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患者，女，44岁，因宫颈糜烂口服宫炎康颗粒（湖北纽兰药业有限公司，批准文号：Z20054677）18 g bid以及替硝唑胶囊（山东罗欣药业股份有限公司，批准文号：H10970233）0.5 g bid。服用7 d后出现小便颜色发黄，伴有间断乏力，停用上述两种药物，但未给予足够重视。患者停药7 d后出现皮肤及巩膜黄染，就诊于当地医院，急查肝功能：总胆红素（TBIL）135.1 μmol/L，直接胆红素（DBIL）77.4 μmol/L，谷丙转氨酶（ALT）1566 U/L，谷草转氨酶（AST）1327 U/L，碱性磷酸酶（ALP）151 U/L，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）130 U/L。
患者在停药11 d后就诊于本院，入院后查肝功能：TBIL 107.6 μmol/L，DBIL 87.7 μmol/L，ALT 938 U/L，AST 478 U/L，ALP 203 U/L，γ-GT 137 U/L；病毒性肝炎抗体以及自身免疫抗体均为阴性，既往一般健康状况良好。入院后静脉给予复方甘草酸苷注射液200 mg qd、注射用还原型谷胱甘肽2 g qd、注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸2 000 mg qd和前列地尔注射液20 μg qd，同时口服熊去氧胆酸软胶囊200 mg tid进行保肝利胆治疗。治疗4 d后复查肝功能：TBIL 93.6 μmol/L，DBIL 77.3 μmol/L，ALT 408 U/L，AST 279 U/L，ALP 189 U/L，γ-GT 109 U/L，皮肤及巩膜黄染减退。继续原治疗方案7 d后，再次复查肝功能：TBIL 47.1 μmol/L，DBIL 38.2 μmol/L，ALT 316 U/L，AST 315 U/L，ALP 163 U/L，γ-GT 81 U/L，皮肤及巩膜黄染消失，肝功能显著好转出院，出院后继续口服药物复方甘草酸苷片75 mg tid以及熊去氧胆酸软胶囊200 mg tid治疗。患者出院2周后再次复查肝功能，胆红素和转氨酶等指标均恢复正常。
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患者为中年女性，无吸烟饮酒以及食物、药物过敏史，既往无肝脏疾病史；本次因宫颈糜烂口服宫炎康颗粒和替硝唑胶囊1周，因出现尿黄伴乏力停用药物，继而出现皮肤及巩膜黄染，同时肝脏转氨酶显著升高；经过11 d的入院治疗以及两周的出院口服保肝利胆药物治疗，肝功能恢复正常。根据最新的药物性肝损伤诊治指南[1]进行临床分型、因果关系评估（采用RUCAM评分法）以及严重程度分级，同时排除了其他原因如病毒性、酒精性或自身免疫性肝病，并结合用药史、疾病进程以及实验室指标，该患者诊断为药物性肝损伤，肝细胞损伤型，急性，RUCAM 7分（很可能），严重程度3级。
宫炎康颗粒为一种中成药，具有活血化瘀、解毒消肿的功效，用于慢性盆腔炎，其组方成分包括当归、赤芍、北败酱、香附(醋制)、炮姜、泽兰、川芎、红花、柴胡、车前子(盐炙)、海藻、延胡索。药品说明书中其不良反应、禁忌以及注意事项等均为尚不明确，未提示可能存在肝功能损害。此外，有关宫炎康颗粒的不良反应报道较少，且尚无引起肝损害的报道，仅有一例致面部针刺样疼痛的病例报告[2]。
大多数中成药的组方较为复杂，其引起不良反应包括肝损伤的机制很难阐明。宫炎康颗粒组方包含十二味中药，含有的化学成份尚不十分清楚，其中的柴胡和延胡索中药单方有引起肝损害的病例报道。延胡索中含有的延胡索乙素具有与有肝毒性的吡咯里西啶生物碱类似的结构，可能引起肝损害[3-4]。柴胡中的皂苷以及挥发油是主要的毒性成分，且肝脏是主要毒性靶器官[5]。因此，宫炎康颗粒中柴胡和延胡索可能在该患者的肝损害中发挥重要作用。
替硝唑作为新一代硝基咪唑类药物，常用于抗厌氧菌以及原虫。替硝唑在药品说明书以及现有报道中的不良反应一般是轻微和自限性的，主要包括恶心、呕吐、腹痛、便秘、厌食以及口腔金属味等胃肠道反应，皮疹、瘙痒、头痛和眩晕等不适，以及白细胞或中性粒细胞减少、双硫仑反应或黑尿等。替硝唑可能引起的严重不良反应主要包括过敏性休克或过敏性哮喘、癫痫或精神障碍、肾损害或肾衰竭等[6-7]。目前，有关替硝唑引起肝损害的报道较少，只有较早的1例牙周炎患者口服替硝唑胶囊后出现严重药物性肝损害[8]。本病例患者在发病前后未服用其他药物，因此推测宫炎康颗粒和替硝唑胶囊可能是引起急性药物性肝损害的原因。
