件。分别于1～14 h之间每1 h一次，14～24 h之间每2 h一次，定时取样1 ml，随后立即补加同温同体积介质1 ml，将收集的样品过0.45 μm滤膜后按照“2.1.1”项下方法进样测定，计算体外累积释放度，释放曲线如图3所示。结果表明，按照最优处方制备出的肠溶微丸在人工胃液中2 h基本不释放，人工小肠液中4 h累积释放量小于10%，人工结肠液中缓慢释放，24 h基本释放完全，兼具缓释和结肠靶向的特性。
图 3 盐酸小檗碱的体外累积释放度(
${\bf{\bar x}} {\bf{\pm}} {\bf{s}}$ ，n=6) -
将肠溶微丸的释药曲线分别按零级、一级和Higuchi方程进行拟合[13]，得到的结果如表6所示。结果表明，其释放行为符合Higuchi方程释药模型（r=0.9054）。
表 6 肠溶微丸不同释药行为的拟合方程
模型 拟合方程 r 零级 Q=3.298t+4.231 0.8303 一级 ln(1−Q)=144.633 t+0.037 0.8966 Higuchi Q=25.075 t1/2−36.962 0.9054 -
本研究首先将处方中黄连的有效成分黄连生物碱和防风的有效成分色原酮、多糖等采用L30与FS30混合包衣，制备肠溶微丸；再将白术的有效部位——挥发油类成分通过环糊精包合成挥发油β-CD包合物，制备成胃溶微丸；然后将两种微丸按比例混合装入胶囊，得到口服结肠靶向胶囊。药物口服后，能够发挥“两步释放”的效果，白术的有效成分首先在胃内释放；黄连生物碱和防风色原酮等成分在结肠部位缓慢释放，二者合一，体现了中医药整体与局部相结合的治法治则[14]。
肠溶微丸的制备采用挤出-滚圆工艺和流化床包衣技术，工艺稳定性和重现性好，适用于工业化大生产。肠溶微丸中药物的释放主要通过膜控来实现，而高分子材料丙烯酸树脂L30和FS30分别在pH>5.5和pH>7.0环境中溶解。因此，可通过混合并调节两者的用量，获得在小肠末端开始释放，到达结肠后大量释放的混合材料，起到缓释和结肠定位的双重作用。同时，本研究使用混合材料进行单层衣膜的包制，简化了包衣步骤，降低了多层包衣造成的成本损耗。依据本实验处方工艺连续制备3批肠溶微丸，释放度结果显示该3批微丸均具有良好的缓释效果，且批间差异小，表明本处方工艺合理，简单易行，重现性良好，适用于工业化生产。
经口服进入胃内的药物在2～4 h后基本会全部通过，随后进入小肠继续吸收，这一过程需要5～6 h，最后进入结肠被进一步重吸收，12～24 h后才会排出体外[15]。因此，将微丸中盐酸小檗碱的释放度标准定为，在pH1.2的人工胃液中2 h基本无释放（<5%），pH6.8的人工小肠液中4 h累积释放度<10%，pH7.8的人工结肠液中6 h累积释放度>60%。聚合物比例决定了肠溶衣膜溶解的速率，进而影响药物的释放度。适量增塑剂的加入可降低玻璃化温度和最低成膜温度，有助于提高包衣膜的完整性，柠檬酸三乙酯类的增塑剂还能够增加包衣膜的柔性。通过对包衣增重的调整，也可以使药物的释放度符合预期的设计。
将白术挥发油包合后，能够有效掩盖药物的不良气味，同时增加有效成分的稳定性，实现了液体药物向固体制剂的转化。胃溶微丸在口服后，表面衣膜与介质接触后不断溶胀，由于溶胀层较薄，丸芯中的MCC和乳糖吸水后大幅膨胀导致微丸迅速崩解成细颗粒，溶出介质将包合物溶解后形成浓度差，促进了药物的扩散释放，有利于药物迅速吸收入血，发挥全身作用。
Preparation and in-vitro drug release of Baizhu Huanglian pellets containing colon-targeting capsules
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摘要:
目的 将中药“白术黄连方”制备成以胃溶微丸和肠溶微丸为基础的结肠靶向胶囊，优化其处方组成和制备工艺，考察其体外释放特性。 方法 采用单因素实验和正交实验法优化微丸的处方组成和工艺参数。用挤出-滚圆技术制备素丸，流化床底喷方式进行包衣，考察隔离衣增重、肠溶衣中聚合物比例、增塑剂用量和包衣增重对肠溶微丸释放行为的影响，并对其释药行为进行模型拟合。 结果 最终确定胃溶微丸的处方为：载药量50%，交联聚维酮(PVPP)5%，微晶纤维(MCC)：乳糖=2∶1，润湿剂40%；工艺参数为：挤出速度20 Hz，滚圆速度500 r/min，滚圆时间5 min。肠溶微丸的处方为：载药量27%，PVPP 5%，MCC：乳糖=5∶2，润湿剂30%，粘合剂20%；工艺参数为：挤出速度20 Hz，滚圆速度700 r/min，滚圆时间7 min；肠溶衣处方为：EUDRAGIT® L30D-55：EUDRAGIT® FS30D=1∶2，增塑剂用量10%，包衣增重15%。肠溶微丸的体外释放时间达24 h，其释放行为符合Higuchi模型。 结论 成功制备了白术黄连微丸结肠靶向胶囊，肠溶微丸表现出缓释和结肠靶向的特性。 Abstract:Objective Colon-targeting capsules based on gastric pellets and enteric pellets were prepared from Baizhu Huanglian prescription. The formulation composition and preparation process were optimized and the in-vitro release characteristics were investigated. Methods Optimum formulation composition and process parameters of Baizhu Huanglian pellets were screened out by single factor experiment and orthogonal design. The pellets core were prepared by extrusion-spheronization technique and coated in the fluid bed using bottom spray coating technique. To investigate the effect of coating level of the isolation layer, the proportion of polymer, the amount of plasticizer and weight gain of enteric coating on the release behavior of the enteric pellets. The pellets release