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Wentilactone A（WA）是从海洋微生物中分离得到的去甲二萜类小分子化合物，对小细胞肺癌细胞系NCI-H460和NCI-H446细胞的增殖具有抑制作用，可诱导小细胞肺癌细胞系NCI-H446和NCT-H1688细胞凋亡[1]。对小细胞肺癌细胞系NCT-H1688细胞的细胞迁移和集落形成具有抑制作用[2]。WA作为一种有效抗肿瘤候选物，已从制备工艺、理化性质、急性毒性、生殖毒性等方面证明其良好的成药性[3]。遗传毒性安全性实验更是对其临床前研究全面性的补充，为提高临床用药的安全性，为了验证其是否具有遗传毒性，本实验应用微生物回复突变试验（Ames试验）、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验方法对WA的遗传毒性进行了系统的研究，为WA的临床前毒性评价提供资料[4]。
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Ames试验用WA（含量：99.9%，批号：20121115，黄色粉末）、体外培养CHO细胞染色体畸变试验用（规格：10 ml，含量：50.8 mg/ml，批号：20130506，黄色澄明溶液）、小鼠骨髓微核试验用WA（规格：10 ml/支：100mg，含量：10.2 mg/ml，批号：20130407，黄色澄明溶液），均由海军军医大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室提供。WA的化学结构见图1。
图 1 Wentilactone A的结构式
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组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株，复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室赠予。实验前对其进行鉴定（R因子和自发回变数鉴定），均符合规定标准。
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中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。
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ICR小鼠（SPF级）共60只，每组10只，雌雄各半，5～6周龄，购入时体重16.5～20.8 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：2008001629237。自购入起3天进行检疫，给药时体重20.3～23.6 g。
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按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》[5-6]的设计要求，分别应用Ames试验[7]、体外培养CHO细胞染色体畸变试验[8]和小鼠骨髓微核试验[9]检测WA的遗传毒性。检测终点覆盖了基因突变、染色体畸变和细胞有丝分裂异常。
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根据《药物遗传毒性研究技术指导原则》的要求，应用S. typhimurium TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535共5支菌株，设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组。此外，设空白对照、溶剂对照和阳性对照组（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在加和不加代谢活化系统S9的条件下接触受试物，每皿均加入供试品或溶剂对照DMSO 0.1 ml，每个剂量组及对照组均设3个平行皿。并用最低极限的琼脂培养基培养48 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶剂对照组进行比较，重复实验一次。
表 1 阳性对照品名称及浓度
组别 菌株 阳性对照品 溶液终浓度（μg/皿） 加入量（μl/皿） 浓度（μg/ml） －S9组 TA97 敌克松 50 100 500 TA98 敌克松 50 100 500 TA100 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA102 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 0.5 100 5 +S9组 TA97 2-氨基芴 10 100 100 TA98 2-氨基芴 10 100 100 TA100 2-氨基芴 10 100 100 TA102 1,8-二羟基蒽醌 50 100 500 TA1535 环磷酰胺 50 100 500 -
在加和不加代谢活化系统S9的条件下，体外培养的CHO细胞中加入相应浓度的供试品或对照品，反应体系总体积为10 ml。低、中、高剂量组供试品终浓度分别为23.74、47.48和94.96 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5 μg/ml、60 μg/ml，另设溶剂对照组分别作用于细胞4 h后换液继续培养至24 h，和药物作用细胞24 h后收集细胞。收获细胞前4 h，加入终浓度0.2 μg/ml秋水仙素，培养结束收集细胞，经离心、低渗处理、固定、离心、制片和Giemsa染色，每个剂量组制备2～3张玻片标本。
