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损伤部位的机械刺激和局部感染可导致皮肤伤口的异常愈合，甚至导致瘢痕疙瘩的形成[1]。细胞的迁移、生长和增殖在伤口修复过程中起着至关重要的作用, 增生性瘢痕的形成与各类因子表达异常、成纤维细胞的增殖过度、以及胶原的过度沉积等因素密切相关[2-3]。电生理学实验研究表明，生物组织的行为与电荷的流动高度相关[4-6]。
驻极体是一类不需外加电源即能够提供稳定静电场和微电流的功能电介质材料[7]， 其产生的静电场能够加快受创部位微循环，促进成纤维细胞在不同时期生长或凋亡以及促进药物的经皮渗透等作用[8-10]。 5-氟尿嘧啶（5-FU）是最早研发上市的抗癌药，作用于细胞后抑制其 DNA的合成，从而对成纤维细胞生长增殖产生影响，临床上是治疗难治性瘢痕的常用药之一[11]。
该研究将驻极体和 5-FU 联用，通过探索驻极体静电场联合5-FU对分离培养瘢痕成纤维细胞的生长、细胞周期和凋亡的影响，以期在细胞水平研究驻极体静电场以及驻极体联用 5-FU 对瘢痕形成的影响机制，为预防和治疗病理瘢痕提供新的思路。
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Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，体质量为（180±20） g，购自海军军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（沪）2018-0006。
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水合氯醛（中国医药集团化学试剂有限公司）；5-FU（上海生物工程有限公司）；cck-8 试剂盒[东仁化学科技（上海）有限公司]；Hoechst33342（上海如吉生物科技发展有限公司）；引物（武汉擎科创新生物科技有限公司）；细胞培养箱（Thermo公司）；栅控恒压电晕充电系统（ 复旦中学校办厂）；ESR102A 型振动电容静电计（北京华晶汇科技有限公司）；荧光定量 PCR 仪（ABI公司）; 全自动定量酶标仪（Bio-Rad公司）。
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通过栅控恒压电晕充电系统对双裸面聚丙烯（Polypropylene,PP） 膜进行注极，栅压设为+5000 V，充电时间为 5 min，制备得+5000 V 驻极体。驻极体等效表面电位通过表面电位计（ESR102A 型振动电容静电计）测量。
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用 10%的水合氯醛腹腔注射麻醉（4 ml/kg），用实验动物剃毛刀去除大鼠背部毛发， 在大鼠背部用打孔器制造左右对称共 4 个直径为 2 cm 的创面，创面之间间隔一定距离，去除肉膜层，分笼饲养。在创面形成后 4 周产生增生性瘢痕。
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取瘢痕模型大鼠，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉， 用实验动物剃毛刀将大鼠背部毛发去除干净， 酒精棉球擦拭后， 手术剪取下瘢痕皮肤组织，组织用含有青霉素浓度 100 U/ml，链霉素浓度 100 μg/ml 的 PBS 缓冲液反复冲洗 3 次。冲洗后， 用眼科剪将瘢痕皮肤组织剪成组织小块， 组织小块大小在 1~2 mm3 之间。将组织小块置于培养皿中，加入含有 20%胎牛血清的 1640培养基，待细胞长满培养皿，进行细胞传代，待细胞传至 3~8 代，进行后续实验。
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实验分为瘢痕细胞对照组，+5000 V驻极体组，+5000 V驻极体+10 μg/ml 5-FU组，+5000 V驻极体+40 μg/ml 5-FU组，+5000 V驻极体+160 μg/ml 5-FU组。
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取对数生长期的瘢痕皮肤组织成纤维细胞（细胞密度为 1×104/ 孔），接种于96孔培养板中（100 μl/孔） 。待细胞绝大部分贴壁后，更换培养液，按照上述实验分组分别对细胞干预24 h、48 h、72 h，再以 10 μl/孔向各孔中加入 cck-8 试剂溶液， 继续在细胞培养箱中保温 1~4 h，终止培养，震荡摇匀，在全自动定量酶标仪上以 450 nm 波长处测定各孔吸光度， 按照增殖率=（实验孔实测值−空白组平均值）/（对照组平均值−空白组平均值）×100%计算细胞增殖率。
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取瘢痕细胞消化离心后重悬，制成单细胞悬液，按1×104个/孔种植到96孔板中，待细胞绝大部分贴壁后，更换培养基，选取+5000 V驻极体+40 μg/ml 5-FU组对其进行处理，恒温箱培养48 h后，去除培养液，各组均加入含Hoechst 33342（原浓度为10 mg/ml，稀释10000倍）的1640培养液，避光孵育30 min，然后去除培养液，用PBS清洗两次，加入适量PBS，置于荧光显微镜下观察并拍照，每组重复3个样本。荧光定量PCR引物序列表见表1。
