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微丸是指直径小于2.5 mm(或0.5～1.5 mm)的球形或类球形固体剂型[1]。相比传统的中药水煎剂和化学药片剂，微丸具有能够提高药物与胃肠道的接触面积，增加药物的生物利用度；载药范围宽，流动性好，体积小等特点；且单个微丸的缺陷不影响制剂的整体释放效果，尤其适用于复方制剂的配伍，同时能够提高药物的稳定性[2-4]。
溃疡性结肠炎（UC）是一种常见的自身免疫性疾病[5]。传统的UC治疗药物包括肾上腺皮质激素类（如泼尼松）、氨基水杨酸类（如美沙拉嗪）和免疫抑制剂类（如硫唑嘌呤）等，上述药物针对轻重度患者均有较好的治疗效果，但只能缓解症状，且长期应用副作用较大[6-7]。中医药在治疗溃疡性结肠炎方面独具优势，但剂型的落后、给药方式的局限在很大程度上影响了中药疗效的发挥[8-9]。本研究选择中药临床验方“白术黄连方[10]”为模型方剂，根据其组方特点和药物成分特性，以膜控型包衣微丸为给药载体，将其处方中的药物分别制备成“胃溶微丸”和“肠溶微丸”，进一步组合成结肠靶向给药胶囊，以期为临床溃疡性结肠炎的治疗提供一种新的有效制剂，同时为复方中药新药开发提供方法学借鉴。
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101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；FlexStream™ MP1流化床、NICA™ E140挤出机、NICA™ S450滚圆机（德国基伊埃技术设备有限公司）；RCZ-6C3型药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）。
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白术挥发油（批号：XC20170225）、黄连提取物（批号：XC20170113）、防风提取物（批号：XC20170216）购自西安小草植物科技有限公司；盐酸小檗碱对照品（按含C20H18ClNO4计为86.7%，批号：5UVU-ZFW7）购自中国食品药品检定研究院；β-环糊精（β-CD，曲阜市天利药用辅料有限公司，批号：161202）；微晶纤维素（MCC，湖州市菱湖新望化学有限公司，批号：P101D0516N09）；无水乳糖（DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co.KG，Germany，批号：10147P9）；交联聚维酮（PVPP XL-10，上海源叶生物科技有限公司，批号：B22A7S19749）；丙烯酸树脂EUDRAGIT® L30D-55（以下简称L30，批号：B170314162）、丙烯酸树脂EUDRAGIT® FS30D（以下简称FS30，批号：C170265001）购自Evonic Rolm GmbH公司；羟丙甲基纤维素（HPMC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1717099）；柠檬酸三乙酯（TEC，上海昌为医药辅料技术有限公司，批号：170712）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。
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色谱柱：依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（0.5%三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。
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精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中作为储备液，将此储备液用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，进样测定。取少量肠溶微丸研碎，称取一定量粉末，加入甲醇，超声提取30 min，3 000 r/min离心后取上清，定容后过0.45 μm滤膜得到供试品溶液。同法制备空白辅料溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在（0.05～50.00）μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=100 513X−5 262.7（r=0.999 9）。甲醇、空白辅料对肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定没有干扰，专属性良好（图1）。取浓度为10.0、20.0和50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液连续进样6次，连续测定3 d，记录色谱图峰面积，得到3个浓度的盐酸小檗碱的日内精密度结果分别为0.19%、0.42%、1.52%，日间精密度分别为0.58%、1.43%、1.28%。称取适量黄连提取物，分别加入浓度为10.0、20.0、50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，超声提取30 min，3000 r/min离心后取上清液，定容后过0.45 μm滤膜，进样测定，记录色谱图峰面积，加样回收率RSD分别为0.85%、1.90%、0.60%，表明该方法可用于肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定。
图 1 盐酸小檗碱的HPLC图
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载药量、填充剂比例、润湿剂和黏合剂的用量对微丸的成型起到至关重要的作用。因此，我们采用单因素筛选的方法对上述4个因素进行了考察，评价的指标分别为微丸的圆整度、目标微丸的收率和物料黏性。