镜检时每组观察200个染色体中分散良好、数目完整的中期分裂相细胞（若观察到大量染色体畸变细胞，如阳性对照组，分析细胞数可相应减少为至少100个细胞）。计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），记录原始数据计算畸变率。
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检疫期结束后分别按低、中、高组小鼠给药，分别予100、200、400 mg/kg剂量给药，其中高剂量组设两组分别在药物作用24 h和48 h后处死，并设阳性对照组和溶剂对照组。分别在药物作用24 h和48 h后处死小鼠，取股骨骨髓制成骨髓涂片，每只动物制2张涂片，经甲醇固定后用pH6.8的Giemsa染液染色。
每只动物镜检约2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE值。
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对于易溶无毒的化合物，细菌实验最高浓度应达到5 mg/皿[10]。Ames试验设每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量组，每皿均加入相应浓度的供试品溶液0.1 ml，另设空白对照、溶剂对照和阳性对照。在哺乳动物细胞体外遗传实验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率[11]。通过预实验确定供试品的IC50为94.96 μg/ml。染色体畸变试验的低、中、高剂量组为23.74、47.48和94.96 μg/ml，试验时在10 ml的试验体系中分别加入0.1 ml各剂量组的应用液，另设阳性对照组和溶剂对照。ICR小鼠的微核试验采用小鼠经尾静脉注射给药，总剂量分别为100、200、400 mg/kg（单次给药剂量分别为50、100、200 mg/kg，分上、下午两次经尾静脉注射给药），给药容积为20 ml/kg体重；同时设阳性对照组和溶剂对照组。阳性对照组以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺，给药容量为10 ml/kg体重；溶剂对照组给药方式与受试物组相同，以20 ml/kg体重的容积经尾静脉注射生理盐水。
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Ames试验结果的评价是以溶剂对照组的回复突变菌落数为基础，与受试物各剂量组相比较。若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在着剂量-反应关系，则判断为阳性[12]。染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验均采用卡方检验或方差分析方法研究给药组与对照组之间是否具有统计学意义[13]。
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受试物各剂量组和对照组的平皿均可见背景菌苔生长。5支菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史参考范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落与空白对照组相比数目显著增加，提示本试验系统符合要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象。各剂量组受试物在加或不加S9时对TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535所诱发的回复突变菌落数均与自发的突变菌落数相近，未观察到明显的剂量-反应关系。结果见表2和表3。
表 2 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，
${\rm{\bar x}}$ ±s)（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4 空白对照组 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4 溶剂对照组 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1 阳性对照组 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13 表 3 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，
${\rm{\bar x}}$ ±s)（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4 空白对照组 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4 溶剂对照组 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4 阳性对照组 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22 -