药物性肝损害的发病机制复杂，至今尚未完全阐明，而中（成）药制剂以及抗感染药物是国内报道的最主要病因[1]。目前，药物性肝损害机制研究的热点是特异质性肝毒性，即与机体的基因多态性和表观遗传学差异具有重要相关性，而与药物的剂量不呈依赖性[1]。
宫炎康颗粒联合抗生素是目前常用的治疗慢性盆腔炎方法之一，尤其是宫炎康颗粒联用甲硝唑或替硝唑，两种药物均为常规剂量，疗程一般为2周时间，能够明显改善患者症状，降低不良反应风险以及疾病复发率[9-11]。针对细菌性阴道病以及滴虫性阴道炎，替硝唑与第一代硝基咪唑类药物甲硝唑相比，具有更好的疗效和安全性[12-13]。本病例患者的宫炎康颗粒和替硝唑胶囊均按照说明书常规剂量服用，未出现剂量过高或超说明书用药的情况，而且用药时间未超过常规的2周疗程，因此推测药物性肝损伤是由特异质性肝毒性引起。
目前，中成药联合抗菌药物广泛应用于多种疾病的治疗中，具有较好的应用前景。本病例首次报道了中成药宫炎康颗粒联用抗菌药物替硝唑胶囊后出现急性药物性肝损害，提示临床医生、临床药师以及患者，在联合治疗时应密切关注用药前后变化，定期监测肝功能指标，尤其是肝功能不全患者更应该慎重，以减少药物性肝损害的发生，提高用药安全性。
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近年来，随着肿瘤、器官移植和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等导致的免疫功能低下人群的增加，侵袭性真菌感染（IFIs）的发病率和病死率逐年上升[1-2]。念珠菌、隐球菌和曲霉菌是IFIs最主要的致病菌，并且造成的病死率超过90%[3]。在念珠菌属中，白念珠菌（Candida. albicans）是院内血液感染最常见的致病菌原体，其在重症监护病房（ICU）患者中致病率超过17%，病死率高达40%[4-5]。临床上治疗IFIs的抗真菌药物主要包括：多烯类（两性霉素B）、核酸类（5-氟胞嘧啶）、唑类（氟康唑）和棘白菌素类（卡泊芬净）药物（图1）[6-7]。然而，由于临床上出现抗真菌药物严重的耐药性和毒副作用，IFIs的治疗效果相当有限。因此，迫切需要研发全新机制的抗真菌药物。
组蛋白乙酰化修饰（包括组蛋白乙酰化和去乙酰化）是表观遗传学研究的重要组成部分。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）将组蛋白和其他蛋白上的赖氨酸末端乙酰基去除，对染色体重塑和基因的表达起着重要作用[8-9]。目前HDAC抑制剂主要集中于抗肿瘤研究方向，且已有多个上市药物应用于肿瘤的治疗。据研究报道，真菌中的HDACs，如烟曲霉[10]、白念珠菌[11-12]、酿酒酵母[13]和新生隐球菌的HDACs[14-15]参与了毒力相关的过程和形态变化。因此，抑制真菌HDACs可能是治疗IFIs的有效策略。
联合药物治疗是提高临床一线药物疗效并克服真菌耐药性的有效策略之一。真菌的耐药性涉及转录调节，其中染色体重塑和组蛋白修饰起主要作用。HDACs调节的组蛋白修饰在应激信号通路中起着至关重要的作用，这可能与真菌对各种环境（包括药物）的应激反应有关[16]。此外，已有研究报道，HDAC抑制剂与唑类药物联用具有协同增效作用[17-18]。例如，HDAC抑制剂MGCD290与氟康唑联用具有协同抗多种临床真菌分离株的作用[19]。
基于此，本研究首先对8个市售的HDAC抑制剂（图2）进行体外协同抗真菌活性测试，筛选结果显示化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有优秀的体外协同抗耐药白念珠菌活性。后续考察其与不同唑类药物联用时对不同念珠菌属的体外协同抗真菌活性，以及对正常细胞的毒性作用，以期为抗真菌药物的研发提供依据。
1. 材料和方法
1.1 实验试剂与菌株
临床分离的6株唑类耐药白念珠菌（编号：9893，10061，10060，9173，4108和0304103），2株唑类耐药热带念珠菌（编号：5008，10086），1株光滑念珠菌（编号：9073）和1株耳道念珠菌（编号：0029）由海军军医大学附属长征医院提供。菌株活化首先从−80 ℃中挑取菌株冻存液至YEPD液体培养基活化24 h,然后取10 μl菌悬液至1 ml YEPD中，并在30 ℃、200 r/min下培养16 h后待用。HUVEC细胞来源于中国科学院上海细胞库，并在新鲜配置的DMEM完全培养基中培养。