根据处方，黄连提取物与防风提取物的比例为15∶12。固定MCC：乳糖=5∶2，PVPP用量5%，水为润湿剂，6% HPMC为黏合剂。考察载药量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响，结果见表1。
表 1 载药量对微丸特性的影响
载药量（%） 圆整度(θ/°) 收率（%） 物料黏性 27 21.2 95.76 黏性适中，手握成团，轻压即散 40.5 23.7 89.64 黏性略大，易捏合成团 54 24.1 74.38 黏性极大，易黏附于器壁 同样采用单因素筛选的方法分别对填充剂比例、润湿剂用量和黏合剂用量进行了考察。固定载药量为27%，以水为润湿剂，PVPP用量为5%，6% HPMC为黏合剂，考察MCC与乳糖之比对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，6% HPMC为黏合剂，考察润湿剂的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，水为润湿剂，考察黏合剂6% HPMC的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响。
根据单因素实验的结果，综合考虑微丸圆整度、收率和物料黏性等因素，最终确定优化后的丸芯处方为：载药量27%，PVPP 5%，MCC与乳糖之比5∶2，润湿剂占干物料比重30%，黏合剂占干物料比重20%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方配比合理。
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选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交实验，对工艺参数进行优化。按照表2分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，18～30目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）作为评价指标。
表 2 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 96.24 23.0 50.24 2 20 700 5 93.33 21.5 50.33 3 20 900 7 82.68 22.0 38.68 4 30 500 5 95.41 24.0 47.41 5 30 700 7 92.70 21.0 50.70 6 30 900 3 81.02 24.0 33.02 7 40 500 7 93.82 22.5 48.82 8 40 700 3 93.24 23.0 47.24 9 40 900 5 83.54 25.0 33.54 均值1 46.417 48.823 43.500 均值2 43.710 49.423 43.760 均值3 43.200 35.080 46.067 极差 3.217 14.343 2.567 结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>A>C，表3方差分析结果表明，3个因素对综合评分并无显著影响(P>0.05)。考虑到实际实验过程中较大的滚圆速度有利于减少微丸细粉的产生并提高生产效率，最终确定优化后的工艺参数为A1B2C3，即挤出速度20 Hz，滚圆速度700 r/min，滚圆时间7 min。
表 3 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 17.933 2 0.127 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 394.970 2 2.789 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 11.976 2 0.085 5.140 P>0.05 误差 424.88 6 -
药物在溶出时，完整的包衣膜决定了微丸内部和介质之间存在一定的渗透压差。丸芯内外压差对药物的释放影响作用较大，因此，在处方筛选过程中，必须考察丸芯的隔离情况[11]。包制隔离衣后，也使后续包制的肠溶衣膜厚度更加均匀，保证了包衣过程的连续性。固定丸芯原辅料比例不变，分别考察了隔离衣增重为2%、4%、6%和8%时肠溶微丸中盐酸小檗碱的释放情况，累积释放曲线如图2A。结果表明隔离衣增重对累积释放度的影响不显著，最终采用4%的HPMC溶液进行隔离衣的包制，包衣增重为丸芯重量的2%。
图 2 对肠溶微丸累积释放度产生影响的几种因素
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聚合物比例、增塑剂用量和包衣增重是调节膜控型微丸释药速率的3个关键因素。因此，同样采用单因素筛选的方法对上述3个因素进行考察，并绘制不同参数下的累积释放曲线。
固定微丸的隔离衣增重为2%，肠溶衣增重为15%，考察聚合物不同比例对盐酸小檗碱累积释放度的影响，累积释放曲线如图2B所示，结果表明，当L30与FS30之比为1∶2，符合对累积释放度设定的标准。
固定L30与FS30之比为1∶2，包衣增重为15%，考察增塑剂用量占干聚物比例为5%、10%、15%、20%和25%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响。图2C结果表明，当增塑剂用量为10%～25%时，药物释放基本满足给定的标准，但实际操作中发现增塑剂用量变大时，微丸包衣难度加大，易产生粘连现象。最终将增塑剂用量定为10%，既能满足释放要求，又能保证较高的生产效率。
最后对包衣增重进行筛选，固定L30与FS30之比为1∶2，考察包衣增重为5%、10%、15%和20%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响，结果如图2D所示，当包衣增重为15%时，满足对累积释放度设定的标准。
