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据相关流行病学调查[1]显示，全球约有3亿人患有支气管哮喘，其中，中国占1/10，且病情控制现状并不理想。孟鲁司特钠作为指南推荐的可单独应用的长期控制性药物，虽可抑制支气管痉挛现象，但长期使用药物毒副作用增加，加之患者依从性较低，影响了整体疗效[2-3]。与现代医学相比，中医强调从整体着眼，根据患者个体情况辨证论治，以极大的发挥中医中药独特优势，现在支气管哮喘的治疗中取得良好成效[4-5]。支气管哮喘在中医中归属“哮病”、“喘证”范畴，多由饮食不当，邪气外侵，引动伏痰，痰壅气道，郁而化热，肺气上逆，肺失宣降所致。因而治疗应以化痰平喘，宣肺降气，疏风清热为主。同时，中医整体观念认为肺主气，鼻为肺之窍，喉为肺之门，故而肺部病变多伴有鼻、咽喉证候。因此在治疗时应重视整体肺系，强调辨主病，抓主症，标本兼治，寒热兼顾。平喘方将张仲景麻杏石甘汤作为主方，辅以王琦教授脱敏调体方，起到了体、病、证并调的作用，具有宣肺平喘，清热化痰的功效。祖雅琪等[6]研究显示，中西医联合治疗可明显提高支气管哮喘患者临床疗效。本研究拟将平喘方联合孟鲁司特钠应用于支气管哮喘患者的治疗中，从疗效、中医证候积分、炎症因子及不良反应等方面探讨临床影响。
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选取2022年5月至2023年12月宝鸡市妇幼保健院（本院）收治的102例支气管哮喘患者。纳入标准：①西医：满足支气管哮喘诊断标准[7]。②中医[8]：热哮证，主症：喉中痰鸣，气粗息涌，咳呛阵作；次症：胸髙胁胀，口渴喜饮，面赤，汗出，烦闷不安，口苦；舌脉象：舌质红、苔黄腻，脉滑数或弦滑。同时有以上2项主症和1项次症、舌脉即可确诊。排除标准：对此次研究药物过敏者；存在重度和危重哮喘者；存在因其他原因引起的胸闷、咳嗽者；存在恶性肿瘤者；存在肝、肾、心、脑等脏器功能障碍者；入组前接受过相关治疗者。
将试验患者按照简单随机法分为对照1组（孟鲁司特钠治疗，n=34）、对照2组（平喘方治疗，n=34）及观察组（平喘方联合孟鲁司特钠治疗，n=51）。对照1组：男∶女=14∶20，年龄2~5岁（3.09±0.71），病程3~11个月（7.35±1.21），轻度18例，中度16例；对照2组：男∶女=16∶18，年龄2~5岁（3.17±0.82），病程3~11个月（7.26±1.09），轻度19例，中度15例；观察组：男∶女=11∶23，年龄2~5岁（3.28±0.75），病程3~11个月（7.42±1.13）， 轻度20例， 中度14例。3组基线资料经对比，无明显差异（P>0.05）。此次研究经医院伦理委员会审批通过， 且患者监护人对此次研究知情同意。
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对照1组予以孟鲁司特钠（国药准字H20183239， 杭州民生滨江制药有限公司） 治疗。 4 mg/次，1次/d，睡前服用，持续治疗21 d。
对照2组予以平喘方治疗。平喘方药方组成：生石膏30 g、乌梅20 g、炙麻黄10 g、杏仁10 g、蝉蜕10 g、防风10 g、赤芝10 g，生甘草6 g。由我院药剂科以水煎制，200 mg/d，分早晚2次服用。7 d为一个疗程，持续治疗21 d。
观察组予以孟鲁司特钠联合平喘方治疗。孟鲁司特钠用法用量同对照1组；平喘方用法用量同对照2组。
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于疗程治疗结束后评估临床疗效，分为临床控制、显效、有效和无效。临床控制：患者气急、胸闷和咳嗽等症状及体征基本消失，偶有哮喘发作但无需用药即可恢复，中医证候积分减少>95%；显效：患者气急、胸闷和咳嗽等症状和体征明显改善，中医证候积分减少70%~95%；有效：患者气急、胸闷和咳嗽等症状和体征均有好转，中医证候积分减少30%~69%；无效：证候积分减少29%以下，气急、胸闷和咳嗽等症状和体征均无改善。总有效率=临床控制率+显效率+有效率。
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于治疗前后根据《中医病证诊断疗效标准》评估患者主症（喉中痰鸣，气粗息涌，咳呛阵作）中医证候积分，根据症状程度分别记为0分（无）、2分（轻度）、4分（中度）、6分（重度），分数降低，提示症状好转。
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采集患者治疗前后空腹静脉血3 ml，经离心处理后取上层清液，放置于−40℃环境中保存待检。采用酶联法（浙江羽翔生物科技有限公司）检测白细胞介素（IL）-12、IL-17、干扰素（IFN）-γ、免疫球蛋白（Ig）E、转化生长因子（TGF）-β1水平。
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于治疗前后评估患者呼吸和哮喘控制测试（TRACK）评分[11]，该测试包括5项内容，采用0、5、10、15、20分，总分0~100分，分数越高哮喘控制越好。