染色体分析结果显示，阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h在+ S9和－S9的情况下染色体畸变率分别为11%和11%，与溶剂对照组相比，均有统计学差异（P<0.05）；23.74、47.48和94.96 μg/ml受试物在24 h、+S9条件下染色体畸变率分别为1%、1%和0.5%，24 h、－S9条件下染色体畸变率分别为0%、0.5%和0%；4 h、－S9条件下染色体畸变率分别为0%、0%和0%。综上，受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比，其差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表4~6。
表 4 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(+S9)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 1 1 0 0 0 0 0 1 2 1 47.48 μg/ml 200 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶剂对照组 200 200 0 0 0 0 0 3 3 3 1.5 阳性对照组 100 9 0 0 1 3 3 0 0 14 14 注：阳性对照组：+S9、环磷酰胺（60 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；* P<0.05，与溶剂对照组比较。 表 5 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性对照组 100 4 4 0 0 0 0 4 0 12 12* 注：阳性对照组：－S9、丝裂霉素C（0.5 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；*P<0.05，与溶剂对照组比较。 表 6 WA对4 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9/4 h)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 阳性对照组 * P<0.05，与溶剂对照组比较。 -
试验结果经统计学分析表明，WA在100、200、400 mg/kg剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组和阳性对照组雌、雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为2.10‰和21.36‰、1.90‰和20.88‰，两组相比差异均有统计学意义（P<0.05），验证了本次试验系统的有效性。WA 100和2 000 mg/kg剂量24 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为1.60‰和1.80‰、1.90‰和1.60‰；400 mg/kg剂量24 h和48 h采样组雌、雄小鼠骨髓PCE微核率分别为2.10‰和2.80‰、2.40‰和1.29‰，与溶媒对照组相比均无显著差异（P>0.05）。结果见表7。
表 7 WA对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果
组别 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（${\rm{\bar x}}$±s） 微核率（${\rm{\bar x}}$±s, ‰） 100 mg/kg 雌 5 10 020 2.40±0.89 1.60±0.96 200 mg/kg 雌 5 10 010 1.63±0.40 1.80±1.31 400 mg/kg (24 h采样) 雌 5 10 016 1.95±0.40 2.10±1.20 400 mg/kg (48 h采样) 雌 5 10 009 1.58±0.44 2.80±1.81 溶媒对照组 雌 5 10 009 2.37±0.69 2.10±1.20 阳性对照组 雌 5 9 095 2.18±0.30 21.36±7.84* 100 mg/kg 雄 5 10 016 1.56±0.30 1.90±1.28 200 mg/kg 雄 5 10 009 1.52±0.28 1.60±0.70 400 mg/kg (24 h采样) 雄 5 10 006 1.40±0.73 2.40±2.01 400 mg/kg (48 h采样) 雄 5 8 802 1.43±0.63 1.29±1.26 溶媒对照组 雄 5 9 029 2.13±0.58 1.90±1.45 阳性对照组 雄 5 10 011 1.62±0.42 20.88±4.94* *P<0.05，与溶剂对照组比较。 -
沙门菌回复突变试验（Ames试验）被研究者广为采用，该法的特点是快速、简便、敏感、经济，是经典的测试化学物质或药物致突变性实验[10]。染色体畸变分析是采用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞体外培养的方法进行的。CHO细胞在加或不加代谢活化系统的条件下，与受试物接触一定时间后再于收集染色体4 h前用秋水仙碱处理，使细胞的有丝分裂停止在中期相。然后收集细胞，经低渗、固定、涂片和染色后，在显微镜下观察染色体数量和结构的改变，检测受试物的诱变性[7]。微核试验是检测化合物对染色体损伤作用的重要方法。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化合物，微核试验都可检测[8]。
