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根据世界卫生组织最新统计显示，心脑血管疾病如心肌梗死、缺血性卒中等是目前全球最主要的致死原因[1]。血小板作为动脉血栓形成的一项重要介质，其高反应性是导致动脉血栓事件发病率和病死率增加的重要危险因素[2, 3]。尽管现有的抗血栓药物可有效减少心血管疾病患者的动脉血栓形成，但出血的不良反应也极大限制了它们的使用。因此为了开发出能在抗血栓形成效果和出血之间取得更好平衡的新一代安全有效的抗血栓药物，迫切需要了解导致血管血栓闭塞的致病机制，开展新靶标的基础研究[4, 5]。
分泌蛋白可由机体各种组织器官分泌，在生理、病理过程中起关键作用，具备良好的研究前景，有望开发成为心脑血管疾病防治的药物、靶标、生物标志物[6, 7]。近期有多项研究表明部分分泌蛋白大量存在于血液之中，可直接作用于血栓调控[8-10]。Metrnl是本实验室前期通过构建限食模型筛选获得的一种与神经营养因子Metrn同源的新型分泌蛋白[11]。迄今为止，多项研究结果表明Metrnl在免疫炎症及代谢性心脑血管疾病中发挥重要作用，例如调节胰岛素敏感性、维持肠道稳态、对抗动脉粥样硬化、促进血管新生等[12-17]。此外，临床研究显示，血液Metrnl水平与冠心病、心肌梗死、缺血性脑卒中等多种血栓性疾病存在相关性[18-20]。以上结果均提示Metrnl在心脑血管疾病病理过程中扮演重要角色，但是Metrnl在血栓形成特别是其对血小板的直接作用尚未可知。
前期，本实验室通过使用Metrnl全身性敲除小鼠，已在多种血栓模型下证明Metrnl缺乏会导致血栓形成能力增强，并且在进一步的血小板功能检测中，证实Metrnl缺乏会导致血小板活性增强[21]。然而，我们尚未证明究竟是循环Metrnl还是血小板Metrnl的缺乏在促进血栓形成中扮演主要角色，且血小板Metrnl是否可以直接调控血小板活性改变，从而在血小板高活性与动脉血栓形成事件发生率增加之间建立联系，目前尚不清楚。
因此，本研究使用Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，旨在构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠模型，作为深入研究血小板内源性Metrnl在动脉血栓中的作用及调控机制的工具，并对该敲除小鼠的构建成功与否展开验证工作。
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鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康为世纪生物科技有限公司，5×Evo M-MLV RT Master Mix（AG11706）、通用型RNA提取试剂盒（AG21022）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，小鼠Actin抗体（
66009 -1-IG）购自武汉三鹰技术有限公司，Anti-METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）购自上海碧云天生物技术有限公司，红细胞裂解液（BL503B）购自北京兰杰柯科技有限公司。实时荧光定量PCR仪（LightCycler96）来自Roche公司，PCR仪（TP600）来自Takara公司，化学发光分析系统（5200S）来自Tanon公司，动物全血计数仪（pocH-100iV）来自希森美康公司。
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Metrnlloxp/loxp小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄Pf4-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2） ℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA。之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列如表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） Metrnl loxp TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGC GGATGAGCGTTTGAGCACAGC Pf4-Cre CCAAGTCCTACTGTTTCTCACTC TGCACAGTCAGCAGGTT 内参基因 CAAATGTTGCTTGTCTGGTG GTCAGTCGAGTGCACAGTTT 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V×30 min，结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其腹腔，用1 ml注射器吸取约100 μl 2%枸橼酸钠溶液（枸橼酸钠0.2 g，蒸馏水定容至10 ml），自腹主动脉处缓慢抽取抗凝血液，并转移至15 ml离心管中。组织灌流后迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。骨髓提取分离小鼠股骨并剪去多余肌肉和纤维组织，剪掉股骨两端，在干净PBS中反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液室温离心
1000 r/min×5 min获得骨髓细胞，用1 ml Triozl溶液重悬混匀，储存至−80 ℃超低温冰箱。 -
向小鼠抗凝全血中加入等体积0.9%生理盐水，并加入Apyrase（终浓度2 U/ml），快速颠倒混匀后室温离心800 r/min×10 min；离心后收集最上层富血小板血浆（PRP），转移至新的15 ml离心管，室温离心
1700 r/min×5 min，弃去上清液，取适量台式液重悬。 -
小鼠心脏采抗凝血后，室温离心
1000 r/min×5 min,弃去上清液后加入5 ml的红细胞裂解液，室温作用10 min，室温离心1000 r/min×5 min，重复1次，在血细胞沉淀中加入5 ml PBS洗涤，室温离心1000 r/min×5 min，弃去上清后根据白细胞沉淀的量加入100～500 μl PBS重悬。红细胞提取在全血中加入等体积红细胞保存液（枸橼酸钠0.8 g，葡萄糖2.05 g，枸橼酸0.0325 g，氯化钠0.42 g，蒸馏水定容至100 ml）, 室温离心2 000 r/min×10 min，连续离心洗涤3次后，取压积红细胞加入100～500 μl红细胞保存液重悬。 -
使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，Triozl法提取骨髓RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列如表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） Mouse Metrnl CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT GGACAACAAAGTCACTGGTACAG Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：