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记录不良反应，如腹泻、头痛、皮疹、恶心呕吐等发生情况。
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将SPSS 22.0作为数据处理软件，计量资料经检验均满足正态分布，以（
$ \bar{x} $ ±s）表示，计数资料用[例（n），百分比（%）]表示，分别行t检验、单因素方差分析和χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。 -
与对照1组和对照2组相比，观察组总有效率更高（P<0.05），但对照1组与对照2组总有效率比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表 1 3组临床疗效对比[n（%）]
组别 例数 临床控制 显效 有效 无效 总有效率 观察组 34 5（14.71） 19（55.88） 8（23.53） 2（5.88） 94.12 对照1组 34 1（2.94） 11（32.35） 13（38.24） 9（26.47） 73.53 对照2组 34 3（8.82） 12（35.29） 11（32.35） 8（23.53） 76.47 x2/P（观察组vs 对照1组） 5.314/0.021 x2/P（观察组vs 对照2组） 4.221/0.040 x2/P（对照1组vs 对照2组） 0.078/0.779 -
与对照1组和对照2组相比，治疗后观察组（喉中痰鸣、气粗息涌、咳呛阵作）中医证候积分均更低（P<0.05），但对照1组与对照2组中医证候积分比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
表 2 3组中医证候积分对比（
$ \bar{x} $ ±s，n=34）组别 喉中痰鸣 气粗息涌 咳呛阵作 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 观察组 4.43±0.38 1.37±0.31*#▲ 4.38±0.44 1.12±0.22*#▲ 4.35±0.50 1.09±0.31*#▲ 对照1组 4.49±0.36 1.96±0.42* 4.41±0.47 1.37±0.29* 4.33±0.48 1.48±0.26* 对照2组 4.46±0.37 1.82±0.35* 4.36±0.45 1.31±0.30* 4.39±0.46 1.41±0.29* F 0.223 24.540 0.105 7.809 0.138 17.796 P 0.800 <0.001 0.901 0.001 0.872 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与对照1组比较；▲P<0.05，与对照2组比较。 -
治疗后观察组IL-4、IL-17、TGF-β1及IgE水平均低于对照1组与对照2组，IFN-γ水平高于对照1组与对照2组（P<0.05），但对照1组与对照2组上述指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。
表 3 3组炎症因子对比（
$ \bar{x} $ ±s，n=34）指标 时间 观察组 对照1组 对照2组 F P IFN-γ（pg/ml） 治疗前 79.37±5.42 79.85±5.27 79.52±5.34 0.072 0.931 治疗后 136.43±9.19*#▲ 120.72±8.74* 122.48±8.63* 32.112 <0.001 IL-4（ng/L） 治疗前 48.96±4.51 49.13±4.36 49.05±4.27 0.013 0.987 治疗后 24.60±2.42*#▲ 30.55±2.50* 29.63±2.71* 53.094 <0.001 IL-17（pg/ml） 治疗前 13.58±2.60 13.78±2.39 13.91±2.45 0.153 0.859 治疗后 5.96±1.23*#▲ 10.39±1.46* 10.47±1.32* 126.142 <0.001 TGF-β1（ng/ml） 治疗前 25.73±3.18 25.85±3.21 25.90±3.42 0.024 0.976 治疗后 11.81±1.32*#▲ 16.33±2.14* 15.45±1.98* 57.186 <0.001 IgE（IU/ml） 治疗前 218.39±18.72 218.82±19.03 218.62±18.75 0.004 0.996 治疗后 132.56±9.14*#▲ 167.70±12.52* 163.84±11.13* 104.015 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与对照1组比较；▲P<0.05，与对照2组比较。 -
治疗前，观察组、对照1组、对照2组TRACK评分分别为（52.48±2.37）、（52.57±2.41）、（52.69±2.32）分，差异无统计学意义（F=0.067、P=0.935）；治疗后，观察组TRACK评分为（74.39±3.54）分，高于对照1组的（67.25±2.16）分和对照2组的（66.73±2.40）分（F=81.401、P<0.001）。