表 1 荧光定量 PCR 引物序列表
引物名称 引物序列（5'→3') 片段长度（bp） 退火温度（℃） R-TP53-S GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC 220 60 R-TP53-A GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA 60 R-fas-S AGCGTTCGTGAAACCGACAAC 172 60 R-fas-A AGTGTTTCCTGTCCGTGTACTCC 60 R-fasl-S GCAAATAGCCAACCCCAGCAC 186 60 R-fasl-A ACGAAGTACAACCCAGCCTCA 60 R-BAX-S GGGCCTTTTTGCTACAGGGTTT 284 60 R-BAX-A AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACCAC 60 R-GAPDH-S CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138 60 R-GAPDH-A GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT 60 -
瘢痕细胞在不同浓度5-FU及正极性驻极体和不同浓度5-FU联用干预 24 h、48 h、72 h后增殖率变化情况：在5-FU干预 24 h、48 h、72 h后，在不同浓度5-FU的作用下， 随着 5-FU浓度的增加，瘢痕细胞的增殖率呈下降趋势，且随着时间的增加瘢痕增值下降趋势越明显；正极性驻极体和不同浓度5-FU联用作用于细胞72 h后，细胞增殖率都有所降低。随着 5-FU 浓度的增加， 对照组和各正极性驻极体组瘢痕细胞增殖率呈下降趋势；该变化趋势较5-FU单一作用 72 h组更加明显，具体见表2。
表 2 不同浓度5-FU 及正极性驻极体和不同浓度5-FU联用对瘢痕细胞生长的影响（单位：μg/ml，n=12）
组别 0 10 40 160 24 h组 1.00±0.028 0.99±0.028 0.77±0.027 0.49±0.033 48 h组 1.00±0.024 0.98±0.025 0.65±0.028 0.41±0.028 72 h组 1.00±0.020 0.96±0.033 0.53±0.017 0.21±0.046 +5000 V与5-FU联用72 h组 0.90±0.034 0.47±0.051 0.15±0.051 -
瘢痕细胞各组染色的结果见图1，图中箭头所示亮点为凋亡细胞，较暗的蓝色荧光为正常细胞，图1A右上角方框内为亮点部位放大结果。结果显示：瘢痕细胞对照组基本无细胞凋亡或者极少细胞凋亡； +5000 V驻极体组出现少数细胞凋亡； +5000 V 驻极体与5-FU联用组细胞凋亡数高于 5-FU 组。
图 1 瘢痕细胞的凋亡
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瘢痕成纤维细胞各组凋亡基因 mRNA 的相对表达量见表3。以对照组为 1，比较各实验组mRNA 的表达。结果显示：与对照组相比，5-FU组表达量明显增加， +5000 V 驻极体组4种凋亡基因 mRNA 的相对表达量都有所增加；与5-FU组相比，虽然+5000 V驻极体组相对表达量稍小，但是+5000 V驻极体+5-FU组表达量则显著增大，以上相比较的各组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。
表 3 不同实验组作用于瘢痕成纤维细胞后p53、fas、Bax和fasl mRNA的表达水平（平均值±SD，n=3）
组别 p53 fas Bas fasl 对照组 1.00±0.00 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.03 5-FU组 1.60±0.06 2.23±0.11 1.81±0.13 2.01±0.19 +5000 V 驻极体组 1.30±0.10 1.61±0.21 1.41±0.10 1.50±0.12 +5000 V+5-FU组 1.92±0.14 2.81±0.29 2.20±0.17 2.49±0.21 -
细胞的增殖和凋亡状况能够从细胞层面反应组织的生长状况[12]。实验结果表明：不同浓度的5-FU对瘢痕细胞的生长有不同的抑制作用，随着化学药物浓度的增加，瘢痕细胞的增值率降低更迅速。+5000 V驻极体与5-FU联用，对细胞的增殖有协同抑制作用，正极性驻极体和不同浓度5-FU联用作用于细胞72 h后，细胞增殖率均较5-FU单一作用于瘢痕细胞72 h的细胞增值率有所降低。且随着联合作用组5-FU浓度的增加，其抑制细胞增殖率作用更加明显，经+5000 V驻极体与160 μg/ml 5-FU联用72 h，对瘢痕细胞的抑制率可达0.15±0.051。
细胞凋亡检测实验也表明，由于驻极体静电场的作用，使瘢痕细胞凋亡数量增加，+5000 V驻极体组凋亡细胞增多，+5000 V驻极体与5-FU联用组细胞凋亡数高于5-FU组。p53、Fas、Fasl、Bax 4种基因的表达结果也证明+5000 V 驻极体能够通过一定程度的影响该4种基因的表达来促进细胞凋亡，抑制细胞生长，这与前期凋亡实验结果一致。