根据单因素筛选的结果，最终确定包衣处方为：隔离衣增重2%，L30与FS30之比为1∶2，增塑剂用量10%，包衣增重为15%。按此处方制备3批微丸进行验证试验，工艺参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管直径3 mm，雾化压力1.8 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风温度32 ℃，进风量50 cm2，干燥温度28 ℃，干燥时间30 min。结果表明，据此条件制备的肠溶微丸满足对累积释放度设定的标准。
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采用饱和水溶液法制备包合物。称取规定量的β-CD加入10倍蒸馏水，置于70 ℃的恒温水浴锅中，搅拌使成饱和溶液。在30 ℃下边搅拌边缓慢滴加一定量（挥发油与β-CD之比为1∶6）白术挥发油（用无水乙醇预先配置成1∶1的溶液），恒温搅拌1.5 h，冷却至室温，在4 ℃冰箱中冷藏24 h，抽滤后用无水乙醇冲洗3次（每次10 ml），40 ℃干燥4～5 h即得白术挥发油β-CD包合物[12]。
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参照肠溶微丸的处方筛选过程，对胃溶微丸的处方同样进行单因素筛选。实验过程中发现，包合物由于粉末较为细腻，在与微晶纤维素和乳糖混合后，仅需加入少量水作为润湿剂就可以得到塑性良好的湿物料，且易于挤出-滚圆成丸，因此，胃溶微丸的处方中不再添加黏合剂。仅对载药量、填充剂比例和润湿剂用量进行考察。经单因素实验筛选后最终确定优化后胃溶微丸的丸芯处方为：载药量50%，PVPP5%，微晶纤维素与乳糖之比2∶1，润湿剂占干物料比重40%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方可行。
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同样选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交试验对工艺参数进行优化。按照表4分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，16～24目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）为评价指标。
表 4 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 87.31 24.5 38.31 2 20 700 5 90.12 24.0 42.12 3 20 900 7 82.88 24.5 33.88 4 30 500 5 93.90 27.0 39.90 5 30 700 7 90.68 25.5 39.68 6 30 900 3 81.01 23.0 35.01 7 40 500 7 96.08 25.5 45.08 8 40 700 3 90.20 27.0 36.20 9 40 900 5 80.36 26.5 27.36 均值1 38.103 41.097 36.507 均值2 38.197 39.333 36.460 均值3 36.213 32.083 39.547 极差 1.984 9.014 3.087 实验结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>C>A，方差分析结果（表5）表明，3个因素对综合评分并无显著性影响(P>0.05)。考虑到简化制备过程以降低成本，最终确定优化后的工艺参数为A1B1C2，即挤出速度20 Hz，滚圆速度500 r/min，滚圆时间5 min。
表 5 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 7.514 2 0.138 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 136.912 2 2.517 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 18.771 2 0.345 5.140 P>0.05 误差 163.20 6 -
配制浓度为4%的HPMC溶液，流化床底喷包衣进行胃溶衣的包制，包衣增重为2%。包衣参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管内径3 mm，雾化压力1.5 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风口温度45 ℃，进风量50 m3/h，干燥温度40 ℃，干燥时间30 min。
将胃溶微丸与肠溶微丸按照质量比1∶1的比例装入0号硬质胶囊，得到白术黄连微丸口服结肠靶向胶囊。
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按照《中国药典》2015版四部通则0931溶出度与释放度测定法第二法：桨法，评价肠溶微丸的释药特性。溶出介质体积为750 ml，转速100 r/min，温度（37±0.5）℃。分别在pH 1.2的人工胃液中释放2 h，pH 6.8的人工小肠液中释放4 h，pH7.6的人工结肠液中释放18 h，溶出介质体积均满足漏槽条件。分别于1～14 h之间每1 h一次，14～24 h之间每2 h一次，定时取样1 ml，随后立即补加同温同体积介质1 ml，将收集的样品过0.45 μm滤膜后按照“2.1.1”项下方法进样测定，计算体外累积释放度，释放曲线如图3所示。结果表明，按照最优处方制备出的肠溶微丸在人工胃液中2 h基本不释放，人工小肠液中4 h累积释放量小于10%，人工结肠液中缓慢释放，24 h基本释放完全，兼具缓释和结肠靶向的特性。
图 3 盐酸小檗碱的体外累积释放度(
${\bf{\bar x}} {\bf{\pm}} {\bf{s}}$ ，n=6) -
将肠溶微丸的释药曲线分别按零级、一级和Higuchi方程进行拟合[13]，得到的结果如表6所示。结果表明，其释放行为符合Higuchi方程释药模型（r=0.9054）。
表 6 肠溶微丸不同释药行为的拟合方程