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3组均无严重不良反应发生，仅观察组出现3例恶心呕吐、2例头晕和3例皮疹，对照1组发生3例腹泻和2例恶心呕吐，对照2组发生3例恶心呕吐和1例皮疹，经对比差异无统计学意义（x2=1.835，P=0.399）。
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中医认为支气管哮喘的主要病位为肺，并涉及到脾、肾，当其受损后，肺失宣降，脾不健运，肾不制水，导致津液聚集成痰，伏藏于肺，成为发病的“夙根”，再加之外感风邪、内伤饮食，或先天禀赋不足，导致积痰蒸热，热痰蕴肺，壅阻气道，肺失宣降，肺管狭窄，通畅不利，痰和气交结于此，相互搏结，出现痰鸣、喘促等病症，发为哮喘[12-13]。元·朱丹溪也曾在《丹溪心法》中提出：“哮喘专主于痰”，故痰阻气闭为发作时的主要病理环节，并以邪实为主，伏痰或因素体阳盛导致痰从热化，热痰伏肺，肺气上逆，遇感而生，属痰热则发为热哮证。因小儿肺脏娇嫩，肺常不足，气宣发功能尚不健全，腠理开合、固表抗邪的功能较弱，御邪能力较弱，藩篱不固，抗病能力不强，故更易受风邪侵袭而发病。因而临床对于本病的治疗应以清肺平喘、化痰宣肺为主。
平喘方主要由生石膏、炙麻黄、乌梅、杏仁、蝉蜕、防风、赤芝及生甘草组成，其中乌梅一能入肺则收，针对肺气失于宣降可收敛浮热，纳气归元，助纳气定喘，二则生津润肺，可防辛散之药损耗津气。防风乃风药中之润剂，更是祛风之要药，微温而不燥，药性缓和，用于热哮证哮喘可发挥祛风止痉的功效。乌梅与防风配伍使用，散收兼顾，相辅相成，在祛除外邪的同时而不耗伤气津，起到敛肺祛邪，化痰而不耗其气的功效。蝉蜕散风除热，利咽；赤芝止咳平喘，二者配伍相用，扶正祛邪，标本兼治，以调禀质。炙麻黄质轻味薄之品，入肺经，具宣肺平喘之功，可疏通营卫，开宣肺气，透达表邪。生石膏清泄肺胃之热以生津，与麻黄相配，既能宣肺，又能泻热。杏仁祛痰止咳，平喘，润肠，可宣肺降气行滞而消痰饮，通胸阳以开肺闭，既助石膏沉降下行，又助麻黄泻肺热，甘草防石膏之大寒伤胃，调和麻黄与石膏的寒热。纵观全方，配伍严谨，清宣降、调体质，紧扣病因病机，共奏清肺平喘、宣泄郁热、祛风化痰的功效。本研究中根据样本量公式N=[2pq（Za+Zβ）2]/（p1-p2）2，计算出总例数为102例，按简单随机法分组，各组均为34例。与对照1组和对照2组相比，观察组总有效率更高，中医证候（喉中痰鸣、气粗息涌、咳呛阵作）积分均更低，表明平喘方联合孟鲁司特钠治疗利于提高支气管哮喘患者临床疗效，改善临床症状。可能为平喘方从哮喘发病的根本出发，宣降肺气定其喘，祛热化痰撼其根，以调其脏腑功能达到治本目的，继而起到提高整体疗效的作用。
支气管哮喘发病机制复杂，随着现代医学的不断深入研究认为免疫炎症与支气管哮喘发病密切相关，其中Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡为重要发病机制[14-15]。Th17细胞属于促炎性Th细胞，在促炎和自身免疫性疾病中发挥重要作用，主要分泌IL-17等炎性因子，Treg细胞是抑制性T细胞的一种功能亚群，能分泌TGF-β1等因子，有效抑制免疫强度，降低炎症损伤；INF-γ为Th1细胞的标志性因子，其含量可间接反映Th1功能活性，介导细胞免疫应答；IL-4由Th2细胞分泌，可对体液免疫产生介导作用，诱导IgE大量产生，从而加重气道炎症[16-17]。本研究中治疗后观察组IL-4、IL-17、TGF-β1及IgE水平均低于对照1组和对照2组，IFN-γ水平高于对照1组和对照2组，但对照1组与对照2组上述指标比较，差异均无统计学意义，提示平喘方联合孟鲁司特钠治疗更利于改善支气管哮喘患者Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡现象，缓解炎症反应造成的免疫损伤。考虑为现代药理学研究表明麻黄具有抗炎、抗过敏、平喘的作用；生石膏具有增强免疫功能的作用；杏仁止咳平喘、抗炎、调节免疫；甘草中多种成分如甘草酸、多糖等均能起到抗炎、增强免疫力的功效。诸药合用，进一步调节免疫应答，减轻炎症反应。本研究中治疗后观察组TRACK评分较对照1组和对照2组均更高，但对照1组与对照2组比较无差异，这一结果再次证实了平喘方联合孟鲁司特钠治疗的有效性，对于缓解病情，控制哮喘发生有积极意义。本研究中3组不良反应比较差异无统计学意义，提示平喘方联合孟鲁司特钠治疗具较高的安全性，并不会增加患者不良反应的发生率。
综上所述，平喘方联合孟鲁司特钠治疗利于提高支气管哮喘患者临床疗效，并可缓解病情，调节炎症因子水平。本研究不足之处在于纳入样本量偏少，结果可能存在偏倚性，今后应扩大样本量对更多的可能机制进一步探讨研究。
Clinical curative effect of Pingchuan prescription combined with montelukast sodium on patients with bronchial asthma
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摘要:
目的 探讨平喘方联合孟鲁司特钠治疗儿童支气管哮喘的临床疗效。 方法 选取2022年5月至2023年12月宝鸡市妇幼保健院收治的102例支气管哮喘患者，据简单随机法分为对照1组（孟鲁司特钠治疗，n=34）、对照2组（平喘方治疗，n=34）及观察组（平喘方联合孟鲁司特钠治疗，n=51），均持续治疗21 d。评估3组临床疗效。于治疗前后对比3组中医证候积分、炎症因子[白细胞介素（IL）-4、IL-17、干扰素（IFN）-γ、转化生长因子-β1（TGF-β1）、免疫球蛋白（Ig）E]及儿童呼吸和哮喘控制测试（TRACK）评分；记录不良反应。 结果 与对照1组和对照2组相比，观察组总有效率更高（P<0.05）。治疗后观察组（喉中痰鸣、气粗息涌、咳呛阵作）中医证候积分与对照1组和对照2组相比均更低（P<0.05）。治疗后，观察组IL-4、IL-17、TGF-β1及IgE水平均低于对照1组和对照2组，IFN-γ水平及TRACK评分均高于对照1组和对照2组（P<0.05）。3组不良反应对比无差异（P>0.05）。 结论 平喘方联合孟鲁司特钠用于治疗支气管哮喘患者可提高临床疗效，利于减轻炎症反应，缓解病情，且具安全性。 Abstract:Objective To explore the clinical curative effect of Pingchuan prescription combined with montelukast sodium on patients with bronchial asthma. Methods A total of 102 patients with bronchial asthma admitted to the hospital were enrolled between May 2022 and December 2023. According to simple randomization method, they were divided into control 1 group （montelukast sodium, n=34）, control 2 group （Pingchuan prescription, n=34） and observation group （Pingchuan prescription combined with montelukast sodium, n=51）. All patients were treated for 21 d. The clinical curative effect in the three groups was evaluated. The scores of TCM syndromes, inflammatory factors [interleukin（IL）-4, IL-17, interferon（IFN）-γ, transforming growth factor-β1（TGF-β1）, immunoglobulin（Ig）E] and scores of the test for respiratory and asthma control in kids （TRACK） in the three groups were compared before and after treatment. The adverse reactions were recorded. Results Compared with control 1 group and control 2 group, total response rate was higher in observation group （P<0.05）. After treatment, scores of TCM syndromes （wheezing due to phlegm in throat, tachypnea, choking）in observation group were lower than those in control 1 group and control 2 group （P<0.05）. After treatment, levels of IL-4, IL-17, TGF-β1 and IgE in observation group were lower than those in control 1 group and control 2 group, while IFN-γ level and TRACK score were higher than those in control 1 group and control 2 group （P<0.05）. There was no difference in adverse reactions among the three groups （P>0.05）. Conclusion Pingchuan prescription combined with montelukast sodium could improve clinical curative effect in patients with bronchial asthma, which was beneficial to alleviate inflammatory response and disease severity, with certain safety. -