12000 g×15 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5×蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V×60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V×60 min。
转膜结束后，使用快速封闭液封闭20 min，之后使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min×3次。加入一抗孵育液（1∶
1000 稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1×TBST缓冲液洗膜，10 min×3次。加入二抗孵育液（1∶1000 稀释）常温孵育1 h，用1×TBST缓冲液洗去二抗，10 min×2次，结束后即可进行扫膜。 -
实验数据使用GraphPad Prism 9.5进行统计分析。两组间的比较使用two-tailed Student’s t test检验，P<0.05视为结果存在统计学意义。
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本研究构建策略基于前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠和Cre-LoxP重组酶系统,所构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠（Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+）简称Plt-Metrnl-/-小鼠，具体构建策略如图1A所示。
图 1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠构建策略、培育流程及基因型鉴定
Metrnlloxp/loxp小鼠是前期构建而成，该小鼠Metrnl基因的3号外显子两侧和4号外显子编码区的都插有同向LoxP位点（即图1A中所示“等位基因”），可基于Cre-LoxP系统在Cre酶的作用下，将LoxP位点之间的序列切除（图1A）[12]。
Pf4-Cre小鼠是由Pf4基因启动子Cre重组酶在巨核细胞及血小板谱系表达的工具鼠，最初开发用于研究APC-Wnt调节途径在巨核细胞生成和血小板产生中的作用，其Cre重组酶的表达受巨核细胞特异性受体Pf4基因的启动子介导，在巨核细胞的成熟Ⅰ期（最早可识别形态期）中即开始发生转录激活，之后广泛表达于成熟的血小板[22, 23]。
将Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，巨核细胞特异性表达的Cre酶可将Metrnl同向LoxP位点之间的序列切除，以达到在巨核细胞及血小板谱系特异性敲除Metrnl基因的目的，具体构建繁殖流程如图1B所示，最终可以获得Plt-Metrnl-/-小鼠及其对照小鼠（WT）。
繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认Metrnlloxp基因和Pf4-Cre基因的表达情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，Metrnlloxp突变型基因阳性条带为243bp，对应野生型序列条带为131bp，Pf4-Cre基因阳性条带为420bp，内参基因阳性条带为200bp。对培育繁殖过程中的母代及子代小鼠均进行了基因型鉴定，如图1C、D、E中DNA电泳条带图所示：图1C中泳道1、2为母代Metrnlloxp/loxp小鼠，泳道3、4为母代Pf4-Cre小鼠；图1D中泳道1、2为Metrnlloxp/WT小鼠，泳道3、4为Metrnlloxp/WT/Pf4-Cre+小鼠；图1E泳道1、2、4为Plt-Metrnl-/-小鼠，泳道3、5、6为WT小鼠。
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为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否实现血小板特异性Metrnl基因敲除，分别提取Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血小板蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证敲除情况，结果如图2所示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板蛋白Metrnl表达较对照WT小鼠明显降低，提示Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl成功敲除。
图 2 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血小板Metrnl蛋白相对表达量（
$\bar x $ ±s, n=3） -
为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否存在其他组织非特异性敲除，本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中Metrnl mRNA的表达情况。如图3所示，以WT对照小鼠的心脏Metrnl mRNA表达量为1，Plt-Metrnl-/-小鼠在心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠、骨髓组织mRNA水平上并未存在显著差异。该结果说明，血小板特异性Metrnl基因敲除小鼠在组织mRNA水平上并未发生其他组织非特异性敲除。
图 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各组织的Metrnl mRNA相对表达量（
$\bar x $ ±s，n=5～6）然后，本研究提取血细胞及各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证Plt-Metrnl-/-小鼠各血细胞及组织中Metrnl蛋白表达情况。如图4所示，并未发现Metrnl蛋白在Plt-Metrnl-/-小鼠和对照WT小鼠各组织中存在显著差异，该结果提示，Plt-Metrnl-/-小鼠在其他血细胞蛋白水平及各组织蛋白水平上并未发生非特异性敲除。
图 4 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各血细胞及各组织的Metrnl蛋白表达情况（
$\bar x $ +s, n=3） -
分别对Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠外周血进行血常规指标检测，结果如表3所示，外周血血常规计数红细胞、白细胞、血小板数量未见明显改变，血小板大小及分布未见显著差异，提示血小板特异性敲除Metrnl后不影响外周血细胞数量，且对血小板形态没有明显影响。