模型 拟合方程 r 零级 Q=3.298t+4.231 0.8303 一级 ln(1−Q)=144.633 t+0.037 0.8966 Higuchi Q=25.075 t1/2−36.962 0.9054 -
本研究首先将处方中黄连的有效成分黄连生物碱和防风的有效成分色原酮、多糖等采用L30与FS30混合包衣，制备肠溶微丸；再将白术的有效部位——挥发油类成分通过环糊精包合成挥发油β-CD包合物，制备成胃溶微丸；然后将两种微丸按比例混合装入胶囊，得到口服结肠靶向胶囊。药物口服后，能够发挥“两步释放”的效果，白术的有效成分首先在胃内释放；黄连生物碱和防风色原酮等成分在结肠部位缓慢释放，二者合一，体现了中医药整体与局部相结合的治法治则[14]。
肠溶微丸的制备采用挤出-滚圆工艺和流化床包衣技术，工艺稳定性和重现性好，适用于工业化大生产。肠溶微丸中药物的释放主要通过膜控来实现，而高分子材料丙烯酸树脂L30和FS30分别在pH>5.5和pH>7.0环境中溶解。因此，可通过混合并调节两者的用量，获得在小肠末端开始释放，到达结肠后大量释放的混合材料，起到缓释和结肠定位的双重作用。同时，本研究使用混合材料进行单层衣膜的包制，简化了包衣步骤，降低了多层包衣造成的成本损耗。依据本实验处方工艺连续制备3批肠溶微丸，释放度结果显示该3批微丸均具有良好的缓释效果，且批间差异小，表明本处方工艺合理，简单易行，重现性良好，适用于工业化生产。
经口服进入胃内的药物在2～4 h后基本会全部通过，随后进入小肠继续吸收，这一过程需要5～6 h，最后进入结肠被进一步重吸收，12～24 h后才会排出体外[15]。因此，将微丸中盐酸小檗碱的释放度标准定为，在pH1.2的人工胃液中2 h基本无释放（<5%），pH6.8的人工小肠液中4 h累积释放度<10%，pH7.8的人工结肠液中6 h累积释放度>60%。聚合物比例决定了肠溶衣膜溶解的速率，进而影响药物的释放度。适量增塑剂的加入可降低玻璃化温度和最低成膜温度，有助于提高包衣膜的完整性，柠檬酸三乙酯类的增塑剂还能够增加包衣膜的柔性。通过对包衣增重的调整，也可以使药物的释放度符合预期的设计。
将白术挥发油包合后，能够有效掩盖药物的不良气味，同时增加有效成分的稳定性，实现了液体药物向固体制剂的转化。胃溶微丸在口服后，表面衣膜与介质接触后不断溶胀，由于溶胀层较薄，丸芯中的MCC和乳糖吸水后大幅膨胀导致微丸迅速崩解成细颗粒，溶出介质将包合物溶解后形成浓度差，促进了药物的扩散释放，有利于药物迅速吸收入血，发挥全身作用。
Preparation and in-vitro drug release of Baizhu Huanglian pellets containing colon-targeting capsules
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摘要:
目的 将中药“白术黄连方”制备成以胃溶微丸和肠溶微丸为基础的结肠靶向胶囊，优化其处方组成和制备工艺，考察其体外释放特性。 方法 采用单因素实验和正交实验法优化微丸的处方组成和工艺参数。用挤出-滚圆技术制备素丸，流化床底喷方式进行包衣，考察隔离衣增重、肠溶衣中聚合物比例、增塑剂用量和包衣增重对肠溶微丸释放行为的影响，并对其释药行为进行模型拟合。 结果 最终确定胃溶微丸的处方为：载药量50%，交联聚维酮(PVPP)5%，微晶纤维(MCC)：乳糖=2∶1，润湿剂40%；工艺参数为：挤出速度20 Hz，滚圆速度500 r/min，滚圆时间5 min。肠溶微丸的处方为：载药量27%，PVPP 5%，MCC：乳糖=5∶2，润湿剂30%，粘合剂20%；工艺参数为：挤出速度20 Hz，滚圆速度700 r/min，滚圆时间7 min；肠溶衣处方为：EUDRAGIT® L30D-55：EUDRAGIT® FS30D=1∶2，增塑剂用量10%，包衣增重15%。肠溶微丸的体外释放时间达24 h，其释放行为符合Higuchi模型。 结论 成功制备了白术黄连微丸结肠靶向胶囊，肠溶微丸表现出缓释和结肠靶向的特性。 Abstract:Objective Colon-targeting capsules based on gastric pellets and enteric pellets were prepared from Baizhu Huanglian prescription. The formulation composition and preparation process were optimized and the in-vitro release characteristics were investigated. Methods Optimum formulation composition and process parameters of Baizhu Huanglian pellets were screened out by single factor experiment and orthogonal design. The pellets core were prepared by extrusion-spheronization technique and coated in the fluid bed using bottom spray coating technique. To investigate the effect of coating level of the isolation layer, the proportion of polymer, the amount of plasticizer and weight gain of enteric coating on the release behavior of the enteric pellets. The pellets release behavior was fitted by model as well. Results The prescription of gastric pellets was drug loading 50%, PVPP 5%, MCC to lactose 1∶2 and wetting agent 