YEPD液体培养基：取10 g酵母浸膏、20 g葡萄糖、20 g蛋白胨溶解于1 000 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，保存于4 ℃条件下备用。RPMI 1640培养基：取10 g RPMI 1640（Gibco）粉末、34.5 g吗啡啉丙磺酸、2 g NaHCO3、2.7 g NaOH溶解于1 000 ml三蒸水中，经0.22 μm的微孔滤膜过滤与灭菌后，置于4 ℃条件下保存和备用。DMEM完全培养基：按照89% DMEM基础培养基+10%胎牛血清+1%的双抗比例混匀制得，混匀后置于4 ℃条件下保存和备用。PBS缓冲液：10 × PBS 100 ml溶解于900 ml三蒸水中，经高压蒸汽灭菌（121 ℃, 15 min）后，置于4 ℃条件下保存和备用。
1.2 仪器
THZ-92A气浴恒温振荡器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、MJ-150-I霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、LW100T生物显微镜（北京测维光电技术有限公司）、HDC-15K高速离心机（上海泰坦科技股份有限公司）、C170二氧化碳培养箱（BINDER GmbH）、infinite M200多功能酶标仪（Tecan Austria GmbH）、高压蒸汽灭菌锅、无菌洁净工作台。
1.3 棋盘式微量液基稀释法
本实验参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）公布的M27-A3方案中微量液基稀释法进行。首先，收集活化好的真菌细胞，PBS洗3次后用RPMI 1640培养基制成浓度为1×103 CFU/ml的菌悬液。按照每孔100 μl接种菌悬液至无菌96孔板中，1～9列加入倍半稀释的HDAC抑制剂，A～F行加入倍半稀释的氟康唑，其中G行只加氟康唑，第10列只加化合物，第11列为不加药的阴性对照组，后将96孔板置于35 °C条件下孵育48 h。测定每孔在630 nm处的吸光度A，依据公式：抑制率（%）=（A阳性对照孔−A化合物孔）/（A阳性对照孔−A阴性对照孔）× 100%，计算各孔对应的抑制率。如果某一孔和其左边孔对应的抑制率均大于80%，则该孔对应的化合物和FLC浓度分别作为FIC化合物和FIC氟康唑，利用协同指数公式：FICI =（FIC化合物./MIC80 化合物）+（FIC氟康唑/MIC80 氟康唑），计算各化合物对应的FICI。
1.4 时间-生长曲线实验
收集活化好的白念珠菌0304103稀释在RPMI 1640培养液中，保持菌浓度为1×105 CFU/ml。取5 ml稀释的菌悬液和不同浓度的待测药物加入50 ml的离心管中, DMSO组作为空白对照组和32 μg/ml FLC作为阳性对照。随后将50 ml的离心管置于30 °C条件下振荡培养（200 r/min），在多个时间点吸取不同药物组的真菌混悬液（100 μl）于96孔板上，测量A630值并使用GraphPad Prism 7作图。
1.5 真菌细胞总HDAC酶活性测试实验
收集指数生长期的白念珠菌0304103细胞（湿重为100 mg），然后用3 mg snailase、12 μl 2-巯基乙醇和3 ml snailase反应缓冲液等新鲜配置的真菌裂解液来处理它们，以制备真菌原生质体。真菌原生质体分散在PBS（20 ml）中以获得混悬液，然后往96孔板每孔中加入100 μl的混悬液和不同浓度的化合物Rocilinostat，并在35 °C下培育12 h。接着往每个孔中加入30 μmol/L的HDAC底物，于37°C下孵育6 h。随后添加100 μl HDAC酶促终止溶液并在37°C下孵育2 h。最后，在每个孔中取出100 μl培养物添加到黑板中，用Ex=360 nm，Em=460 nm来监测荧光强度并记录下来用于计算HDAC酶的抑制率。
2. 结果
2.1 化合物Rocilinostat与氟康唑联用具有协同抗真菌活性
表1列出了HDAC抑制剂单独使用或与氟康唑联合使用的体外抗真菌活性筛选结果。MIC80为抑制80%真菌细胞生长的最低药物浓度。实验结果表明，8个HDAC抑制剂单独使用对耐药白念珠菌均无直接的抗真菌活性（MIC80>64 μg/ml）；而化合物Rocilinostat（FICI=0.039）和伏立诺他（FICI=0.125）与FLC联用时均表现出良好的协同抗真菌活性。其中，化合物Rocilinostat的协同活性最佳，值得进一步研究。