表 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血常规指标对比（n=6）
血常规检验项目 WT Plt-Metrnl-/- 白细胞计数（109/L） 2.10±0.50 2.25±0.30 淋巴细胞计数（109/L） 1.28±0.20 1.52±0.20 淋巴细胞比率（%） 63±3 68±3 嗜酸性粒细胞计数（109/L） 0.10±0.05 0.05±0.02 嗜酸性粒细胞比率（%） 3.0±1.8 1.0±0.3 其他细胞计数（109/L） 0.72±0.20 0.68±0.10 其他细胞比率（%） 34.0±3.3 31±3 红细胞计数（1012/L） 8.49±0.40 7.83±0.40 血红蛋白（g/L） 122.0±5.5 113.0±4.6 红细胞压积（%） 42±2 37±2 平均红细胞体积（fL） 49.1±0.8 47.7±0.9 平均血红蛋白含量（pg） 14.30±0.08 14.5±0.1 平均血红蛋白浓度（g/L） 292±5 304.0±7.7 红细胞分布宽度-SD（fL） 27.6±0.4 26.2±0.6 红细胞分布宽度-CV（%） 13.2±0.4 12.4±0.3 血小板计数（109/L） 1121 ±581049 ±132血小板平均宽度（fL） 6.7±0.4 6.1±0.1 平均血小板体积（fL） 6.20±0.26 5.80±0.08 大型血小板比率（%） 1.9±1.0 3.5±0.3 -
Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和对照WT小鼠为首次繁殖培育的转基因动物，在生理状态下，血小板Metrnl缺失是否影响动物繁殖情况尚未见报道，因此，本研究统计记录了小鼠基因型分布情况。Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程如图5A所示，按照遗传学规律，Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交繁殖获得子代鼠中Plt-Metrnl-/-小鼠和WT小鼠的比例应为1∶1。如图5B、5C所示，对繁殖过程中所获得的16窝次共计130只目的鼠进行统计，Plt-Metrnl-/-小鼠共有67只，其中雄鼠31只，雌鼠36只；WT小鼠共有63只，其中雄鼠37只，雌鼠26只。结果表明繁殖鼠遗传规律基本符合预期，无明显差异，提示血小板特异性敲除Metrnl对小鼠胚胎发育和性别比例无明显影响。
图 5 Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠扩大繁殖流程和子代鼠一般繁殖情况
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Cre-LoxP重组酶系统主要用于构建条件性基因敲除小鼠模型，是当前阐释基因功能的最直接的方式之一。Pf4-Cre工具鼠长期以来应用于巨核谱系基因敲除动物的构建，虽然有研究表明Pf4-Cre表达不仅限于巨核细胞/血小板谱系，也表达于其他骨髓造血干细胞以及远端肠道的上皮细胞中，但是该小鼠目前仍是巨核细胞谱系遗传修饰的最佳工具，且不影响血小板和血栓形成功能的考察[22-24]。因此本研究利用Pf4-Cre工具鼠和实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠进行杂交繁殖，最终获得血小板特异性Metrnl敲除小鼠，即Plt-Metrnl-/-小鼠。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平、外周血常规水平考察了Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl敲除的情况。本研究结果显示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl蛋白表达较对照WT小鼠减低约50%，可能是由于本实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠插入的loxp序列位点在3、4号外显子，因此Pf4-Cre仅介导3、4号外显子间的同向基因序列切除，并未实现Metrnl基因全长敲除。另外，血小板是骨髓巨核细胞分化形成的“细胞碎片”，由于无法获得原代骨髓巨核细胞，本研究并未对骨髓巨核细胞的Metrnl敲除情况进行验证，未证实Metrnl敲除是否会对骨髓巨核细胞的生成和形态产生影响，仅从血常规计数中初步得知血小板的生成未受到明显影响。Metrnl与骨髓巨核细胞之间的关系也可作为下一步的研究方向。
在小鼠培育的过程中，尚未发现Plt-Metrnl-/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面的差异。基于孟德尔遗传定律，Plt-Metrnl-/-小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交进行扩大繁殖和保种的得率也接近50%，说明血小板Metrnl缺失不影响小鼠繁殖情况。
前期本课题组已证实Metrnl全身敲除小鼠血栓形成能力增强，血小板活性明显增强，构建Plt-Metrnl-/-小鼠可考虑用于血小板内源性Metrnl与血小板功能相关性的研究，并且该小鼠可与Metrnl全身敲除小鼠进行血栓形成能力比较，比较全身Metrnl和局部血小板Metrnl的作用，深入研究其作用方式及机制，为血栓性疾病的防治提供新靶点。
Construction and validation of a platelet-specific Metrnl gene knockout mouse model
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摘要:
目的 构建血小板特异性Metrnl基因敲除的小鼠（Plt-Metrnl-/-小鼠）模型。 方法 基于Cre-LoxP系统利用Pf4-Cre小鼠与实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠进行交配繁殖，得到目的Plt-Metrnl-/-小鼠。对该目的小鼠进行基因型鉴定，收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠、骨髓组织，利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验，考察血小板特异性Metrnl敲除小鼠的敲除情况。 结果 Plt-Metrnl-/-小鼠的血小板Metrnl蛋白水平显著低于对照组WT小鼠，其他外周血细胞及各组织mRNA水平、蛋白水平、血常规指标、生长发育一般情况与对照组WT小鼠无明显差异。 结论 血小板特异性Metrnl敲除小鼠（Plt-Metrnl-/-小鼠）模型构建成功。 