本研究采用遗传毒性研究经典组合的方法，分别从原核系统到真核系统，从体外试验系统到体内试验系统，体外试验中包含了加与不加代谢活化系统，能检测基因突变、染色体畸变等多个遗传学终点，符合国际标准化的要求[5-6]。
本研究结果显示，本试验条件下，采用标准平板掺入法，WA在每皿5 000、500、50、5、0.5 μg的受试剂量下，加或不加S9时对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌均无致突变性；对CHO细胞，在23.74、47.48、94.96 μg/ml 3个剂量组，加或不加S9，于24 h和48 h诱发的细胞染色体畸变率均小于5%，与溶剂对照组结果相比较其差异均无统计学意义（P>0.05），表明WA在受试剂量下无致CHO细胞染色体畸变效应；WA在100、200、400 mg/kg 3个剂量下，对ICR小鼠的微核诱发率与溶剂对照组比较均无显著差异，表明其在受试剂量下对ICR小鼠无致微核效应[14]。上述结果提示WA没有遗传毒性和潜在致癌性。
此前有文献表明WA对小细胞肺癌的增殖有抑制作用，但对于遗传毒性未见报道。本研究对降低WA在研发过程中用于临床试验和疾病治疗的用药风险发挥重要作用。
Genotoxicity evaluation of Wentilactone A
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摘要:
目的 检测Wentilactone A的遗传毒性。 方法 应用经典遗传毒性检测组合(Ames试验、体外培养CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验)检测Wentilactone A的遗传毒性。 结果 Ames试验结果提示，Wentilactone A在每皿5 000、500、50、5、0.5 μg 5个剂量下，在加和不加代谢活化系统（S9）时，对鼠伤寒沙门菌均无致突变性。CHO细胞染色体畸变试验结果提示，在终浓度23.74、47.48、94.96 μg/ml 3个剂量组，在加和不加S9中，于作用4 h和24 h的条件下培养的CHO细胞，均未诱发染色体畸变。小鼠骨髓微核试验在100、200、400 mg/kg 3个剂量下作用24 h以及400 mg/kg剂量下作用48 h对骨髓细胞的微核诱发率，与溶剂对照组比较均无显著差异（P>0.05）。 结论 Wentilactone A对鼠伤寒沙门菌无致突变性，对CHO细胞的染色体无致畸变作用，对ICR小鼠无诱发骨髓细胞微核的效应。上述结果提示Wentilactone A不具有遗传毒性和潜在致癌性。 -
关键词:
- Wentilactone A /
- Ames试验 /
- 染色体畸变试验 /
- 微核试验 /
- 遗传毒性
Abstract:Objective To evaluate the genetic toxicity of Wentilactone A. Methods The classical genotoxicity test combination (Ames test, in vitro CHO cell chromosome aberration test and mouse bone marrow micronucleus test) was used to detect the genotoxicity of Wentilactone A. Results Ames test suggested that Wentilactone A was not mutagenic against Salmonella typhimurium with or without the metabolic activation system (S9) at five doses of 5 000, 500, 50, 5, and 0.5 μg/dish. CHO cell chromosome aberration test suggested that the CHO cells cultured in 4 h and 24 h did not induce chromosomal aberrations in three dose groups at the final concentration of 23.74, 47.48, 94.96 μg/ml, with and without S9. The mouse bone marrow micronucleus test showed no significant difference in the bone marrow micronucleus induction rate of cells at three doses of 100, 200, and 400 mg/kg treated for 24 h and at dose of 400 mg/kg treated for 48 h compared with the solvent control group (P>0.05). Conclusion These results indicated that Wentilactone A did not exhibit genetic toxicity based on the Ames test, CHO chromosomal aberration test and micronucleus assay. It was suggested that Wentilactone A had no genetic toxicity and potential carcinogenicity. -
