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信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一种信号转录蛋白[1]。该蛋白在结构上主要有N末端、卷曲螺旋、DNA接合、连结、SH2和转录激活区域6个位置域[2]。现有的研究结果表明，STAT3抑制剂可靶向作用于STAT3蛋白的不同结构区域，抑制其在细胞中的表达，为抗炎、抗癌治疗提供思路[3-4]。
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近年来研究者对STAT3蛋白的探索不断加深，对其在体内的活化机制也有清晰的发现[5]。STAT3在细胞质中分析信号、转导，在细胞核中转录激活[6]。STAT3蛋白在细胞中扮演着重要角色，可影响细胞的生长凋亡机制，研究者们观察到失控的STAT3在异常激活中会导致细胞发生恶性转化，对肿瘤细胞的形成和发展具有重要影响[7]。
STAT3的激活可通过各种细胞因子、生长因子和激素与细胞表面的受体结合而实现。在Janus激酶（JAK）-STAT3信号途径中，细胞因子与细胞膜上的蛋白受体结合，成为二聚体。二聚体在细胞质中募集并激活JAK激酶蛋白，激活的JAK蛋白磷酸化受体酪氨酸残基。随后，STAT3的Tyr705残基被JAKs磷酸化，STAT3蛋白被活化再形成二聚体后，从细胞质转移到细胞核中，与特异性DNA反应元件结合，最终调节STAT3靶基因的表达[8]。
STAT3的每个结构域各有其独特的生物作用。STAT3的N末端结构域对STAT3二聚体核易位以及DNA结合具有重要作用；卷曲螺旋结构域对STAT3与各种蛋白质的协同效应具有一定影响。DNA结构域可匹配特殊的DNA序列，然后形成STAT3-DNA复合物。连接区域参加与细胞转录系统的相互作用。SH2结构域对于STAT3二聚化也至关重要。因为在肿瘤细胞中的过度激活现象，以及抗STAT3的抑制剂对于抗炎免疫具有良好效果，STAT3已成为近年来药物研发的一个热门方向，研究人员纷纷投入巨大热情，不断挖掘STAT3的医药价值[9-10]。
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STAT3抑制剂可靶向作用于STAT3蛋白，抑制其在癌细胞中的磷酸化、二聚化以及核易位，使其转录功能丧失，有可能为疾病治疗提供新方向[11]。
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Turkson等[12]研究了STAT3的结合肽PY*LKTK（Y*代表磷酸酪氨酸）在体外破坏STAT3活性的能力。核提取物中PY*LKTK的存在会导致STAT3的DNA结合活性水平显著降低，因此破坏了核易位。作为肽直接抑制STAT3的功能重要性的证据，发现PY*LKTK-mts（mts，膜移位序列）可在体内选择性抑制组成型和配体诱导的STAT3激活。此外，PY*LKTK-mts可抑制Src癌蛋白的转化。Turkson通过确定了抑制STAT3信号转导的最小肽，为使用该肽作为新型拟肽药物进行临床治疗STAT3异常激活的疾病提供了概念基础。
Timofeeva等[13]在表征STAT3-N末端域的选择性抑制剂ST3-H2A2的作用中，观察到该化合物使凋亡基因强烈激活，在癌细胞中诱导细胞凋亡。通过DNA-chip技术和平铺人类启动子阵列技术，发现响应ST3-H2A2的基因在表达激活的同时会伴随着STAT3染色质结合而改变。此外，将siRNA敲低可证实ST3-HA2A对基因表达和染色质结合的影响是STAT3依赖性的，而C/EBP同源蛋白（CHOP）启动子的STAT3结合区位于癌细胞中染色质的DNase I超敏位点中，而不是未转化细胞中，这表明STAT3结合和抑制作用极有可能与染色质结构有关。因此我们猜想，STAT3-N末端选择性抑制剂可调节癌细胞凋亡基因的表达，促使细胞凋亡，为癌症治疗提供新方案。
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Huang等[14]使用计算机虚拟筛选（AlloFinder）的途径对STAT3的C端卷曲螺旋区域（CCD）进行匹配，通过对分数排名前15的化合物进行生物测定，筛得理论最佳化合物K116（图1）。在此化合物的作用下，荧光偏振显示STAT3的IC50值为7.99 μmol/L。在免疫印迹实验中，STAT3的Y705磷酸化被抑制，而上游的激酶Src及其磷酸化无影响。同时，在肿瘤细胞株MDAMB-468及DU145中，K116表现出对STAT3很强的抑制，IC50为4.46和23.85 μmol/L，表明K116具有良好的特异性抑制STAT3的作用。从K116的研究历程来看，未来进行虚拟筛选的计算化学方法将逐步成为药物研发的一种趋势，在此趋势发展的初期，我们还需要不断改进底层算法并完善数据库内容。