Abstract:Objective To construct the platelet-specific Metrnl gene knockout （Plt-Metrnl-/-）mice model. Methods Based on the Cre-LoxP system, Metrnlloxp/loxp mice, previously constructed in our laboratory, were mated with Pf4-Cre mice to generate Plt-Metrnl-/- mice. The genotypes of the offspring were identified, and tissues of the platelet, other peripheral blood cells, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, colon, and bone marrow were collected. The expression of the Metrnl gene in Plt-Metrnl-/- mice was investigated by quantitative real-time PCR and western blot. Also, the blood routine index was tested in Plt-Metrnl-/- mice. Results Compared with wild-type mice, the level of Metrnl protein in platelets was significantly decreased in Plt-Metrnl-/- mice. There was no significant difference in mRNA and protein levels of other peripheral blood cells and tissues, as well as in blood routine index, growth, and development between Plt-Metrnl-/- mice and WT mice. Conclusion Platelet-specific Metrnl knockout mice（Plt-Metrnl-/- mice）model was successfully constructed. -
Key words:
- Metrnl /
- gene-knockout mouse /
- platelet
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阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆功能和神经行为障碍为表现的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有AD患者
5000 余万人，随着人口老龄化的进展，这一数字还将持续增加，给全球发展带来巨大的健康和经济负担[1] 。到目前为止，临床尚缺乏有效的AD治疗手段。胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂等传统AD治疗药物效果有限，FDA新批准上市的Aβ单克隆抗体仑卡奈单抗等疗效尚存争议，且治疗费用昂贵[2] 。因此，开发经济、有效的AD治疗药物仍是当前研究热点。中药因其多靶点系统作用和低毒副作用的优势，近年来在AD等复杂疾病治疗药物发掘中发挥重要作用[3] 。中药葛根和知母临床应用历史悠久，葛根解肌退热、生津止渴，知母清热泻火、滋阴润燥，二者配伍可清热生津、滋阴润燥，改善代谢紊乱，对热邪灼津、痰浊阻窍所致的健忘呆钝、消渴等症具有治疗作用，主要代表方剂为玉液汤[4-6] 。近年来研究发现该药对的一些成分如葛根素[7] 、芒果苷[8] 、知母皂苷BⅡ[9] 等对AD具有药效作用。作为一种复杂的异质性疾病，AD的发生与糖尿病存在紧密的因果关联，也被称为脑型糖尿病（3型糖尿病）[10] 。但是目前鲜见葛根与知母配伍后在AD治疗中作用效果的报道。因此，本研究拟通过建立AD大鼠模型考察葛根和知母配伍防治AD的效果，同时运用代谢组学策略探究葛根与知母作为药对配伍后防治AD潜在的作用机制，为中药防治AD研究提供参考借鉴。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent
1290 Infinity液相色谱仪和6538 UHD Accurate-Mass 四级杆飞行时间串联高分辨质谱仪（美国安捷伦公司）；HERAEUS FRESCO 17高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；ANALOG 涡旋振荡器（美国奥豪斯公司）；Milli-Q Integral超纯水机（美国Millipore公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）；Digbehav动物行为学分析系统-水迷宫（上海吉量软件科技有限公司）。1.2 药物与试剂
葛根（批号：A220901）与知母药材饮片（批号：
20220201 ）购自上海市白鹿堂中药店，经海军军医大学药学系蒋益萍副教授鉴定为豆科植物野葛P. lobate（Willd.）Ohwi的干燥根和百合科植物知母A. asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙醇（分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司）； 乙腈、甲酸（均为LC-MS级，赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，北京迪马科技有限公司）；乌拉坦（批号：P2091859）、D-gal（批号：P1616089）和AlCl3（批号：P2391168）购自上海泰坦科技股份有限公司；生理氯化钠溶液（四川科伦药业股份有限公司）；L-2-氯苯丙氨酸（98%，上海麦克林生化有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）试剂盒购自上海源桔生物科技中心。1.3 实验动物
健康雄性清洁级SD大鼠，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。大鼠饲养于海军军医大学药学系实验动物中心，笼饲条件为：温度恒定为（22±2）℃，湿度区间为40%～60%，昼夜循环时间为12 h。
2. 实验方法
2.1 中药提取液制备
分别取葛根、知母和葛根-知母药对（15∶12）粉末适量，以10倍体积70%乙醇浸泡，在85 ℃下加热回流提取90 min，滤过，滤渣以同等条件重复提取2次。合并3次滤液，60 ℃减压浓缩至无乙醇味，制备得到用于灌胃的提取液，密封保存于−20 ℃待用。
2.2 AD模型建立与药效评价
2.2.1 分组与给药
40只SD大鼠适应性喂养1周后按照体重随机分为空白对照组、AD模型组、葛根组、知母组和葛根-知母药对组共5组（n=8）。除对照组外，其余4组大鼠每日给予D-gal 300 mg/kg腹腔注射和AlCl3 200 mg/kg灌胃，连续给药21周建立AD动物模型。对照组每日给予等量的生理盐水（灌胃+腹腔注射）。自第14周起，3个中药干预组分别给予葛根、知母和葛根-知母药对提取液灌胃（相当于生药量：葛根6.25 g/（kg·d），知母5 g/（kg·d），药对11.25 g/（kg·d）。对照组和模型组大鼠灌胃等量纯水。
2.2.2 Morris 水迷宫实验