正极性驻极体及与5-FU的协同抑制瘢痕细胞生长作用，这可能与细胞膜所带内负外正电荷有关。有研究表明， 细胞表面电荷的分布能够影响细胞生长，驻极体产生的静电场影响了细胞膜表面的电荷分布，进而改变了膜蛋白的生物学功能和细胞膜的泵功能，同时，电场产生的微电流会影响细胞的代谢和基因表达， 从而影响细胞的分裂、增殖[13-15]。正极性驻极体产生的静电场可能通过影响细胞膜表面的电荷量， 使得细胞生长受到抑制，增殖率降低，正极性驻极体与 5-FU 联用，能够增强 5-FU 对两种细胞增殖的抑制作用，起到协同作用。
该研究通过提取大鼠正常皮肤及瘢痕皮肤成纤维细胞，通过细胞学实验，考察了正极性驻极体与 5-FU 及其联用对大鼠瘢痕皮肤成纤维细胞在细胞生长、增殖、以及凋亡等方面的影响， 并结合凋亡基因的检测，探究了正极性驻极体与 5-FU 及其联用抑制增生性瘢痕生长的机制，证实了驻极体与 5-FU 及其联用可能是通过影响细胞的生长状态进而影响增生性瘢痕的生长。展示了正极性驻极体与 5-FU 联用取得的更好的治疗增生性瘢痕的效果，为增生性瘢痕的治疗提供了一个发展的方向。
Synergistic effect of positive electret combined with 5-fluorouracil on growth inhibition of scar fibroblasts
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摘要:
目的 探讨驻极体及5-氟尿嘧啶（5-FU）对瘢痕成纤维细胞生长的影响及其可能的作用机制。 方法 利用全自动酶标仪检测+5000 V驻极体联合不同浓度5-FU对瘢痕成纤维细胞增殖的影响，利用荧光显微镜及RT- PCR技术研究在静电场作用下的瘢痕成纤维细胞的凋亡及p53等凋亡基因mRNA的表达变化。 结果 ①正极性驻极体和不同浓度5-FU联用作用于细胞72 h后，细胞增殖率都有所降低，+5000 V驻极体+160 μg/ml 5-FU组对瘢痕细胞的抑制率达到（0.15±0.051）%。② +5000 V 驻极体组可促进瘢痕成纤维细胞凋亡； +5000 V 驻极体与 5-FU联用组细胞凋亡数高于 5-FU 单一使用组。③ +5000 V 驻极体作用组，4种凋亡基因 mRNA 的相对表达量都有所增加， +5000 V 驻极体与 5-FU 联合作用组4种标志性基因表达量均较 5-FU 组增大。 结论 正极性驻极体与5-FU联合作用对抑制细胞生长有协同作用。正极性驻极体抑制瘢痕细胞生长的机制可能是通过促进细胞凋亡基因的表达，进而影响细胞的生长状态来抑制细胞生长。 Abstract:Objective To investigate the effects and possible mechanism of electret and 5-fluorouracil（5-FU）on the growth of scar fibroblasts. Methods The effect of +5000 V electret combined with different concentrations of 5-FU on the proliferation of scar fibroblasts was detected by automatic enzyme labeling instrument. The apoptosis of scar fibroblasts and the mRNA expression of p53 and other apoptotic genes were studied by fluorescence microscopy and RT-PCR technology under the action of electrostatic field. Results ① After the treatment of positive electret and different concentrations of 5-FU for 72 h, the cell proliferation rate decreased, and the inhibition rate of scar cells in the +5000 V electret+160 μg/ml 5-FU group was (0.15±0.051)%. ②+5000 V electret group could promote the apoptosis of scar fibroblasts; The number of apoptotic cells in +5000 V electret and 5-FU group was higher than that in 5-FU group. ③The mRNA expression levels of four apoptotic genes in the +5000 V electret group were increased, and the expression levels of four signature genes in the +5000 V electret and 5-FU group were increased compared with those in the 5-FU group. Conclusion The combination of positive electret and 5-FU had a synergistic effect on inhibiting cell growth. The mechanism of positive electret inhibiting scar cell growth may be through promoting the expression of apoptosis gene, and then affecting the growth state of cells to inhibit cell growth. -