behavior was fitted by model as well. Results The prescription of gastric pellets was drug loading 50%, PVPP 5%, MCC to lactose 1∶2 and wetting agent 40%. The process parameters were extrusion frequency 20 Hz, rounding speed 500 r/min and rounding time 5 min. The prescription of enteric pellets was drug loading 27%, PVPP 5%, MCC to lactose 5∶2, wetting agent 30% and adhesive 20%. The process parameters were extrusion frequency 20 Hz, rounding speed 700 r/min and rounding time 7 min. For enteric coating layer, the coating mixture of EUDRAGIT®L30D-55 to EUDRAGIT® FS30D was 1∶2. The amount of plasticizer was 10%. The increased weight of coating layer was 15%. The release time of enteric pellets in-vitro was up to 24 hours. The release behavior of the pellets conforms to the Higuchi model. Conclusion The colon targeting capsule of Baizhu Huanglian pellets were successfully prepared and showed the characteristics of sustained release and colon targeting. -
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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表 1 载药量对微丸特性的影响
载药量（%） 圆整度(θ/°) 收率（%） 物料黏性 27 21.2 95.76 黏性适中，手握成团，轻压即散 40.5 23.7 89.64 黏性略大，易捏合成团 54 24.1 74.38 黏性极大，易黏附于器壁 
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表 2 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 96.24 23.0 50.24 2 20 700 5 93.33 21.5 50.33 3 20 900 7 82.68 22.0 38.68 4 30 500 5 95.41 24.0 47.41 5 30 700 7 92.70 21.0 50.70 6 30 900 3 81.02 24.0 33.02 7 40 500 7 93.82 22.5 48.82 8 40 700 3 93.24 23.0 47.24 9 40 900 5 83.54 25.0 33.54 均值1 46.417 48.823 43.500 均值2 43.710 49.423 43.760 均值3 43.200 35.080 46.067 极差 3.217 14.343 2.567
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表 3 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 17.933 2 0.127 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 394.970 2 2.789 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 11.976 2 0.085 5.140 P>0.05 误差 424.88 6
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表 4 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 87.31 24.5 38.31 2 20 700 5 90.12 24.0 42.12 3 20 900 7 82.88 24.5 33.88 4 30 500 5 93.90 27.0 39.90 5 30 700 7 90.68 25.5 39.68 6 30 900 3 81.01 23.0 35.01 7 40 500 7 96.08 25.5 45.08 8 40 700 3 90.20 27.0 36.20 9 40 900 5 80.36 26.5 27.36 均值1 38.103 41.097 36.507 均值2 38.197 39.333 36.460 均值3 36.213 32.083 39.547 极差 1.984 9.014 3.087
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表 5 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 7.514 2 0.138 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 136.912 2 2.517 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 18.771 2 0.345 5.140 P>0.05 误差 163.20 6
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表 6 肠溶微丸不同释药行为的拟合方程
模型 拟合方程 r 零级 Q=3.298t+4.231 0.8303 一级 ln(1−Q)=144.633 t+0.037 0.8966 Higuchi Q=25.075 t1/2−36.962 0.9054
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