采用Morris水迷宫行为学实验评价大鼠的学习和记忆能力。水迷宫实验全程共6 d，其中包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索试验。利用动物行为学分析系统记录大鼠在定位航行训练期间每日的逃避潜伏时间和空间探索训练中的运动轨迹、穿越站台次数、各象限的运动距离和停留时间等参数，供分析评价使用。
2.2.3 样本获取与前处理
行为学实验结束后，大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉，经腹主动脉取血，静置后，在4 ℃、
4 000 r/min转速下离心10 min，取上清液分装冻存于−80 ℃，供后续分析用。2.2.4 血清MDA、SOD和NO检测
使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤检测大鼠血清中的SOD、MDA、NO等氧化应激和脂质过氧化相关指标。
2.3 代谢组学实验
2.3.1 含内标的甲醇溶液配制
精密称取L-2-氯苯丙氨酸适量，加入甲醇溶解得浓度为5 mg/ml的内标母液，随后用甲醇稀释得到浓度为2 μg/ml的内标溶液。
2.3.2 分析样本制备
各取200 μl解冻后的血清样本置于1.5 ml的离心管中，加入600 μl预冷的含内标的甲醇溶液，涡旋2 min后，在4 ℃、
12 500 r/min转速下离心15 min，取上清液供UPLC-Q/TOF-MS分析用。取各样本20 μl，混合得到质控（QC）样本。2.3.3 色谱与质谱条件
色谱条件：反相色谱柱为Waters X Select HSS T3柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），亲水作用色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；进样量：2 μl；柱温：40 ℃；流动相为0.1%甲酸-水（A ）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B）；T3柱梯度洗脱模式：0~2 min，2%B；2~17 min，2%~98% B；17~19 min，98%B。HILIC柱梯度洗脱模式：0~2 min，95%B；2~4 min，95%~89% B；4~10 min， 89% B；10~12 min， 89%~66% B；12~15 min， 66% B。流速：0.4 ml/min；色谱柱平衡时间：5 min。
质谱条件：采用 ESI 离子源，正、负离子检测模式；干燥气温度，350 ℃，干燥气体流量：11 L/min；毛细管电压：正离子模式为
4 000 V，负离子模式为3 500 V；碎裂电压：120 V；质谱扫描范围：50～1 500 m/z。2.3.4 数据预处理与分析
质谱数据用XCMS程序包进行预处理，按80%原则过滤无效数据并进行内标归一化处理。使用SIMCA 14.1（Umetrics公司，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交矫正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）并进行模型验证，结合R2X、R2Y和Q2判断模型的拟合效果和预测效果。以变量权重值（VIP）>1、P<0.05且差异倍数（fold change，FC）>1.2或<0.8作为筛选标准，获得AD疾病关联生物标志物。借助HMDB数据库（https://hmdb.ca/）等在线代谢物质谱数据库对筛选得到的差异代谢物进行比对和注释。借助MetaboAnalyst 6.0（https://www.metaboanalyst.ca/）网站进行代谢通路分析。
2.4 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM公司，美国）和GraphPad Prism 8（Graphpad软件公司，美国）进行统计分析与绘图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为组间差异具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1 AD大鼠模型建立与药效评价
3.1.1 学习和记忆能力评价
以水迷宫实验中大鼠逃避潜伏期、穿越站台所在位置次数以及站台所在象限的停留时间作为评价指标，考察大鼠的学习和记忆水平。结果如图1所示，定位航行训练期间，各组大鼠的逃避潜伏期随训练时间增加均呈下降趋势，其中模型组逃避潜伏期下降趋势较为平缓，对照组和3个中药干预组下降趋势均较模型组显著，对照组和葛根-知母药对组第5日逃避潜伏期较模型组均有极显著差异（P<0.01）。同样，空间探索实验中，模型组大鼠穿越站台次数以及站台所在象限的停留时间较对照组均显著减少，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。中药干预后各组大鼠穿越站台次数及目标象限停留时间均有所增加，其中，葛根-知母药对组与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。结果表明，造模后大鼠的学习和记忆能力出现下降，给予葛根、知母和葛根-知母药对干预均可不同程度改善大鼠的学习和记忆能力，以葛根-知母药对最为显著，效果优于单药。
图 1 不同组别大鼠水迷宫实验结果A.逃避潜伏期；B.目标象限停留时间百分比；C.各组大鼠水迷宫代表轨迹图；D.穿越站台次数 *P<0.05, **P<0.01, 与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001, 与对照组比较。3.1.2 血清生化指标测定
与对照组相比，模型组大鼠血清NO水平相对升高，MDA水平显著升高（P<0.05），SOD含量极显著降低（P<0.01）。中药干预后，各给药组血清NO和MDA水平出现不同程度降低，其中葛根-知母药对组降低效果最为明显，与模型组间差异具有统计学意义（P<0.05）。葛根、知母和葛根-知母药对给药组血清SOD含量较模型组均有所回调，组间差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图 2 不同组别大鼠血清SOD（A）、MDA（B）和NO（C）水平*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较； #P<0.05, ##P<0.01，与对照组比较。3.2 血清代谢组学
3.2.1 血清代谢轮廓和多元统计分析
血清样本经UHPLC-Q/TOF-MS分析后得到各组大鼠血清代谢图谱，不同色谱柱分析条件下各组大鼠血清代谢轮廓存在一定差异。多元统计分析结果表明（图3），在PLS-DA多组分析模型中，空白对照组、AD模型组和3个中药干预组组间区分度较好，组内差异相对较小。PLS-DA模型200次置换检验结果显示，Q2回归线与Y轴截距小于0，R2和Q2曲线斜率始终为正值，且Q2<R2，表明模型未出现过拟合，具有相对可靠的解释和预测能力。在OPLS-DA模型中，不同分析条件下，AD模型组与空白对照组间完全分离，表明模型组与对照组间具有显著组间差异，CV-ANOVA验证结果证实所建立的OPLS-DA模型未出现过拟合，具备解释和预测能力。