Key words:
- electrostatic field /
- electret /
- 5-fluorouracil /
- scar fibroblasts
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子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是临床上最为常见的慢性妇科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月经紊乱和不孕为主要的临床表现。EM本质是血瘀证，临床治疗时以活血化瘀为主，常用的药物有桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行等，能够有效缓解患者痛经、非经期盆腔痛等症状[1]。
目前活血化瘀类中药对EM治疗的具体机制不是很清晰，其针对的靶点也不是很明了。网络药理学将生物网络作为研究对象，探究药物、靶点、疾病之间的联系，系统完整地研究药物的机制，可展现出药物对于多个靶点、多个通路不同影响。因为和中医整体观念天然契合，网络药理学现已广泛应用于中药研究中[2-3] 。在本研究中，笔者采用网络药理学的方法探究活血化瘀类中药治疗EM的作用机制，构建“化合物-靶标-通路-疾病”网络，并初步探析何种活血化瘀药在EM治疗中更具优势，为临床用药以及进一步实验研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 活血化瘀类中药确认
根据卫生部“十一五”规划教材《中药学》分类，确认桃仁、红花、泽兰、丹参、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀药为本次主要研究对象。
1.2 中药有效成分以及相关靶点的获取
利用中药化学成分数据库TCMSP平台（http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），检索七味中药所含活性成分。依据数据库指南要求，将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，对活性成分进行筛选[4]。OB值是评价药物能否发挥药效的重要药动学参数，DL值是指化合物与所有已知药物之间的相似程度。上述2个参数是评价中药化学成分吸收、分布、代谢、排泄的关键参数。获得符合OB、DL参数有效活性成分后，利用TCMSP数据库查询各有效活性成分对应相关靶点。利用Venn图工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对药物化学成分以及相关靶点进行共同点分析，寻找活血化瘀中药共有成分和作用靶点。
1.3 EM相关靶点基因确认
利用美国国立生物技术信息中心Gene数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）将所获靶点信息转换成基因名称。查询GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，获得与EM相关基因靶点。最后将每种中药的作用靶点对应的Gene Symbol与EM基因进行比对，获得每种中药可能影响EM的相关基因，利用Cytoscape 3.6.0软件构建化合物－靶点网络[5]。
1.4 构建蛋白互作网络
为进一步研究靶点之间的相互关系，将活血化瘀药共同靶点上传至线上软件 STRING(http://string db.org)，构建蛋白互作网络。物种选择为Homosapiens，minimum required interaction score调整为highest confidence，隐藏网络图中游离节点，获取PPI网络。
1.5 KGEE通路分析
利用KEGG数据库（https://www.keg g.jp/）查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。筛选各中药KEGG通路中相关基因富集情况，并利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图。
2. 结果
2.1 活血化瘀类中药有效成分及对应靶点的获取