Key words:
- Wentilactone A /
- Ames test /
- chromosomal aberration test /
- micronucleus assay /
- genetic toxicity
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心脏瓣膜病为由多种病因引起的瓣膜狭窄或/和关闭不全所致的心脏病，是引起心力衰竭甚至心源性猝死的一个重要原因。人工瓣膜置换术是中-重度心脏瓣膜病的主要治疗手段之一，获得了良好而持久的临床结果，可有效改善患者心脏功能，提高生活质量[1]。人工心脏瓣膜分为机械瓣和生物瓣两大类。机械瓣具有较高的耐力和持久性，临床应用广泛，但最大的难题是患者必须终身抗凝且易发生血栓栓塞和出血，给患者的工作、生活带来诸多不变；生物瓣置换患者不必终身抗凝，但生物瓣寿命问题未获得满意解决，多数患者需面临二次手术。由于心脏瓣膜置换术后患者易出现血栓、感染、应激性溃疡（SU）等多种并发症，需同时使用多种药物，药物相互作用复杂[2]。患者术后需服用华法林进行抗凝治疗，该药个体用药差异大，需根据凝血指标调整剂量。尤其对于机械瓣膜置换者更要终身进行抗凝治疗，患者常因对抗凝治疗认识不足而影响用药依从性。鉴于此，临床药师通过协助医生对该类患者进行用药方案的制订、调整，及时发现患者出现的并发症、药物不良反应，对患者进行药学监护及抗凝治疗的用药教育对保证患者治疗的有效性及安全性具有重要意义。本文结合典型案例，提出临床药师参与心脏瓣膜置换术后患者药学服务的5个切入点，为临床提供参考。
1. 心脏瓣膜置换术后患者的抗凝治疗监护
心脏瓣膜置换术后患者需服用抗凝药物华法林，临床药师应协助医师根据凝血酶原时间（PT）和国际标准化比值（INR）监测值对华法林的剂量进行调整，并对患者进行密切的药学监护。关于此类患者的INR目标范围，参考国际相关标准并结合当前我国抗凝研究结果，我们建议：对于机械瓣置换患者的INR监测值，主动脉瓣单瓣置换为1.8～2.2，二尖瓣单瓣置换为2.0～2.5，主动脉瓣与二尖瓣双瓣置换为2.0～2.5，三尖瓣机械瓣置换为2.5～3.0；生物瓣置换患者为1.8～2.2[3-4]。
病例1：患者，男，50岁，因主动脉瓣钙化伴重度狭窄入院后行主动脉瓣置换（机械瓣）+升主动脉成形术，术后予华法林进行抗凝治疗，临床药师协助医师根据PT及INR值监测结果对华法林剂量进行调整。患者主动脉瓣机械瓣置换术，INR目标范围为1.8～2.2，术后PT、INR监测结果及华法林用量见表1。患者术后5天INR为1.04，医师予华法林片4.5 mg qd。根据《华法林抗凝治疗的中国专家共识》[5]，中国人华法林的初始剂量为1～3 mg，而该患者初始给予4.5 mg的负荷剂量，初期可能会因过度抗凝而加大栓塞风险，临床药师建议给予华法林片3 mg qd，医师接受。华法林作用发生缓慢，当日PT及INR复查结果反映的是2天前服药的效果，应根据凝血指标监测结果及时调整华法林剂量，INR<目标值下限：华法林加量，每次增加1/4片；INR>目标值上限：华法林减量，每次减少1/4片。该患者术后9天时INR2.65，超过目标值上限，临床药师建议医师将剂量减为2.25 mg qd，继续监测PT和INR，嘱患者住院期间出现皮下瘀斑、紫癜、牙龈出血、鼻衄、便血、黑便等症状及时告知医师及药师，并密切关注患者粪隐血、粪转铁蛋白、血小板计数、血红蛋白含量等化验指标的变化情况。患者术后11天INR2.79，仍未达标，华法林片继续减量至1.5 mg qd，患者术后13天INR2.01达标，抗凝治疗期间未出现出血相关症状。
表 1 病例1凝血功能监测及华法林剂量调整情况术后天数 剂量（m/mg） PT（t/s） INR d5 4.5 13.8 1.04 d6 3 − − d7 3 21.0 1.85 d8 3 − − d9 2.25 27.9 2.65 d10 2.25 − − d11 1.5 28.6 2.79 d12 1.5 − − d13 1.5 22.5 2.01 病例2：患者，女，69岁，因三尖瓣重度关闭不全；二尖瓣置换术后入院拟行介入下三尖瓣置换术。患者12年前行二尖瓣机械瓣置换术，入院前长期服用华法林抗凝，考虑到此次入院计划行三尖瓣置换术，故入院后停用华法林，根据《华法林抗凝治疗的中国专家共识》[5]，行外科手术患者可不采用桥接，华法林停药后术前INR可恢复至接近正常范围（INR<1.5），患者查INR为1.89，因计划次日手术，为减少患者出血风险临床药师建议临时给予维生素K120 mg im，降低INR，医师接受。患者次日行经导管三尖瓣介入置换术，术后予华法林进行抗凝治疗，患者术后PT、INR值监测结果及华法林用量见表2。患者三尖瓣介入置换术，INR目标范围为2.5～3.0，术后8天INR2.19，华法林1.5 mg qd，已使用4 d，仍在目标值下限，临床药师建议医师华法林加量0.75 mg，医师接受，予华法林2.25 mg qd，继续监测PT、INR值及患者抗凝过程中可能出现的出血症状及指标。患者术后10天INR达3.38，考虑到INR>3.0，临床药师协助医师调整抗凝治疗方案：停用华法林2 d，拟于第3天减量0.75 mg，医师按照此方案给药。患者于术后16天INR2.70达标，继续予以华法林1.5 mg qd，至术后18天患者INR维持在目标范围内，患者出院继续予华法林抗凝治疗。