图 3 UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA与OPLS-DA得分图A-D. UHPLC-Q/TOF-MS正、负离子模式下T3柱和HILIC柱的PLS-DA得分图；E-H. 模型组与对照组间OPLS-DA得分图3.2.2 差异代谢物筛选与鉴定
对T3柱和HILIC柱正、负离子模式下的代谢物信息进行差异化分析，以VIP值>1、P<0.05和FC>1.2或FC<0.8作为筛选标准，对不同模式下空白对照组与AD模型组的差异代谢物进行筛选，并以火山图形式呈现（图4）。图中橙色标记点为显著上调代谢物，蓝色标记点为显著下调代谢物。
利用HMDB数据库对差异代谢物质谱信息进行匹配和鉴定，在AD模型组与对照组间鉴定出70个AD相关的潜在生物标志物，其中由HILIC柱鉴定得到31个代谢物，T3柱鉴定得到45个代谢物，T3和HILIC柱共同鉴定得到的代谢物6个，具体如表1所示。
表 1 差异代谢物鉴定、趋势和相关通路分析结果序号 代谢物 色谱柱 分子质量（m/z） 化学式 加合离子 趋势 相关通路 P 值 1 2-羟基丁酸 T3 127.0362 C4H8O3 M+Na ↑ 丙酸代谢 1.22E-03 2 肌酸 T3 132.0781 C4H9N3O2 M+H ↑# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 6.98E-03 3 脯氨酸 T3、HILIC 138.0553 C5H9NO2 M+Na ↓#* 精氨酸和脯氨酸代谢 4.20E-03 4 L-天冬氨酸 T3 133.0606 C4H8N2O3 M+H ↑# 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢2.36E-02 5 L-乙酰基肉碱 T3 204.1218 C9H17NO4 M+H ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.26E-03 6 棕榈酰肉碱 T3 400.3424 C23H45NO4 M+H ↑#* 脂肪酸降解 2.38E-04 7 喹啉酸 T3 168.0271 C7H5NO4 M+H ↑ 烟酸和烟酰胺代谢 4.97E-04 8 焦谷氨酸 T3 128.0329 C5H7NO3 M-H ↓# 谷胱甘肽代谢 2.89E-02 9 3b-羟基-5-胆酸 T3 357.2789 C24H38O3 M+H-H2O ↑ − 1.01E-02 10 香草酸 T3 151.0361 C8H8O4 M+H-H2O ↑ − 3.05E-03 11 肌酸酐 T3 136.0491 C4H7N3O M+Na ↑# − 1.89E-04 12 戊烯二酸 T3 153.0198 C5H6O4 M+Na ↑ − 8.96E-03 13 亚油酸 T3 303.2327 C18H32O2 M+Na ↑# 亚油酸代谢 2.45E-02 14 4-羟基丁酸 T3 103.0382 C4H8O3 M-H ↑# − 4.49E-03 15 糖原 T3 689.2111 C24H42O21 M+Na ↑ 淀粉和蔗糖代谢 2.24E-02 16 肉豆蔻酸 T3 211.2038 C14H28O2 M+H-H2O ↑# 脂肪酸生物合成 4.15E-02 17 丙酰肉碱 T3 218.1383 C10H19NO4 M+H ↓# 支链脂肪酸的氧化 1.97E-02 18 硬脂酰肉碱 T3 428.3734 C25H50NO4 M+H ↑#* 长链饱和脂肪酸的
线粒体β氧化2.84E-04 19 花生四烯酸 T3 327.232 C20H32O2 M+Na ↑#* 花生四烯酸代谢 1.53E-02 20 N1乙酰精胺 T3 267.208 C12H28N4O M+Na ↑# 赖氨酸降解 3.71E-02 21 N6, N6, N6-三甲基-L-赖氨酸 T3 189.16 C9H20N2O2 M+H ↑# α-亚麻酸代谢 4.44E-02 22 α-亚麻酸 T3 279.2316 C18H30O2 M+H ↑#* 初级胆汁酸生物合成 2.80E-02 23 24羟基胆固醇 T3 425.343 C27H46O2 M+Na ↑# 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 8.17E-04 24 2-氧代-4-甲硫基丁酸 T3 131.0189 C5H8O3S M+H-H2O ↑ 不饱和脂肪酸的生物合成 1.14E-02 25 二十碳五烯酸 T3 285.2212 C20H30O2 M+H-H2O ↑# − 2.45E-02 26 油酰乙醇酰胺 T3 348.2891 C20H39NO2 M+Na ↑# − 8.42E-03 27 吲哚-3-丙酸 T3 190.0858 C11H11NO2 M+H ↓# − 4.79E-04 28 棕榈油酸 T3 237.2193 C16H30O2 M+H-H2O ↑#* − 5.79E-03 29 15（S）-羟基二十碳三烯酸 T3 345.2341 C20H34O3 M+Na ↑# − 9.83E-03 30 十四酰肉碱 T3、HILIC 372.3103 C21H41NO4 M+H ↑# − 1.15E-02 31 3-羟基马尿酸 T3 178.0501 C9H9NO4 M+H-H2O ↓#* − 9.53E-03 32 18-羟基花生四烯酸 T3 343.225 C20H32O3 M+Na ↑# − 3.91E-02 33 亚麻酰基肉碱 T3 424.3414 C25H46NO4 M+H ↑# − 4.25E-04 34 LysoPC（15:0/0:0） T3 526.3057 C23H48NO7P M+FA-H ↓#* − 2.55E-02 35 PC（18:1（9Z）e/2:0） T3 550.3872 C28H56NO7P M+H ↑#* − 2.11E-03 36 7-酮胆固醇 T3 401.3455 C27H44O2 M+H ↑#* − 1.08E-04 37 9-十六碳烯酰肉碱 T3 398.3152 C23H43NO4 M+H ↑# − 9.43E-05 38 16（17）-EpDPE T3 343.2219 C22H32O3 M-H ↑#* − 3.33E-02 39 十八烯酰肉碱 T3 426.3578 C25H47NO4 M+H ↑# − 1.84E-04 40 肉豆蔻酰肉碱 T3 370.2951 C21H39NO4 M+H ↑ − 4.25E-03 41 DL-乙酰肉碱 T3 204.1227 C9H17NO4 M+H ↑ 嘧啶代谢 1.85E-03 42 胞苷一磷酸 HILIC 368.0407 C9H14N3O8P M+FA-H ↓# 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 2.74E-02 43 胆碱 HILIC 86.0963 C5H14NO M+H-H2O ↑ 初级胆汁酸生物合成 1.20E-02 44 甘胆酸 HILIC 466.33 C26H43NO6 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.43E-04 45 L-酪氨酸 HILIC 182.0812 C9H11NO3 M+H ↑#* 