Key words:
- Pingchuan prescription /
- montelukast sodium /
- bronchial asthma /
- inflammatory factor
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新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），是指2019年始发、由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn-drome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的肺炎。截至2020年4月5日，全球共确诊COVID-19患者1 093 349例，死亡58 620例[1]。目前尚无针对COVID-19的特异性治疗药物，一些化学药物包括氯喹/羟氯喹、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦等正在临床开展随机对照研究。临床实践表明，清肺排毒汤和连花清瘟胶囊等多种中药方剂和制剂对COVID-19有良好的治疗效果。据国家卫生健康委员会报道，在我国确诊的COVID-19病例中，有74 187人使用了中医药，占91.5%；中医药能够缓解症状，减少轻型、普通型疾病向重型发展，提高治愈率、降低病死率，总有效率达90%以上[2]。
柴胡达胸合剂，曾用名为“强力肺炎1号”，是国医大师梅国强教授为痰热壅肺证COVID-19患者制定的中药处方[3]。柴胡达胸合剂由小柴胡汤、小陷胸汤、达原饮、止嗽散共同组方，包含柴胡、黄芩、法半夏、全瓜蒌、黄连、枳实、甘草、浙贝母、桔梗、百部、前胡、紫苑、款冬花、槟榔、草果、藿香、佩兰、虎杖共十八味中药。由于临床使用疗效显著，2020年2月23日，湖北省药品监督管理局下发制剂备案批件，包括柴胡达胸合剂在内的2个由湖北省中医院研制的医院制剂获批用于防治COVID-19[4]。
网络药理学是基于系统生物学和多向药理学技术和方法，通过构建“药物-基因-疾病”网络，分析药物在网络中与特定节点相互作用的关系，从整体角度探索药物与机体相互作用的一门学科[5]。2007年，Hopkins首次在Nature Biotechnology杂志上发表述评，提出网络药理学这一概念，并认为其为发现新药的新范式[6]。中药通过多成分、多靶点、多通路对疾病产生治疗作用，利用网络药理学方法，可系统阐明中药治疗疾病的药理作用机制[7]。
因此，本研究运用网络药理学方法，筛选柴胡达胸合剂治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，构建“药材-活性成分-靶点”网络图，然后对靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac-tion, PPI）、GO基因注释和KEGG信号通路分析，为进一步阐明柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 柴胡达胸合剂药材的性味归经、活性成分和靶点的筛选
通过《中华人民共和国药典》（2015年版）手工检索柴胡达胸合剂的十八味中药材的性味归经，利用Cytoscape 3.7.2软件制作“药材-性味归经”网络图。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）以柴胡达胸合剂中的十八味中药材名为关键词检索得到所有中药的化学成分。生物利用度（oral bioavailability，OB）和半衰期（half life，HL）是影响药动学的重要参数，而类药性（drug-likeness，DL）可以反映化合物的理化性质与已上市的药物是否类似。根据TCMSP数据库推荐的筛选标准，本研究以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件，筛选得到每味中药材的活性成分。同时，通过 TCMSP 数据库查找各活性成分的作用靶点，归纳整理后利用Uniprot 数据库（
https://www.uniprot.org/ ）标准化靶点名称。1.2 “药材-活性成分-靶点”网络图的构建
以coronavirus为关键词，检索GeneCards（
https://www.genecards.org/ ）和OMIM（https://omim.org/ ）数据库获得COVID-19潜在相关基因；利用Venn图在线绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ ），将柴胡达胸合剂活性成分的作用靶点和COVID-19相关基因取交集，得到柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点；最后，将得到的药材-活性成分-靶点关联性文本导入Cytoscape 3.7.2软件，构建并分析“药材-活性成分-靶点”网络。1.3 PPI网络构建