图 1 化合物K116的化学结构
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Huang等[15]通过使用改进的虚拟筛选策略靶向STAT3的DNA结合域（DBD），得到了靶向STAT3-DBD的小分子化合物inS3-54（图2）。采用[32P]标记的DNA双链探针及电泳迁移率变动分析表明，inS3-54选择性抑制STAT3与DNA的结合，而对STAT1无影响。与非癌细胞相比，inS3-54优先抑制癌症细胞的增殖，抑制STAT3下游靶基因的表达和STAT3原位结合染色质。因为inS3-54不与SH2结构域相连接，不抑制STAT3二聚化，但可以抑制STAT3与基因组DNA的结合。inS3-54代表了一种新型探针，对于开发靶向STAT3的DBD域特异性抑制剂具有积极意义。
图 2 化合物inS3-54的化学结构
Buettner等[16]为了证明化合物C48（图3）可作为STAT3的选择性抑制剂，使用定点诱变和多种生化技术，探明C48将STAT3中的Cys468烷基化的过程。进一步研究证明，C48会在STAT3过度表达的肿瘤细胞系中阻止STAT3核易位，导致小鼠体内肿瘤生长的显著抑制。这些发现表明，STAT3中的Cys468代表了一个新的治疗干预位点，并推测烷基化有望成为STAT3相关类型癌症的潜在治疗方法。
图 3 化合物C48的化学结构
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Cheng等[17]研究化合物6-OAP(图4)与肺癌细胞的作用关系，发现该化合物在H1975和A549细胞中以剂量和时间依赖性的方式抑制了STAT3的转录(抑制位点Tyr705)，进而抑制由IL-6等细胞因子诱导的STAT3的活化、磷酸化与二聚体的形成。6-OAP在STAT3的SH2结构域与Ser611/Ser613/Arg609形成氢键，阻碍IL-6诱导的STAT3磷酸化，对肺癌细胞和对S期激酶相关蛋白转录有抑制作用。药理实验表明，6-OAP抑制静脉注射肺癌细胞的SCID小鼠的肿瘤生长。6-OAP的效果优异，毒副作用较小，有望进一步挖掘其药用价值。
图 4 化合物6-OAP的化学结构
Schust等[18]从化学数据库中通过模拟筛选得到化合物Stattic（图5）。Stattic能有效抑制STAT3的SH2结构域，对STAT3的激活、二聚化和核易位等关键步骤有阻滞作用。将MDA-MB-231和MDA-MB-435S细胞在指定浓度下用Stattic处理2 h，对STAT3、p-STAT3和其他信号分子(JAK1/JAK2等)的全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，证明了Stattic对STAT3的磷酸化有显著的抑制效应，且其特异选择性较高，有潜力成为高效的STAT3抑制剂。
图 5 化合物Stattic的化学结构
Chen等[19]通过传统的有机合成方法得到了化合物HJC0152（图6），发现其对人乳腺癌和胰腺癌细胞显示出比氯硝柳胺相似或更高的效力。经过结构修饰后（将苯环上的烷氧基改为氨基）的HJC0152显示出优异的水溶性，与氯硝柳胺相比提高了约3 300倍。在光学显微镜的观察下，将MDA-MB-231乳腺癌细胞用化合物HJC0152处理48 h，观察细胞形态变化，发现细胞周期进程被抑制，细胞凋亡变得更加常见。在带有乳腺肿瘤异种移植物的裸鼠中，HJC0152显著抑制了肿瘤的生长。从这些结果中推测，具有更好水溶性的化合物HJC0152有望被开发成用于癌症治疗的口服生物利用剂。
图 6 化合物HJC0152的化学结构
Shin等[20]首次报道了隐丹参酮（图7）抗癌活性是通过抑制STAT3实现的。隐丹参酮可快速抑制DU145人前列腺癌细胞中的STAT3的Tyr705磷酸化，降低STAT3下游靶蛋白的表达。隐丹参酮抑制STAT3磷酸化是由独立于JAK2的机制引起的，且不影响上游酪氨酸激酶。隐丹参酮可直接与STAT3分子结合（STAT3的SH2结构域），抑制其二聚化，并下调细胞周期蛋白D1、Bcl-xL和survivin的表达，使G0-G1期的细胞蓄积，降低STAT3转录调控活性。这些结果表明，隐丹参酮是良好的STAT3靶向抑制剂。