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 2.89E-03 46 苯丙氨酸 HILIC 166.0862 C9H11NO2 M+H ↑ 嘌呤代谢 1.68E-03 47 肌苷酸 HILIC 383.0262 C10H13N4O8P M+Cl ↓#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢9.85E-04 48 L-天门冬氨酸 HILIC 134.0433 C4H7NO4 M+H ↑ 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 5.14E-04 49 苯丙酮酸 HILIC 165.0546 C9H8O3 M+H ↑#* 嘧啶代谢 6.25E-03 50 乳清酸 HILIC、T3 179.0029 C5H4N2O4 M+Na ↓#* 鞘脂代谢 3.04E-02 51 鞘氨醇 HILIC 302.3059 C18H39NO2 M+H ↑# 酪氨酸代谢 6.59E-04 52 香草扁桃酸 HILIC 233.0192 C9H10O5 M+Cl ↑#* 酪氨酸代谢 6.72E-05 53 酪胺 HILIC 120.079 C8H11NO M+H-H2O ↑ − 2.50E-03 54 3-氧代-4, 6 -胆二烯酸 HILIC 393.2315 C24H34O3 M+Na ↑# 初级胆汁酸生物合成 1.46E-02 55 鹅去氧胆酸 HILIC 437.2877 C24H40O4 M+FA-H ↑#* 丙氨酸、天冬氨酸和
谷氨酸代谢7.30E-04 56 谷氨酰胺 HILIC 169.0584 C5H10N2O3 M+Na ↑# − 5.06E-04 57 亮氨酸 HILIC 133.0855 C6H12O3 M+H ↑ − 5.18E-03 58 高-L-精氨酸 HILIC 189.1292 C7H16N4O2 M+H ↑#* − 1.22E-02 59 马尿酸 HILIC、T3 178.0516 C9H9NO3 M-H ↓# − 2.94E-02 60 牛磺胆酸3-硫酸盐 HILIC 596.2653 C26H45NO10S2 M+H ↑ − 1.78E-05 61 鹅去氧胆酸3-硫酸盐 HILIC 455.2515 C24H40O7S M+H-H2O ↑ 半胱氨酸和蛋氨酸代谢 2.76E-03 62 硫代半胱氨酸 HILIC 187.9645 C3H7NO2S2 M+Cl ↓# 亚油酸代谢 8.23E-05 63 13-L-过氧化氢亚油酸 HILIC 311.2187 C18H32O4 M-H ↓# − 4.63E-03 64 S-亚硝基谷胱甘肽 HILIC 381.0763 C10H16N4O7S M+FA-H ↓#* 鞘脂代谢 8.86E-05 65 LacCer（d18:1/12:0） HILIC 806.5705 C42H79NO13 M+H ↑ 花生四烯酸代谢 1.30E-04 66 LysoPC（14:0/0:0） HILIC、T3 512.3009 C22H46NO7P M+FA-H ↓ − 3.34E-02 67 2-（14,15-环氧二十碳三烯酰基）甘油 HILIC 395.2749 C23H38O5 M+H ↑ − 1.41E-03 68 赖氨酰苯丙氨酸 HILIC 294.1891 C15H23N3O3 M+H ↑ 醚脂代谢 2.52E-04 69 二十四碳四烯酸肉碱 HILIC、T3 526.3786 C31H53NO4 M+Na ↑ − 2.98E-05 70 1-（11Z二十二碳烯酰基）-3-磷酸甘油酯 HILIC 515.3163 C25H49O7P M+Na ↑ − 8.91E-07 注：↑表示模型组较对照组相对升高趋势，↓表示模型组较对照组相对下降趋势，P值为模型组与对照组间代谢物水平的t检验计算结果；
#表示代谢物经葛根-知母药对干预后具有回调趋势（共47个），*表示代谢物（共20个）经葛根-知母药对干预后回调差异具有统计学意义（P<0.05）。3.2.3 药物的干预效果
利用各组间的FC值变化情况判断药对干预后的回调代谢物。对于具有回调趋势的代谢物多组间变化情况进行单因素方差分析，P<0.05的代谢物确定为药对干预后显著回调的差异代谢物。结果显示，葛根-知母药对干预后出现回调的差异代谢物共计47个，其中，显著回调代谢物20个（表1和图5）。
图 5 20个显著回调代谢物在不同组间的相对信号强度*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 与模型组比较; #P<0.05, ##P<0.01，###P<0.001，与对照组比较。对70个AD相关的差异代谢物和葛根-知母药对干预后显著回调的20个差异代谢物分别进行通路富集分析后发现（图6），AD模型大鼠潜在疾病生物标志物涉及通路主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、嘧啶代谢等。葛根-知母药对干预可对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢和初级胆汁酸生物合成等通路产生回调影响。
图 6 血清差异代谢物KEGG通路富集分析A.模型组与对照组；B.葛根-知母药对干预后回调通路（1.苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；2.苯丙氨酸代谢；3.亚油酸代谢；4.不饱和脂肪酸的生物合成；5.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；6.精氨酸生物合成；7.烟酸和烟酰胺代谢；8.嘧啶代谢；9.酪氨酸代谢；10.初级胆汁酸生物合成）4. 讨论
AD是一种复杂的中枢神经系统异质性疾病，具体病因尚不明确。目前已知可导致AD的因素包括基因突变、氧化应激、神经炎症以及多种环境和疾病因素[11] 。衰老被认为是AD最相关的危险因素[12] ，啮齿类动物长期摄入D-gal可产生包括氧化应激、炎症反应在内的多种与人类相似的衰老相关变化[13] 。铝元素可通过促进中枢神经系统炎症反应、降低脑中SOD活性，影响胆碱能神经传递、促进Tau蛋白磷酸化等形式诱导神经毒性，过量铝暴露与AD等中枢神经系统退行性疾病进展相关[14] 。研究表明，D-gal与AlCl3联合应用可产生类似于自然衰老的变化及AD相关特征[15] 。因此，本研究选取D-gal与AlCl3联合造模，通过大鼠长程给药模拟和还原AD相关的病程和病理变化，力求更加精准地反映AD患者体内代谢分子水平变化。药效学实验表明，D-gal和AlCl3联合给药后大鼠学习和记忆能力明显下降，体内氧化应激和炎症相关因子水平发生变化，表明该模型成功模拟AD相关的病理变化和特征。而葛根-知母药对干预可显著改善AD模型大鼠的学习和记忆能力，并回调SOD、NO和MDA等相关生化指标，改善和回调效果优于单药，表明葛根和知母配伍后在AD防治中具有一定的增效作用，具备进一步研究的价值。