40%. The process parameters were extrusion frequency 20 Hz, rounding speed 500 r/min and rounding time 5 min. The prescription of enteric pellets was drug loading 27%, PVPP 5%, MCC to lactose 5∶2, wetting agent 30% and adhesive 20%. The process parameters were extrusion frequency 20 Hz, rounding speed 700 r/min and rounding time 7 min. For enteric coating layer, the coating mixture of EUDRAGIT®L30D-55 to EUDRAGIT® FS30D was 1∶2. The amount of plasticizer was 10%. The increased weight of coating layer was 15%. The release time of enteric pellets in-vitro was up to 24 hours. The release behavior of the pellets conforms to the Higuchi model. Conclusion The colon targeting capsule of Baizhu Huanglian pellets were successfully prepared and showed the characteristics of sustained release and colon targeting. -
乳腺癌是多发于女性中的恶性肿瘤性疾病，威胁着广大女性的健康[1-2]。据统计，全球女性癌症中，乳腺癌发病率和致死率均高于肺癌，目前居于首位，2020年约230万人诊断出患有乳腺癌，致死病例约68.5万[3]。先天性因素、膳食、环境、工作、发育成长阶段及雌激素类药物等多种因素都能成为乳腺癌的诱发因素[4-5]。目前，乳腺癌早期诊断普遍使用的是影像学检查（临床乳腺体格检查、超声、乳腺X线摄影、磁共振成像等）[6]以及肿瘤标志物(CEA、CA153、VEGF、TSGF等)临床筛查[7]，前者操作复杂且具有一定的组织伤害性[8]，后者局限于需多项联合检测且特异性不高[7，9]，均难以满足临床需求。尽管手术、化疗技术在不断提高，但是抗肿瘤药物疗效有限，乳腺癌患者预后效果不佳，尤其是晚期复发和转移普遍。因此，寻找乳腺癌细胞早期代谢生物标志物，进行安全灵敏的早期诊断，对于乳腺癌诊疗具有重要意义[10]。
作为继基因组学、转录组学、蛋白质组学的后起之秀，代谢组学以研究不同病理生理或基因突变条件下对机体内源性小分子化合物代谢变化为核心[11]。内源性小分子化合物是基因和蛋白质的下游产物，从分子生物层面实时动态地反映上游基因及外部因素对机体功能的影响[12]。代谢组学采用以高灵敏度、高通量为特征的现代仪器分析技术方法，对机体的内源性小分子化合物进行动态分析[13]。伴随乳腺癌发展，患者机体内与氨基酸、糖类、脂质等代谢有关的小分子代谢物会发生异常变化。利用代谢组学方法，将改变的内源性代谢物作为生物标志物，在此基础上寻找相关代谢途径，合理推测乳腺癌的发病机制，揭示生物标志物与乳腺癌发生发展间的关联，最终帮助乳腺癌的临床诊疗。本文主要综述代谢组学在乳腺癌早期诊断、药理研究与药效评估、疾病进程监测以及预后评估的研究进展。
1. 代谢组学概述
代谢组学以相对分子质量<1000的内源性代谢物为研究对象，研究样本包括血浆、尿液、唾液、脑脊液、细胞以及组织提取液等[14-16]，其中，血液和尿液最为常见[17]，研究思路为收集生物样品、样品分离、检测鉴定、分析数据、建立模型、获取细胞活动终产物信息，整个过程综合分析优势明显。按照研究目的分类，非靶向代谢组学和靶向代谢组学是两种常见策略[18]，前者进行轮廓分析，旨在获得较多的生物体内源性代谢物[12]，后者通过靶向分析，希望获得特定的内源性代谢物[19]。
代谢组学目前主流的仪器分析方法为核磁共振法(NMR)和质谱（MS）联用技术，后者主要包括液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[20]，以上分析技术各有其特点。NMR可获取大量的物质结构信息，所得样品分析无偏向、无损伤但灵敏度较低[21]。MS通过有损的离子化分析，提供物质分子量及结构信息，灵敏度更高、扫描速度快[22]，常与色谱在线联用以实现分离分析功能。GC-MS灵敏度高但不适用于热稳定性差的样品的分析，LC-MS则克服了GC-MS的劣势，可分析难挥发、热不稳定物质，分离选择性好、效率高，分析时间也随超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）的推广得到进一步缩短，因此LC-MS实际应用范围更广[19，23]。近年来质谱成像（MSI）技术发展迅速，随之空间代谢组学作为代谢组学新的补充诞生，解决了传统代谢组学研究代谢物在组织中的空间信息缺失问题[24-26]。
代谢组学的数据分析步骤为数据预处理、数据归一化和数据统计，即通过数据的过滤、补齐、归一化等去除仪器或生物偏差后，利用统计方法处理代谢组数据，其中，统计方法是从高维复杂的数据中提取出有效信息的关键。统计方法按照变量的多少分为单变量统计方法和多变量统计方法。常用的单变量统计方法有t检验、非参数检验、方差分析，主要用于实验-对照类研究中寻找两组间的差异代谢物[27]。多变量分析方法有传统算法和机器算法两类，常用的传统算法有偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）[28]及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA)、主成分分析（PAC），以上又称为模式识别方法，适用于构建预测模型[29]。机器算法应用日益广泛[30]，目前常用的有随机森林（RF）[31]、支持向量机(SVM)[32]、神经网络(ANNs)[33]等。经以上手段获取具有统计学意义的数据，再与多种生化及代谢的数据库对比，继而对所得物质筛选鉴定，最终寻找到潜在的代谢标志物。