将柴胡达胸合剂治疗 COVID-19作用靶点导入STRING 蛋白相互作用数据库（
https://string-db.org/ ），物种选定为Homo sapiens，获得PPI信息并导入Cytoscape 3.7.2软件，利用NetworkAnalyzer功能，分析网络中每个靶点的度值（dgree value），使用R软件Graphics包，绘制条形图展示度值排名前20位的靶点。1.4 GO基因注释和KEGG通路分析
利用R软件的org.Hs.eg.db和clusterProfiler包，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点进行GO基因注释和KEGG通路分析，以P＜0.05进行筛选，得到柴胡达胸合剂对COVID-19发挥治疗作用参与的生物学过程和信号通路，并绘制气泡图展示结果。
2. 结果
2.1 柴胡达胸合剂的药材性味归经
柴胡达胸合剂“药材-性味归经”网络如图1所示，图中节点的大小代表该节点在网络中的度值。由图可知，度值最大的性味归经分别为寒（度值=8）、苦（度值=13）和肺经（度值=14）。
2.2 柴胡达胸合剂的活性成分及其作用靶点
通过TCMSP平台检索到柴胡达胸合剂中的十八味药材共包含1 977个化合物。以OB≥30%，DL≥0.18及HL≥4 h为条件筛选并去重后，共得到221个活性成分。在TCMSP检索活性成分的作用靶点，并到Uniprot数据库中查找其标准名称，最后共得到259个作用靶点。柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息，结果见表1。
表 1 柴胡达胸合剂的“中药-化合物-活性成分-靶点”信息表中药名称 化合物（个） 活性成分（个） 靶点（个） 柴胡 349 14 165 黄芩 143 32 95 法半夏 116 11 70 全瓜蒌 80 7 8 黄连 48 10 153 枳实 65 14 98 甘草 280 76 198 浙贝母 17 4 29 桔梗 102 7 63 百部 110 18 82 前胡 101 11 157 紫菀 91 13 175 款冬花 148 19 155 槟榔 52 3 10 草果 59 5 136 藿香 94 9 147 佩兰 60 6 73 虎杖 62 8 159 2.3 柴胡达胸合剂治疗 COVID-19的作用靶点
通过检索GeneCards和OMIM数据库，共收集得到COVID-19相关基因352个。将柴胡达胸合剂的作用靶点和COVID-19相关基因取交集制作Venn图，共得到51个交集基因，即柴胡达胸合剂治疗COVID-19的作用靶点（图2）。
2.4 “药材-活性成分-靶点”网络
柴胡达胸合剂治疗COVID-19“药材-活性成分-靶点”网络共包含234个节点（药材节点18个，有效成分节点165个，靶点节点51个）。网络中棱形代表药材节点，倒三角代表有效成分节点，圆形代表靶点节点（图3）。节点的颜色越深或节点图形越大，表明该节点在网络中的度值越高。每一圈的最低点为该圈度值最大的节点，度值沿逆时针方向逐渐减小，且3个有效成分节点圈由外往里节点度值依次减小。网络中化合物节点中位数为4，高于2倍中位数的化合物节点共有12个（表2），这些化合物可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要活性成分。
表 2 高于2倍度值中位数的化合物信息表TCMSP数据库ID 化合物名称 对应药材 度值 MOL000098 槲皮素（quercetin） 草果、柴胡、甘草、虎杖、黄连、藿香、款冬花、前胡、紫菀 46 MOL000006 木犀草素（luteolin） 虎杖、桔梗、佩兰、枳实、紫菀 23 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 柴胡、甘草、款冬花、紫菀 16 MOL000358 β-谷甾醇（beta-sitosterol） 百部、半夏、浙贝母、虎杖、黄芩、款冬花、前胡、紫菀 15 MOL000173 汉黄芩素（wogonin） 黄芩 14 MOL004328 柚皮素（naringenin） 甘草、枳实 13 MOL002714 黄芩素（baicalein） 半夏、黄芩 10 MOL000497 甘草查尔酮A（licochalcone A） 甘草 10 MOL001689 刺槐素（acacetin） 黄芩、桔梗 10 MOL005828 川陈皮素（nobiletin） 枳实 10 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 柴胡、甘草、紫菀 9 MOL005916 葛花苷元（irisolidone） 藿香 9 2.5 PPI网络
在“药材-活性成分-靶点”网络中的靶点节点不包含PPI信息，因此，对柴胡达胸合剂治疗COVID-19靶点进行PPI分析，结果如图4A所示。图中节点形状越大，表明其度值越高，越可能为柴胡达胸合剂治疗COVID-19的核心作用靶点。对网络中度值前30的节点作条形图，节点度值排名前10的蛋白为CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2 和CCL2（图4B）。