表 2 病例2凝血功能监测及华法林剂量调整情况术后天数 剂量（m/mg） PT（t/s） INR d4 1.5 13.6 1.04 d5 1.5 − − d6 1.5 15.0 1.17 d7 1.5 − − d8 2.25 24.3 2.19 d9 2.25 − − d10 2.25 28.2 2.67 d11 2.25 − − d12 − 35.0 3.38 d13 − − − d14 1.5 15.5 1.22 d15 1.5 − − d16 1.5 28.5 2.70 d17 1.5 − − d18 1.5 28.0 2.65 2. 感染监测及抗菌药物合理应用与监护
心脏瓣膜置换术后患者感染预防与控制至关重要，临床药师可从以下几方面进行监护：① 围手术期抗菌药物的合理应用：心脏瓣膜置换术围手术期应预防性应用抗菌药物，可能的污染菌为凝固酶阴性葡萄球菌或金黄色葡萄球菌[6]，临床药师应提醒医生于术前0.5～1 h应用第一、二代头孢菌素，预防用药疗程要覆盖整个手术过程，可根据情况延至术后一段时间，如48 h[6]。②术后感染监测：心脏瓣膜置换术后患者易发生肺部感染、手术切口感染、心内膜感染等感染[7]，临床药师应关注患者是否有咳嗽、发热、创面脓性分泌物及白细胞、中性粒细胞升高等提示感染发生的症状及指标，及时提醒医师进行相关标本微生物送检、胸部Ｘ线等检查，发生感染时在抗菌药物治疗方案制订与调整方面为医师提供建议。③注意抗菌药物联用的影响：某些抗菌药物与华法林合用可能会存在相互作用，如头孢哌酮、红霉素、甲硝唑、喹诺酮类抗菌药可增强华法林的抗凝作用；利福平可抑制其抗凝作用[8]，因此临床药师应对患者进行全面的药学监护，减少抗菌药物与华法林联用对抗凝治疗的影响，同时注意应用抗菌药物可能出现的胃肠道反应、皮疹、肝酶升高等不良反应。
病例3：患者，男，60岁，因主动脉瓣重度狭窄入院后行主动脉瓣置换术。患者心脏瓣膜置换术术前1 h，使用第二代头孢菌素类抗菌药物头孢呋辛钠注射剂1.5 g预防感染，围手术期抗菌药物种类选择及给药时机合理。术后1天患者体温37.5 ℃，双肺呼吸音清晰，血白细胞计数18.76×109/L、中性粒细胞计数17.86×109/L、中性粒细胞95.2%，怀疑感染可能，取血、痰标本培养，继续予头孢呋辛钠注射剂1.5 g bid ivgtt。术后3天体温37.8 ℃，血白细胞计数22.65×109/L，中性粒细胞96.8%，考虑头孢呋辛钠已用3 d，白细胞计数、中性粒细胞等指标仍较高，协助医师调整治疗方案，换用头孢美唑钠注射剂1 g bid ivgtt联合盐酸莫西沙星氯化钠注射液0.4 g qd ivgtt，患者术后应用华法林抗凝，临床药师提醒医师盐酸莫西沙星可增强华法林的抗凝作用，需严密监控患者的PT/INR值，同时密切监测患者的感染相关症状及指标变化。术后5天患者体温36.6 ℃，痰培养、血培养结果无致病菌生长，血白细胞计数18.61×109/L、中性粒细胞85.7%，指标有所下降，继续原用药方案。术后6天体温36.6 ℃，血白细胞计数17.97×109/L、中性粒细胞80.4%。术后9天体温36.5 ℃，血白细胞计数9.17×109/L、中性粒细胞64.0%，指标正常。抗菌药物应用期间临床药师对药物不良反应进行监测，同时注意对华法林的抗凝作用的影响，并根据患者情况协助医师适时停用抗菌药物。患者术后13天（出院）无相关感染症状，血常规正常，期间未出现相关不良反应。
3. 围手术期气道管理与药学监护
心脏瓣膜置换术围手术期气道管理可减少并发症、缩短患者住院时间，布地奈德等糖皮质激素雾化吸入给药是常用药之一，与支气管舒张剂联用可协同增效，推荐术前3～7 d、术后3～7 d应用[9]。临床药师应对患者进行用药教育：吸气时手指按住出气口并紧闭口唇以使药液尽可能进入肺部，用力深吸气并屏气3～5 s以吸入完全；呼气时手指从出气口移开，并将喷气口移开口唇以减少痰液喷射到药液中，缓慢呼气。雾化吸入糖皮质激素可能导致患者出现口腔真菌感染、声音嘶哑，临床药师应教育患者注意用药后漱口以减少不良反应的发生。
4. 应激性溃疡预防与药学监护
应激性溃疡(SU)为机体在严重创伤，各种困难、复杂的手术，危重疾病等应激状态下发生的急性胃肠道黏膜溃疡病变，严重者可并发消化道出血、甚至穿孔，使病死率增加。机械通气超过48 h或接受体外生命支持、凝血机制障碍或使用抗凝或抗血小板药、原有消化道溃疡或出血病史、大剂量使用糖皮质激素或合并使用非甾体类抗炎药、急性肝肾功能衰竭等危险因素会增加SU发生及并发出血的风险[10]。心脏瓣膜置换术属于复杂手术，且涉及到接受体外生命支持、机械通气超过48 h、使用抗凝药等危险因素，因此心脏瓣膜置换术后患者应进行SU预防，制定合适的SU预防用药方案、及时判断消化道出血发生并选择有效治疗措施是临床药师关注的重点。SU预防方案建议将质子泵抑制剂(PPI)作为首选预防药物，在原发病发生后应用标准剂量，q12h，ivgtt，至少连续3 d[11]。临床药师应嘱患者留意是否有呕血、黑便等消化道出血症状发生，并监测血常规、大便常规等，及时发现消化道出血等提示SU并发出血的情况，以采取及时有效的措施治疗，同时协助医师权衡患者出血及不良事件风险，把握停药指征，避免过度使用SU预防药物。