2. 代谢组学在乳腺癌中的应用
2.1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中的应用
Catarina等[34]采用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析了40位BC患者和38位对照（CTL）健康志愿者尿液代谢谱，采用K-S非参数检验和t检验及OPLS-DA等模式识别方法，发现BC患者肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等代谢物表现出高敏感性和特异性，代谢途径分析表明，差异代谢物出现可能与BC患者甘氨酸、谷氨酸、丁酸、糖酵解、TCA循环、牛磺酸和丙酮酸代谢途径遭到破坏有关。获得的差异代谢物具有作为生物标志物的潜力，可将BC患者与CTL区分，应用于早期诊断。
约1/4乳腺癌细胞都是三阴性乳腺癌细胞（TNBC），其特点是易转移浸润且复发率高[16]。Fang等[35]基于早期发现的40种氨基酸目标化合物，使用亲水作用色谱法-串联质谱（HILIC-MS/MS），对TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞36种细胞内和34种细胞外小分子物质进行代谢组学分析。运用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验及OPLS-DA模式识别方法研究，发现与正常细胞相比，两种乳腺癌细胞氨基酸代谢库均明显扩大；与非TNBC相比，TNBC细胞内谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰丝氨酸和N-乙酰甲硫氨酸代谢明显增加(变化倍数>2，P<0.01, VIP>1)，TNBC对细胞外谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸摄取显著增加，对谷氨酸和L-半胱氨酸-谷胱甘肽排泄升高(P<0.01，VIP>1)。研究结果表明，TNBC细胞具有独特的氨基酸代谢特征，对其量化分析可为TNBC患者提供更多新的早期治疗目标靶点。
Daniele等[36]使用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS），对23名BC患者和35名口腔健康妇女唾液进行非靶向代谢组学分析，使用t检验、卡方检验等单因素统计方法，对比METLIN数据库，鉴定出乳腺癌组中有31种化合物上调（P<0.05），其中，患者与健康人群相比，发现7种寡肽（H-Arg-Arg-Ser-OH，H-His-Lys-(Ala-Ser)-OH or (Gly-Thr)-OH，H-Ala-Lys-Phe-Trp-OH or H-Gly-Lys-Thr-Ser-OH or H-Arg-Arg-Ser-Ser-OH，H-Phe-Ile-Gln-Arg-OH，H-Glu-Phe-Gln-Arg-OH or H-Ile-Lys-Gln-Trp-OH，H-Phe-Lys-Lys-Trp-OH or H-Phe-Gln-Arg-Tyr-OH，H-Phe-Phe-Gln-Trp-OH）和6种甘油磷脂（PG14∶2、PA32∶1、PS28∶0、PS40∶6、PI31∶1、PI38∶7）表达上调，表现出明显的代谢差异，说明唾液代谢物有望区分乳腺癌患者和健康人群，适用于早期诊断。
依据不同亚型乳腺癌患者的代谢物差异性可以用于乳腺癌诊断甚至个性化治疗。Leticia等[37]采集了4种常见LA型、LB型、HER2+型和TN型乳腺癌患者和健康对照组的血浆样本，利用非靶向超高液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）代谢组学方法进行分析，通过单变量非参数Wilcoxon秩和检验区分乳腺癌患者和健康受试者的数据差异，多变量PAC和PLS-DA评价统计模型质量，初步确定了4种乳腺癌分子亚型中变化显著的代谢物：LA，TN和HER2分子亚型患者血浆中L-色氨酸浓度显著降低，可能与L-色氨酸代谢激活芳烃受体帮助癌细胞免疫逃逸有关[38]；4种亚型乳腺癌患者磷酸乙醇胺、磷脂血浆浓度降低，提示乳腺癌中脂质代谢差异具有重要意义。上述代谢组学数据表明，色氨酸和部分脂质具有作为乳腺癌诊断的生物标志物潜力，有望推动乳腺癌患者血浆诊断和个性化治疗的发展。
基于以上研究，笔者对代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现部分特征代谢物的应用进行归纳总结，见表1。
表 1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现的特征代谢物作者 样本来源 技术方法 统计学方法 特征代谢物 Catarina等 尿液 1H-NMR K-S非参数检验和t检验与PAC,PLS-DA和OPLS-DA 肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、
α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等Fang等 TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞 HILIC-MS/MS Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验与OPLS-DA 胞内：谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、
N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甲硫氨酸
胞外：谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸谷氨酸、