2.6 GO基因注释
GO基因注释将基因的功能分为3个部分：参与的生物学过程（biological process，BP），所处的细胞组分（cellular component，CC），执行的分子功能（molecular function，MF）。对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行GO基因注释，以P＜0.05为条件进行筛选，结果得到GO条目共1 722个，其中BP条目1 612个，CC条目30个，MF条目80个。选取每个部分的前5个条目作气泡图，富集最多基因且P值最小的BP、CC和MF条目分别为脂多糖反应、膜筏和细胞因子受体结合（图5）。
2.7 KEGG信号通路分析
对柴胡达胸合剂治疗COVID-19的51个作用靶点进行 KEGG 信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路156条，选取富集基因最多的10条通路作气泡图。排名前5的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎（图6）。
3. 讨论
COVID-19隶属于中医的“温疫”、“疫病”范畴，病因为感受“异气”、“疠气”，疠气夹湿，病位在肺、脾[3]。柴胡达胸合剂用于痰热壅肺证患者，其病因为痰热互结，壅闭于肺，致使肺失宣降而表现的肺经实热证候。本研究首先对柴胡达胸合剂的十八味中药材进行性味归经的网络分析，结果发现柴胡达胸合剂组方的性味以“苦寒”最多且主归肺经。“苦寒”药能清热泻火，消除热症，多用于具有实热特征病证[8]。因此，柴胡达胸合剂与COVID-19的病机、病位相符。
利用中药、疾病相关数据库，本研究筛选出柴胡达胸合剂治疗COVID-19的165个活性成分和51个作用靶点，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19具有多成分、多靶点的特点。通过构建和分析“药材-活性成分-靶点”网络图，发现网络中度值较高的12个活性成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A、刺槐素、川陈皮素、异鼠李素和葛花苷元。除β-谷甾醇外，其余11个成分均属于黄酮类化合物。
黄酮类化合物广泛存在于自然界的多种植物中，具有包括抗炎、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等多种药理作用[9]。黄酮类化合物还有良好的抗病毒作用，对流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒等都有抑制作用[10]。体外实验研究表明，槲皮素和木犀草素均能够抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性，对SARS-CoV 产生抑制作用[11-12]。β-谷甾醇也能抑制SARS-CoV 3CL蛋白酶活性[13]。SARS-CoV-2与SARS-CoV基因序列有约80%同源性，两者3CL蛋白酶结构有相似性[14]。此外，分子对接结果发现山柰酚、槲皮素、 黄芩素、 木犀草素、 汉黄芩素、β-谷甾醇与SARS-CoV-2 3CL蛋白酶均有较高的结合活性[15]。因此，通过直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，可能是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制之一。
通过分析PPI网络发现，CASP3、MAPK3、IL-6、MAPK8、IL-10、CXCL8、MAPK1、IL-1B、PTGS2、CCL2等在网络中有较高的度值。CASP3基因编码的caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中重要的终末剪切酶，研究发现caspase-3蛋白在SARS-CoV病毒引起的组织细胞凋亡过程中发挥了重要作用[16]。MAPK基因编码的丝裂原活化蛋白激酶参与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等多个生物学过程。此外，炎症因子风暴被认为是重症COVID-19患者组织损伤的病理机制之一。SARS-CoV-2病毒在体内激活T细胞，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6等细胞因子，随后GM-CSF会进一步激活CD14+CD16+炎性单核细胞，进一步升高IL-6等炎性因子，形成炎症因子风暴，导致严重的肺部和其他器官免疫损伤[17]。细胞因子根据其在炎性反应中的作用不同可分为促炎性细胞因子（如 IL-1、IL-6、IFN-α、IFN-γ、TNF-α 等）和抑炎性细胞因子（如 IL-4、IL-10 等）两类。SARS患者的肺部炎症和肺损伤与患者血浆中的IL-1B、IL-6、IL-12等促炎性细胞因子水平升高引起炎症因子风暴有关[18]。同样地，COVID-19患者血浆IL-1B、IFN-γ、CXC趋化因子-10（CXCL-10）等促炎性细胞因子水平也升高[19]。本研究中，IL-6、IL-10和IL-1B均为核心作用靶点。因此，减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平可能也是柴胡达胸合剂治疗COVID-19的药理作用机制。