图 7 隐丹参酮的化学结构
Iwamoto等[21]研究发现，苯达莫司汀（BENDA，图8）作为一种烷化剂，对多种癌症具有临床活性，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤等。BENDA可以选择性结合细胞中的STAT3并抑制其活性，BENDA在体外选择性地拮抗STAT3-SH2结构域（IC50=7.4 μmol/L），而不是其他含有SH2的蛋白质（拮抗STAT1-SH2的IC50为60 μmol/L）。BENDA结合到STAT3中的半胱氨酸残基Cys550和Cys712位置上，从而抑制SH2与相应的p-Tyr肽的结合。
图 8 苯达莫司汀的化学结构
Chang等[22]研究发现，STAT3抑制剂BBI608（图9）是降低EGFR阳性肺癌细胞系细胞活力的潜在药物。BBI608可降低组蛋白甲基转移酶G9a介导的表皮生长因子受体3表达，抑制EGFR阳性肺癌（包括EGFR E746-A750 HCC827、WT-A549和T790 M H1975）的细胞活力。在与阿法替尼的对照实验中，BBI608更为明显地降低了A549和H1975细胞的生存能力，并降低了A549的细胞迁移。因此，BBI608极有潜力成为EGFR阳性肺癌的治疗药物。
图 9 化合物BBI608的化学结构
研究表明，STAT3在各种类型的癌症中被组成性激活，并且直接参与癌细胞的免疫调节。Shastri等[23]对骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓性白血病（AML）患者的造血干细胞和祖细胞群体进行转录组分析，发现STAT3存在异常激活现象，而敲除STAT3后，体内白血病细胞的生长也受到了抑制，各类癌基因在恶性细胞中的表达也随之下降。
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STAT3在多种实体瘤和血液性肿瘤中会过度激活，对肿瘤的发生和发展有着重要影响。因此，STAT3作为治疗肿瘤的新靶点已被研究人员所认同；同时，STAT3抑制剂对抗炎免疫有重要作用，在类风湿性关节炎等疾病研究中颇有成效。21世纪以来，STAT3抑制剂的临床前研究不断深入，但进入临床使用的药物却很少。因此，研发高效、低毒的STAT3抑制剂仍将是一种挑战。近年来，研究人员将多种天然产物（如雷公藤红素等）作为先导化合物，合成了更有效的小分子化合物，通过不断筛选、评价和选择活性大、特异性强的STAT3抑制剂，将中西医药物治疗与放疗、化疗结合，这可能是今后的STAT3研究方向之一，为抗肿瘤以及抗炎免疫研究提供新方向。
Research progress of STAT3 inhibitors
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摘要: 信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一种信号转录蛋白。STAT3的异常激活与细胞的增殖、分化、癌变等密切相关，其在乳腺癌、胰腺癌、淋巴癌、肺癌等癌干细胞中存在异常表达。因此，抑制STAT3的异常表达已成为抗炎免疫、抗肿瘤治疗的一种新思路。Abstract: Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is a signal transcription protein that exists in the cytoplasm. The abnormal activation of STAT3 is closely related to cell proliferation, differentiation, and canceration. It has abnormal expression in cancer stem cells such as breast cancer, pancreatic cancer, lymphoma, and lung cancer. Therefore, inhibiting the abnormal expression of STAT3 has become a new approach for antitumor therapy.
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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