按照要求从TCMSP数据库中筛选出各中药有效成分，删除重复项，共有94种有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹参有效活性成分达到65个，而泽兰有效活性成分只有2个。未能发现七味活血化瘀药共同有效成分，但β-谷固醇为川牛膝、红花、桃仁、泽兰所共有，槲皮素为川牛膝、红花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀类中药最多的2种有效成分（supplementary materials table S2）。与此同时，我们找到了七味中药所共有的19个作用靶点（表1），包括孕酮受体（progesterone receptor）、前列腺素G/H合成酶1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡调节剂Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 2）等。
表 1 七种活血化瘀中药共有的19个靶点序号 蛋白名称 基因名称 靶点标识码 1 钠通道蛋白5型亚基 SCN5A TAR00070 2 前列腺素G/H合成酶1 PTGS1 TAR00006 3 Beta-2型肾上腺素受体 ADRB2 TAR00261 4 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3 CHRM3 TAR00016 5 孕酮受体 PGR TAR00209 6 半胱天冬酶3 CASP3 TAR04087 7 热休克蛋白HSP 90 HSP90 TAR00444 8 钾电压门控通道亚家族H成员2 KCNH2 TAR00037 9 凋亡调节剂Bcl-2 BCL2 TAR00086 10 PKA催化亚基C-alpha PRKACA TAR00699 11 半胱天冬酶9 CASP9 TAR04090 12 γ-氨基丁酸受体亚基α-1 GABRA1 TAR00309 13 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 CHRM1 TAR00038 14 前列腺素G/H合酶2 PTGS2 TAR00094 15 转录因子AP-1 JUN,FOS TAR00414 16 磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸3-激酶催化亚基，γ亚型 PIK3CG TAR00491 17 毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2 CHRM2 TAR00210 18 核受体共激活剂2 NCOA2 TAR03276 19 维甲酸受体RXR-alpha RARA TAR00158 2.2 EM相关靶点确认
利用人类基因数据库查找EM作用靶点，与七味中药有效成分对应靶点进行比对，发现红花所含相关靶点数量最多，达到103个；而桃仁、泽兰所含相关靶点数量最少，为14个（图1A）；王不留行所含相关靶点占有效成分作用靶点比例最高，为54.7%；而桃仁最低，为29.8%（图1B）。经过去重处理后，七味中药所含EM相关靶点共119个（supplementary materials table S3）。利用Cytoscape3.6.0软件进行成分－靶点网络分析，获得图2，其中共计216个节点，其中黄色节点为活血化瘀药有效活性成分，而蓝色节点代表EM相关靶点。利用软件自带分析功能，对于网络各节点度值进行分析，网络中某些节点度值较高，提示该节点为网络中的关键节点（supplementary materials table S4）。在各中药所含有效成分中，槲皮素展现出极高的连接度（度值=87），远超其他有效成分，而其余较高连接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黄芩素（度值=23）、丹参酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中药是一个多有效成分的复杂系统，一个有效成分可作用于多个靶点，协同作用于某种疾病的治疗。而在靶点的分析中，较高连接度的靶点可能在EM的治疗作用中起着重要的作用。前列腺素G/H合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素G/H合酶1（PTGS1，度值=39）两者拥有最高的度值，是临床上炎性疾病治疗的主要靶点；核受体辅活化子2（NCOA2，度值=35）、核受体辅活化子1（NCOA1，度值=34)紧跟其后，同样在各炎症通路中作用显著；凝血酶(度值=31）是临床上治疗出血的重要靶点，直接作用于血液凝固过程的最后一环；Mu-type阿片受体（OPRM1，度值=30）则涉及到中枢镇痛功能。上述靶点均和EM症状及病机之间有着密切的关系。
图 1 七味活血化瘀中药EM相关靶点数量及所占比例A.基于OB≥30%和DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点个数；B.基于OB≥30%、DL≥0.18标准，各中药EM相关靶点的比例2.3 PPI网络的构建与分析
利用STRING软件构建靶点PPI网络，图中包含119个节点，505条边，所有节点平均度值为8.49，具体见图3。根据“度值>均值”筛选出PPI网络中关键节点56个（supplementary materials table S6），前9位关键节点，平均度值为88，见表2，与PPI网络74%节点存在相互作用关系，提示它们在网络调控中起着关键作用，可能是活血化瘀药物治疗EM的关键所在。
表 2 PPI网络中关键节点节点名称 度值 节点名称 度值 节点名称 度值 ALB 97 IL6 92 PTGS2 83 AKT1 95 TNF 86 CASP3 80 VEGFA 94 MAPK8 83 MAPK1 80 2.4 KEGG通路分析