L-半胱氨酸-谷胱甘肽Daniele等 唾液 UPLC-Q-TOF-MS t检验、卡方检验等 7种寡肽和6种甘油磷脂 Leticia等 血浆 HPLC-HRMS 非参数Wilcoxon秩和检验、PAC、PLS-DA 色氨酸、磷酸乙醇胺、磷脂 综上所述，基于代谢组学，针对不同乳腺癌患者所能提供的研究样品，采用合适的仪器、数据分析方法获取差异显著的内源性小分子代谢物信息，有效减小检查手段对乳腺癌患者造成的机体损伤，并丰富乳腺癌早期诊断方法，使代谢组学成为乳腺癌早期诊断的有力辅助工具。
2.2 代谢组学在乳腺癌药理研究和药效评价中的应用
癌细胞无限增殖需要大量的能量和物质基础。癌细胞具有特殊的代谢方式，即在有氧条件下倾向于糖酵解而不是三羧酸循环来产生能量[39]，这种新陈代谢重编程称为Warburg效应[40]。一方面，糖酵解中间产物可以合成肿瘤细胞生长所需蛋白质和脂质等生物大分子[41]，同时线粒体损伤可限制丙酮酸进入，使更多丙酮酸在胞质内通过无氧氧化释放能量[42]。另一方面，癌细胞可持续摄取营养物质[43]以及通过加强糖异生途径弥补Warburg效应缺陷。基于癌细胞特殊的代谢重编程，通过药物代谢组学分析，监测机体用药后内源小分子代谢物变化有利于乳腺癌药理研究和药效评估。
Ghanem等[44]对经抗坏血酸处理的管腔和基底样乳腺癌细胞，进行了代谢组学分析，结合细胞存活率数据，发现高剂量抗坏血酸使得乳腺癌细胞糖酵解过程中磷酸丙糖途径（PPP）被严重破坏，ATP水平下降，代谢物重新定向积累为脂质小滴，以及磷酸戊糖途径中代谢物和酶活性增加；细胞死亡依赖于抗坏血酸诱导的氧化应激和ROS积累、DNA损伤以及细胞内辅助因子(包括NAD+/NADH)耗竭效应。综上表明，高剂量抗坏血酸通过诱发乳腺癌细胞“氧化还原危机和能量灾难”发挥细胞毒作用。
Arminan等[45]通过NMR技术检测及主成分分析方法分析处理数据，以评估在N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-阿霉素共聚物（HPMA-Dox）影响下体外细胞培养模型和体内原位乳腺癌模型的精准抗癌效果，并结合蛋白质表达和流式细胞技术，研究了给药前后原位乳腺癌患者内源性小分子化合物相关生化改变，发现与游离Dox给药相比，用HPMA-Dox进行治疗后，乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解减弱，磷脂水平降低，且HPMA-Dox在体内模型的血液循环时间增加，同时肿瘤储积高、心脏储积低，说明HPMA-Dox药代动力学加强、组织分布得以优化。提示HPMA-Dox可作为一种更精确的抗癌药物模式用于乳腺癌临床治疗。
Panis等[14]将120名单侧乳腺浸润性癌患者随机分为未经化疗组(CA组，n=50)、单剂量短期紫杉醇静脉滴注组(PTX组，n=30)、心脏剖面健康组(CTR组，n=40)，采用LC-MS对其血浆样品进行分析后发现，与CA组乳腺癌患者相比，单剂量短期紫杉醇静脉滴注可使患者血浆高密度脂蛋白水平显著降低，过氧化氢水平升高；与CTR组相比，PTX组患者C反应蛋白和肌酸激酶分数明显升高。以上表明单剂量短期紫杉醇静脉滴注就足以引起脂质代谢显著改变，可能导致毒性累积效应，进一步增加乳腺癌患者心脏病发生风险。可见，代谢组学可参与化疗药物给药优化方案研究，提高药物抗癌效果。
左旋肉碱、酰基肉碱和相关酶是癌症代谢网络中的重要介质。以往研究中LC-MS对乳腺癌中左旋肉碱、酰基肉碱的研究都是均质组织分析，缺乏异质性癌症组织中肉碱的空间分布差异[46]。Sun等[47]利用MSI对异种移植小鼠模型和人类癌组织样本及正常组织中的17种肉碱进行成像并开发了高空间分辨率基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）方法，发现由170个癌症样本和128个正常样本组成的肉碱谱模型能准确区分乳腺癌，L-肉碱和短链酰基肉碱在人类乳腺癌和异种移植小鼠模型中都有显著改变，乳腺癌中由肉碱系统介导的β氧化代谢途径改变，并且首次发现代谢酶CPT2和CRAT在乳腺癌组织中差异表达。证明肉碱代谢在乳腺癌的代谢物和酶水平上都被重新编程。
2.3 代谢组学在乳腺癌疾病进程监测及预后评估中的应用
心理神经病症(PN)是指许多乳腺癌患者在化疗期间及化疗之后出现疼痛、疲劳和抑郁症状。Debra等[48]使用液相色谱高分辨率质谱法对19位早期乳腺癌女性化疗前后血清样本分别进行非靶向和靶向代谢组学分析，非靶向分析发现化疗后乳腺癌患者乙酰-L-丙氨酸和硫酸吲哚酚浓度升高，5-氧代-L-脯氨酸浓度降低；色氨酸途径靶向分析表明尿氨酸水平、犬尿氨酸/色氨酸水平升高。t检验和Pearson相关系数进一步揭示上述差异代谢物与PN症状显著相关，促进了早期乳腺癌女性PN症状发展程度生物学机制研究。
研究表明，患者他莫昔芬体内代谢物因多昔芬浓度与雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌复发有关[49]，同时他莫昔芬本身和其他代谢物也表现出抗雌激素抗肿瘤活性[50]。Vries等[50]用细胞增殖法测定他莫昔芬、(Z)-因多昔芬、(Z)-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬抗刺激素活性，建立抗雌激素活性评分模型(AAS)，采用Cox回归方法研究AAS与复发的关系，证明因多昔芬浓度可作为他莫昔芬和代谢物抗雌激素作用的代替，与乳腺癌复发显著相关。
Kamil等[51]用LC-MS/MS对小鼠原位接种4T1转移性乳腺癌细胞进行血浆代谢组学分析和脂质组学分析，建立PLS-DA模型。结果显示，荷癌小鼠癌细胞早期转移表现为L-精氨酸代谢减弱，精氨酸酶和多胺合成增强；晚期转移表现为精氨酸代谢途径改变，不对称二甲基精氨酸血浆浓度升高，能量代谢重新编程为糖酵解，戊糖磷酸途径加速以及三羧酸循环速率降低，脂质分布模式改变，包括总磷脂酰胆碱减少，与二酯结合的磷脂分数减少以及溶血磷脂增加，以上代谢变化在一定程度上表征了癌症转移进展。