表 1 单用HDAC抑制剂或者与氟康唑联用对白念珠菌0304103的体外抗真菌活性(μg/ml)抑制剂 抑制剂 氟康唑 FICI 单用 联用 单用 联用 伏立诺他 >64 4 >64 4 0.125 Rocilinostat >64 2 >64 0.5 0.039 T3516 >64 64 >64 64 2 T6016 >64 64 >64 64 2 T6421 >64 32 >64 32 1 T2157 >64 32 >64 32 1 T1726 >64 64 >64 64 2 T3358 >64 32 >64 64 1.5 注: FICI值≤ 0.5表示协同，FICI值> 4表示拮抗；0.5<FICI<4表示不相关。 2.2 Rocilinostat与氟康唑或伏立康唑联用对多种白念珠菌的抗真菌活性
为进一步考察Rocilinostat是否具广谱的抗真菌作用，挑选9株临床分离的念珠菌属菌株进行协同抗真菌活性测试。如表2所示，Rocilinostat与FLC联合使用时，对两株耐FLC的白念珠菌（C. albicans 9173，FICI=0.094; C. albicans 4108, FICI=0.5）和对FLC敏感的光滑念珠菌（C. glabrata 9073）表现出协同增效作用，而对热带念珠菌（C. tropicis）和耳道念珠菌（C. auris）没有协同抗真菌活性。当Rocilinostat与伏立康唑（VRC）联用时，对耐VRC的白念珠菌（C. albicans 10060, FICI=0.033）表现出优异的协同抗真菌活性 (表3)。
表 2 Rocilinostat与氟康唑单用或联用对多种念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 氟康唑 Rocilinostat 氟康唑 9893 >64 >64 64 64 2 10061 >64 >64 64 64 2 10060 >64 >64 64 64 2 9173 >64 >64 4 2 0.094 4108 >64 >64 32 32 0.5 10186 >64 >64 64 64 2 5008 >64 >64 64 8 1.125 9073 32 4 32 8 0.375 0029 64 32 >64 32 1 表 3 Rocilinostat与伏立康唑单用或联用对白念珠菌菌株的体外抗真菌活性[MIC80 (μg/ml)]菌株 单用 联用 FICI Rocilinostat 伏立康唑 Rocilinostat 伏立康唑 0304103 >64 >64 32 2 0.531 10061 >64 >64 32 0.125 0.502 10060 >64 >64 2 0.125 0.033 2.3 Rocilinostat与氟康唑联用有效抑制真菌的生长
为进一步考察化合物Rocilinostat的协同抗真菌活性，我们又开展了时间-生长曲线实验。从图3结果可以看出，高浓度的氟康唑或Rocilinostat单独使用对真菌生长无抑制作用，而Rocilinostat与不同浓度的氟康唑联用能够有效抑制真菌的生长，且呈浓度依赖趋势 (图3中抑制剂为Rocilinostat)。
2.4 Rocilinostat对真菌细胞的选择性作用
采用HUVEC（人脐静脉内皮细胞）对化合物Rocilinostat进行细胞毒性的评价。结果如表4显示，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，IC50值为52.17 μmol/L (22.60 μg/ml)，相当于其发挥协同抗耐药真菌（C. albicans 0304103）活性MIC80值的44倍，表明Rocilinostat对真菌细胞具有较强的选择性作用。此外，我们还测试了化合物Rocilinostat对真菌总HDAC酶的抑制活性，结果表明，Rocilinostat对真菌HDAC酶抑制活性（IC50=0.41 μmol/L）优于泛HDAC抑制剂伏立诺他（IC50=1.03 μmol/L）。
表 4 Rocilinostat对正常细胞的毒性和真菌总HDAC酶活性IC50 (μmol/L)化合物 HUVEC 白念珠菌（总HDAC酶） Rocilinostat 52.17 0.41 伏立诺他 — 1.03 注: “—”表示没有测试。 3. 讨论
本研究从市售的8个HDAC抑制剂中筛选出协同活性最佳的化合物Rocilinostat。进一步研究发现Rocilinostat与氟康唑联用对白念珠菌和光滑念珠菌具有协同增效作用。此外，化合物Rocilinostat与伏立康唑联用对临床分离的耐药白念珠菌株同样具有优秀的抗真菌活性。更值得关注的是，化合物Rocilinostat对正常细胞表现出低毒性，其对真菌细胞具有很好的选择性。因此，HDAC抑制剂Rocilinostat可以作为一种低毒、有效的唑类抗真菌药物增效剂，为抗真菌药物的发展提供了新的研究基础。
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