代谢组学结果表明，葛根-知母药对可以显著回调血清中20种代谢物，主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酪氨酸代谢等途径。酪氨酸是一些神经递质或者神经调节剂的前体。Liu[16]等对尸源样本进行非靶向和靶向代谢组学分析发现，AD患者海马中苯丙酮酸含量普遍上调，表明苯丙氨酸代谢失调可能是AD病理形成的重要机制。本研究同样发现AD模型大鼠血清中苯丙酮酸水平较对照组显著升高，葛根-知母药对可以显著回调苯丙酮酸至生理水平。脯氨酸是一种非必需氨基酸，参与氧化还原调控和细胞凋亡，既是活性氧（ROS）清除剂，也是ROS生产者，因此，平衡脯氨酸水平和脯氨酸相关代谢酶活性对维系细胞生理功能至关重要。脯氨酸代谢可能会通过ROS、细胞衰老和细胞免疫等机制影响神经元功能[17] 。Xu等[18]整合代谢组学与蛋白质组学结果发现，脱脂核桃粉可以通过升高小鼠脑组织中脯氨酸等多种氨基酸水平发挥对东莨菪碱诱导的AD小鼠神经保护机制。这与本实验结果相似，葛根-知母药对可以通过回调脯氨酸水平发挥AD防治作用。
此外，本研究发现多种回调代谢物与脂质代谢密切相关。花生四烯酸和α-亚麻酸是由多不饱和脂肪酸氧化产生的脂氧化物，广泛参与机体炎症、免疫等多种生理病理进程。花生四烯酸升高可进一步提高氧化应激水平，与AD等疾病进程紧密相关[19] 。AD与胆汁酸代谢异常之间存在紧密关联，这可能与肠-肝-脑轴机制相关。有研究表明AD患者血浆中胆汁酸水平升高[20] 。磷脂是保持细胞膜完整性的主要物质，溶血磷脂酰胆碱是磷脂的降解产物，与磷脂代谢密切相关，磷脂代谢异常可导致溶血磷脂酰胆碱下调，表现为细胞凋亡及信号转导异常，是AD的潜在诱因之一[21] 。本研究表明，葛根-知母药对的AD防治作用效果可能与显著回调血清中花生四烯酸、α-亚麻酸、甘胆酸、鹅去氧胆酸和溶血磷脂酰胆碱水平相关。
ROS产生与消除之间的不平衡被称为氧化应激，氧化应激是AD等疾病的关键因素和共同点。NO是ROS的一种，也是神经传递和炎症相关的重要因素。高水平ROS会触发不饱和脂肪酸的脂质过氧化，导致MDA等高反应性化合物的产生，因此MDA是脂质过氧化和氧化应激的标志。SOD是抵消ROS有害影响最有效的一线防御机制。SOD可以通过去除超氧自由基防止更具破坏力的过氧亚硝酸盐生成，并维持体内NO在生理相关水平[22, 23] 。代谢组学结果提示，葛根-知母药对回调干预的多种途径与氧化应激和脂质过氧化相关。ELISA实验结果进一步表明，葛根-知母药对干预可提高AD大鼠体内SOD水平，回调NO和MDA至生理水平，提示葛根-知母药对可以通过调节氧化应激和脂质过氧化，维持体内NO的生理水平对AD产生防治作用。
综上，本文通过建立AD大鼠模型考察了葛根-知母药对防治AD的作用效果，药对药效优于单药；运用代谢组学策略揭示其改善AD大鼠学习和记忆能力相关的潜在代谢物和代谢路径，其作用机制可能与调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代谢通路、改善氧化应激和脂质过氧化水平等相关，为中药药对防治AD的临床应用和进一步开发提供了科学依据。
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图 1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠构建策略、培育流程及基因型鉴定
A. Pf4-Cre酶特异性切除巨核细胞及血小板谱系Metrnl同向LoxP位点间的序列，棕色框为等位基因编码区，红色框为非编码区； B. Plt-Metrnl-/-小鼠培育繁殖流程；C. 母代小鼠及DNA电泳条带图；D. 二代小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图；E. Plt-Metrnl-/-小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图
图 4 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各血细胞及各组织的Metrnl蛋白表达情况（
$\bar x $ +s, n=3）A.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.脑组织；G.结肠组织；H.外周血白细胞；I.外周血红细胞
图 5 Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠扩大繁殖流程和子代鼠一般繁殖情况
A. Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程；B.子代鼠性别比例；C.子代鼠基因型比例
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） Metrnl loxp TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGC GGATGAGCGTTTGAGCACAGC Pf4-Cre CCAAGTCCTACTGTTTCTCACTC TGCACAGTCAGCAGGTT 内参基因 CAAATGTTGCTTGTCTGGTG GTCAGTCGAGTGCACAGTTT 
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表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） Mouse Metrnl CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT GGACAACAAAGTCACTGGTACAG Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG
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表 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血常规指标对比（n=6）
血常规检验项目 WT Plt-Metrnl-/- 白细胞计数（109/L） 2.10±0.50 2.25±0.30 淋巴细胞计数（109/L） 1.28±0.20 1.52±0.20 淋巴细胞比率（%） 63±3 68±3 嗜酸性粒细胞计数（109/L） 0.10±0.05 0.05±0.02 嗜酸性粒细胞比率（%） 3.0±1.8 1.0±0.3 其他细胞计数（109/L） 0.72±0.20 0.68±0.10 其他细胞比率（%） 34.0±3.3 31±3 红细胞计数（1012/L） 8.49±0.40 7.83±0.40 血红蛋白（g/L） 122.0±5.5 113.0±4.6 红细胞压积（%） 42±2 37±2 平均红细胞体积（fL） 49.1±0.8 47.7±0.9 平均血红蛋白含量（pg） 14.30±0.08 14.5±0.1 平均血红蛋白浓度（g/L） 292±5 304.0±7.7 红细胞分布宽度-SD（fL） 27.6±0.4 26.2±0.6 红细胞分布宽度-CV（%） 13.2±0.4 12.4±0.3 血小板计数（109/L） 1121 ±581049 ±132血小板平均宽度（fL） 6.7±0.4 6.1±0.1 平均血小板体积（fL） 6.20±0.26 5.80±0.08 大型血小板比率（%） 1.9±1.0 3.5±0.3
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