目前，OncotypeDX 21基因表达检测技术常用来评估乳腺癌的复发以指导乳腺癌治疗，但在临床的不确定性和基因组不一致的情况下，许多早期乳腺癌的患者仍然会受到过度治疗[52-54]。McCartney等[55]利用1H-NMR分析了87例内分泌受体阳性、HER2阴性早期乳腺癌（eBC）患者血清，使用RF建立eBC患者复发风险的统计模型。最终根据代谢组学特征进一步细分复发风险，并有效区分了每个Oncotype风险分类：在7例复发中代谢组学分析准确预测了其中的6例，1例复发发生在低风险组，3例发生在中风险组，3例发生在高风险组，成功建立了一种通过血清代谢组学分析进一步完善OncotypeDX基因检测风险评分的方法。
3. 总结与展望
乳腺癌在全球发病率日益上升，长期困扰广大女性健康，成为全球医疗卫生领域研究焦点[56]。目前，乳腺癌的早期诊断、药物开发应用以及预后测评等方面还需攻克众多难关，迫切需要新的研究技术的支持。代谢组学以高通量、高灵敏度为特征的技术在乳腺癌领域应用日趋广泛，为乳腺癌潜在代谢标志物的筛选，药物靶点发现、药物潜在作用机制等提供新思路[11]。与其他研究方法相比，代谢组学具有无创取样、研究对象相对简单、检测工作量较小、可实现实时监测、全面综合分析等明显优势。同时，代谢组学作为一门新兴组学，虽然已取得部分进展，但本身发展仍处于探索阶段，应用于临床实践还有所不足：代谢组学研究具有数据维度高的特点，采集与处理过程中可能存在信息丢失、低含量差异代谢物可能被掩盖的问题；数据库不够完善，目前大量未知代谢物的结构鉴定和细胞功能研究困难，对已鉴定出产物的变化机制研究大多仍不明确难以直接指导临床；联用技术操作和数据分析处理的综合性专业人才储备不足等。在精准医疗浪潮推动下，进一步完善代谢组学研究的标准化流程后，利用代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白组学以及微生物菌群学[57]对乳腺癌进行多学科技术互补、大数据综合分析，将有利于乳腺癌的早期诊断、发病机制研究以及疾病预后相关诊疗方案的系统优化，为乳腺癌个性化靶向治疗提供更合理的科学指导。
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表 1 载药量对微丸特性的影响
载药量（%） 圆整度(θ/°) 收率（%） 物料黏性 27 21.2 95.76 黏性适中，手握成团，轻压即散 40.5 23.7 89.64 黏性略大，易捏合成团 54 24.1 74.38 黏性极大，易黏附于器壁 
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表 2 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 96.24 23.0 50.24 2 20 700 5 93.33 21.5 50.33 3 20 900 7 82.68 22.0 38.68 4 30 500 5 95.41 24.0 47.41 5 30 700 7 92.70 21.0 50.70 6 30 900 3 81.02 24.0 33.02 7 40 500 7 93.82 22.5 48.82 8 40 700 3 93.24 23.0 47.24 9 40 900 5 83.54 25.0 33.54 均值1 46.417 48.823 43.500 均值2 43.710 49.423 43.760 均值3 43.200 35.080 46.067 极差 3.217 14.343 2.567
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表 3 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 17.933 2 0.127 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 394.970 2 2.789 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 11.976 2 0.085 5.140 P>0.05 误差 424.88 6
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表 4 L9(34)正交试验设计与结果
实验编号 因素 收率(Y/%) 圆整度(θ/°) Y-2θ A挤出速度（Hz） B滚圆速度（r/min） C滚圆时间（t/min） 1 20 500 3 87.31 24.5 38.31 2 20 700 5 90.12 24.0 42.12 3 20 900 7 82.88 24.5 33.88 4 30 500 5 93.90 27.0 39.90 5 30 700 7 90.68 25.5 39.68 6 30 900 3 81.01 23.0 35.01 7 40 500 7 96.08 25.5 45.08 8 40 700 3 90.20 27.0 36.20 9 40 900 5 80.36 26.5 27.36 均值1 38.103 41.097 36.507 均值2 38.197 39.333 36.460 均值3 36.213 32.083 39.547 极差 1.984 9.014 3.087
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表 5 方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A挤出速度（Hz） 7.514 2 0.138 5.140 P>0.05 B滚圆速度（r/min） 136.912 2 2.517 5.140 P>0.05 C滚圆时间（t/min） 18.771 2 0.345 5.140 P>0.05 误差 163.20 6
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表 6 肠溶微丸不同释药行为的拟合方程
模型 拟合方程 r 零级 Q=3.298t+4.231 0.8303 一级 ln(1−Q)=144.633 t+0.037 0.8966 Higuchi Q=25.075 t1/2−36.962 0.9054
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