对靶点进行GO基因注释的结果表明，柴胡达胸合剂治疗COVID-19的主要生物学过程为脂多糖反应、对源于细菌的分子的反应和氧化应激反应等。脂多糖是G-菌细胞壁的组成成分，可诱导细胞产生炎性反应，其中促炎性细胞因子发挥了重要介导作用。IL-6可促进B细胞分化，并活化MAPK，激活STAT转录因子，从而加重炎性反应[20]。KEGG分析富集到156条信号通路，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、甲型流感、IL-17信号通路、TNF信号通路和乙型肝炎，表明柴胡达胸合剂治疗COVID-19多通路的特点。
综上所述，本研究采用网络药理学方法，初步揭示了柴胡达胸合剂可能一方面通过多种黄酮类化合物和β-谷甾醇直接抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性，另一方面通过多成分、多靶点、多通路减少组织细胞凋亡、降低促炎性细胞因子和升高抑炎性细胞因子水平，从而对COVID-19产生治疗作用。
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表 1 3组临床疗效对比[n（%）]
组别 例数 临床控制 显效 有效 无效 总有效率 观察组 34 5（14.71） 19（55.88） 8（23.53） 2（5.88） 94.12 对照1组 34 1（2.94） 11（32.35） 13（38.24） 9（26.47） 73.53 对照2组 34 3（8.82） 12（35.29） 11（32.35） 8（23.53） 76.47 x2/P（观察组vs 对照1组） 5.314/0.021 x2/P（观察组vs 对照2组） 4.221/0.040 x2/P（对照1组vs 对照2组） 0.078/0.779 
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表 2 3组中医证候积分对比（
$ \bar{x} $ ±s，n=34）组别 喉中痰鸣 气粗息涌 咳呛阵作 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 观察组 4.43±0.38 1.37±0.31*#▲ 4.38±0.44 1.12±0.22*#▲ 4.35±0.50 1.09±0.31*#▲ 对照1组 4.49±0.36 1.96±0.42* 4.41±0.47 1.37±0.29* 4.33±0.48 1.48±0.26* 对照2组 4.46±0.37 1.82±0.35* 4.36±0.45 1.31±0.30* 4.39±0.46 1.41±0.29* F 0.223 24.540 0.105 7.809 0.138 17.796 P 0.800 <0.001 0.901 0.001 0.872 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与对照1组比较；▲P<0.05，与对照2组比较。
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表 3 3组炎症因子对比（
$ \bar{x} $ ±s，n=34）指标 时间 观察组 对照1组 对照2组 F P IFN-γ（pg/ml） 治疗前 79.37±5.42 79.85±5.27 79.52±5.34 0.072 0.931 治疗后 136.43±9.19*#▲ 120.72±8.74* 122.48±8.63* 32.112 <0.001 IL-4（ng/L） 治疗前 48.96±4.51 49.13±4.36 49.05±4.27 0.013 0.987 治疗后 24.60±2.42*#▲ 30.55±2.50* 29.63±2.71* 53.094 <0.001 IL-17（pg/ml） 治疗前 13.58±2.60 13.78±2.39 13.91±2.45 0.153 0.859 治疗后 5.96±1.23*#▲ 10.39±1.46* 10.47±1.32* 126.142 <0.001 TGF-β1（ng/ml） 治疗前 25.73±3.18 25.85±3.21 25.90±3.42 0.024 0.976 治疗后 11.81±1.32*#▲ 16.33±2.14* 15.45±1.98* 57.186 <0.001 IgE（IU/ml） 治疗前 218.39±18.72 218.82±19.03 218.62±18.75 0.004 0.996 治疗后 132.56±9.14*#▲ 167.70±12.52* 163.84±11.13* 104.015 <0.001 *P<0.05，与同组治疗前比较；#P<0.05，与对照1组比较；▲P<0.05，与对照2组比较。
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