病例4：患者，男，53岁，因二尖瓣关闭不全入院行二尖瓣置换术+三尖瓣成形术。术后返回监护病房，予注射用泮托拉唑钠40 mg bid ivgtt预防SU。临床药师叮嘱护士注意泮托拉唑钠溶解和稀释后应在4 h内用完，滴注时要求15～60 min内滴完。术后3 d，患者一般情况可，转入普通病房，临床医师继续予注射用泮托拉唑钠40 mg bid ivgtt。根据相关文献及指南，当患者病情好转或转入普通病房，可耐受肠内营养或已进食，应将SU预防药物静脉给药换为口服给药，并逐渐停药[10,12]。考虑到该患者病情平稳，已转至普通病房，能正常进食，经前期监护患者未出现提示SU并发出血的情况，临床药师建议医师将PPI由静脉用药调整为口服用药，医师接受，更改医嘱：停用泮托拉唑钠注射剂，予雷贝拉唑钠肠溶片20 mg qd po，继续监测出血相关症状及指标，至患者出院情况稳定。
5. 出院患者华法林使用的用药教育
心脏瓣膜置换术后患者需长期服用华法林，华法林与多种药物、食物存在相互作用，其抗凝作用的个体差异也与患者的依从性相关[8]，临床药师对患者进行详尽的用药教育有助于提高患者华法林的正确使用及自我监测意识，可从以下几方面进行教育：①使患者了解术后长期服用华法林抗凝的重要性，强调每天需按时服用华法林，如忘记，当晚12:00之前想起可补吃，若第2天想起则不可再吃。②告知患者需定期监测PT和INR值使其保持在目标范围内，出院后第一周每3天检查一次，以后每周检查一次，结果连续3次在目标范围内可再延长至每2周一次，以此类推，最长不可超过3个月检查一次，若不在目标范围应咨询医师或药师进行剂量调整。③叮嘱患者日常留意是否出现牙龈易出血、皮肤瘀斑、黑便等出血症状及无缘由剧烈头痛、四肢麻木、肢端水肿等血栓症状，如出现上述症状应立即复查PT、INR，并向医师或药师咨询。④使患者知晓华法林与多种药物有相互作用，出现其他疾病需用药时应咨询医师或药师进行药物选择；叮嘱患者避免大量摄入菠菜、西芹、卷心菜、动物肝脏等富含维生素K的食物而影响华法林的抗凝效果。⑤使患者知晓外伤、感染、发热、呕吐、腹泻等异常的生理状态会影响华法林的治疗，若发生上述情况需及时就诊；如需行创伤性手术或检查（如拔牙、胃镜等）需告知医生正在服用华法林。
总之，心脏瓣膜置换术后患者需同时使用多种药物，且华法林等药物个体用药差异大、需根据监测指标调整剂量，临床药学服务十分必要。临床药师可从心脏瓣膜置换术患者PT、INR值监测及华法林的剂量调整，感染监测及抗菌药物的合理应用，围手术期气道管理，应激性溃疡预防与药学监护，出院患者华法林用药教育等方面入手，加强与医生、患者的沟通，对患者进行个体化的药学服务，以促进药物的合理使用，保障患者用药安全、有效。
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表 1 阳性对照品名称及浓度
组别 菌株 阳性对照品 溶液终浓度（μg/皿） 加入量（μl/皿） 浓度（μg/ml） －S9组 TA97 敌克松 50 100 500 TA98 敌克松 50 100 500 TA100 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA102 甲基磺酸甲酯 1 100 10 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 0.5 100 5 +S9组 TA97 2-氨基芴 10 100 100 TA98 2-氨基芴 10 100 100 TA100 2-氨基芴 10 100 100 TA102 1,8-二羟基蒽醌 50 100 500 TA1535 环磷酰胺 50 100 500 
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表 2 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，
${\rm{\bar x}}$ ±s)（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 36±5 40±4 21±3 21±2 131±26 93±17 177±21 185±25 25±3 14±2 500 36±5 39±8 17±4 20±3 114±22 90±23 195±8 207±7 23±1 19±1 50 39±10 35±5 21±7 21±3 115±21 97±8 196±33 179±18 19±8 16±4 5 41±6 40±3 21±5 22±4 114±15 87±19 195±21 193±8 19±2 14±1 0.5 37±6 39±3 20±3 19±3 128±15 91±12 201±14 205±14 20±6 16±4 空白对照组 40±7 36±5 17±2 19±4 99±17 89±9 213±30 197±34 21±7 19±4 溶剂对照组 40±6 34±1 22±5 26±2 95±8 89±9 193±8 199±29 23±3 14±1 阳性对照组 839±24 841±47 936±56 1 077±55 968±27 1 111±66 1 101±17 1 024±53 342±44 345±13
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表 3 WA对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿，
${\rm{\bar x}}$ ±s)（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 +S9 －S9 5 000 38±5 34±5 20±5 21±5 128±24 105±26 179±21 189±19 20±4 20±3 500 39±7 34±3 21±2 20±7 108±13 92±28 192±16 187±30 16±3 19±4 50 38±9 30±3 19±3 18±1 117±14 102±5 197±5 196±22 17±3 18±1 5 37±8 29±4 18±2 17±1 111±5 98±33 206±24 191±21 16±1 20±2 0.5 35±6 33±8 24±2 23±3 107±7 97±8 203±6 193±10 15±4 15±4 空白对照组 38±3 41±4 22±3 23±4 96±12 93±8 205±17 186±19 18±2 18±4 溶剂对照组 38±3 37±8 22±3 23±4 98±7 100±12 202±15 197±10 18±2 19±4 阳性对照组 881±18 876±35 900±11 1 077±111 964±113 996±8 1 024±37 1 011±8 392±8 392±22
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表 4 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(+S9)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 1 1 0 0 0 0 0 1 2 1 47.48 μg/ml 200 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶剂对照组 200 200 0 0 0 0 0 3 3 3 1.5 阳性对照组 100 9 0 0 1 3 3 0 0 14 14 注：阳性对照组：+S9、环磷酰胺（60 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；* P<0.05，与溶剂对照组比较。
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表 5 WA对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 阳性对照组 100 4 4 0 0 0 0 4 0 12 12* 注：阳性对照组：－S9、丝裂霉素C（0.5 mg/ml）；溶剂对照组：DMSO；*P<0.05，与溶剂对照组比较。
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表 6 WA对4 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果(－S9/4 h)
组别 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着丝粒 三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 23.74 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.48 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 94.96 μg/ml 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 溶剂对照组 200 阳性对照组 * P<0.05，与溶剂对照组比较。
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表 7 WA对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果
组别 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（ ${\rm{\bar x}}$ ±s）微核率（ ${\rm{\bar x}}$ ±s, ‰）100 mg/kg 雌 5 10 020 2.40±0.89 1.60±0.96 200 mg/kg 雌 5 10 010 1.63±0.40 1.80±1.31 400 mg/kg (24 h采样) 雌 5 10 016 1.95±0.40 2.10±1.20 400 mg/kg (48 h采样) 雌 5 10 009 1.58±0.44 2.80±1.81 溶媒对照组 雌 5 10 009 2.37±0.69 2.10±1.20 阳性对照组 雌 5 9 095 2.18±0.30 21.36±7.84* 100 mg/kg 雄 5 10 016 1.56±0.30 1.90±1.28 200 mg/kg 雄 5 10 009 1.52±0.28 1.60±0.70 400 mg/kg (24 h采样) 雄 5 10 006 1.40±0.73 2.40±2.01 400 mg/kg (48 h采样) 雄 5 8 802 1.43±0.63 1.29±1.26 溶媒对照组 雄 5 9 029 2.13±0.58 1.90±1.45 阳性对照组 雄 5 10 011 1.62±0.42 20.88±4.94* *P<0.05，与溶剂对照组比较。
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