利用KEGG数据库查询每种中药针对EM的相关基因，获得相关KEGG通路信息。整理各中药KEGG通路相关基因富集情况，发现七味中药共有信号通路44条（supplementary materials table S5），筛选出与EM密切相关的19条通路（表3）。从表3中，不难发现，19条通路涉及性激素、炎症、细胞调亡以及血管生成等各个方面，其中炎症相关通路达到7条，为所有通路中最多。利用Prism 8.0软件绘制通路靶点富集热图，根据图4可知，在系列通路中，泽兰与桃仁作用均弱于其他五味中药。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路中，多味中药靶点存在高度富集，红花在PI3K-Akt信号通路中显著富集，远超该药其他通路，值得注意。
表 3 七味活血化瘀中药的19条KEGG通路序号 标识码 信号通路名称 类别 1 hsa04151 PI3K-Akt信号通路 炎症相关 2 hsa04668 TNF信号通路 炎症相关 3 hsa04657 IL-17信号通路 炎症相关 4 hsa04625 C型凝集素受体信号通路 炎症相关 5 hsa04064 NF-κB信号通路 炎症相关 6 hsa04115 p53信号通路 炎症相关 7 hsa00590 花生四烯酸代谢 炎症相关 8 hsa01522 内分泌抵抗 激素相关 9 hsa04915 雌激素信号通路 激素相关 10 hsa04919 甲状腺激素信号通路 激素相关 11 hsa04921 催产素信号通路 激素相关 12 hsa04210 细胞凋亡 细胞凋亡 13 hsa04071 鞘脂信号通路 细胞凋亡 14 hsa01521 EGFR酪氨酸激酶抑制剂拮抗 血管相关 15 hsa04370 VEGF信号通路 血管相关 16 hsa01521 血小板活化 血管相关 17 hsa04722 神经营养蛋白信号通路 疼痛相关 18 hsa04725 胆碱能突触 疼痛相关 19 hsa04726 血清素能突触 疼痛相关 3. 讨论
本研究采用网络药理学的研究方法，从TCMSP数据库中提取出了94个符合标准的成分，通过VENE图去重以及分析网络图的拓扑特性后，发现槲皮素为四味活血化瘀药所共有，与83种EM相关靶点存在关联。现代研究表明，槲皮素具有抑制炎症、血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖的作用，通过抗氧化作用诱导细胞凋亡，还可通过雌激素受体，调控受体下游多种底物及信号通路而调节雌激素[6-7]。木犀草素与41种EM靶点相关联，具有抗炎、抗纤维化、抑制血管生成等作用[8]。EM发生发展过程中慢性炎症反应一直贯穿始终，且存在纤维化病变，木犀草素或在EM治疗中有一定作用[9-10]。
通过VENE图，发现七味中药共有作用靶点19个，部分共有靶点与Cytoscape网络图以及PPI网络中关键节点高度对应，进一步强调了该部分共有靶点在EM中的作用。如PTGS2，该靶点所调控环氧合酶（COX-2）的高表达会导致细胞的高增殖性、高侵袭性，诱导血管生成从而加重EM的疼痛和不孕症状[11]。NCOA2、NCOA1的水平异常与EM的进展关联密切。趋化因子参与子宫内膜异位种植过程中趋化、黏附、侵袭、血管形成及细胞生长分化等多个重要环节[12]。Xiu等发现，在分泌期，NCOA1和趋化因子CXCL12在异位子宫内膜中的表达明显高于正常子宫内膜；活化血小板对异位内膜具有促炎、促血管生成的作用，促使异位内膜细胞的侵袭和增殖[13-14]，子宫内膜基质细胞可分泌F2，以密集依赖的方式诱导血小板活化和聚集，从而影响EM的进展[15-16] 。VEGFA可促进新生血管形成并使血管通透性增加，陈晓莉等[17]研究表明，内异症组血清和腹腔液VEGF水平明显高于对照组，且重度患者腹腔液中VEGF水平高于轻度患者，VEGF在EMT患者血管生成中起促进性作用,在血清与腹腔液中的高表达与疾病发生发展相关。尉伟东等[18]发现CASP3蛋白在异位内膜和在位内膜中的评分明显低于正常对照组，caspase-3的水平下降提示内膜细胞活性下降，促使子宫内膜细胞自发性凋亡增加以及凋亡信号敏感性增强，诱导或加重EM。
利用KEGG数据库，找到了七味活血化瘀药共有EM相关通路19条，涉及性激素、炎症、细胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎症通路达到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF三条信号通路是靶点富集最多的通路，提示活血化瘀药主要通过抗炎作用来对EM起治疗作用。与正常女性相比，EM患者的子宫内膜在位和异位内膜细胞的PI3K表达增加，AKT磷酸化水平升高，证实PI3K/AKT信号通路可影响EM进展[19]。EM是一种雌激素依赖性疾病，呈现出慢性炎症反应，多种炎性因子参与其病理过程，包括NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17等[20]。许丽华等[21]通过实验发现，EM患者血清及腹腔液中TNF-α水平显著高于对照组。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，证实了TNF-α与子宫内膜异位症的发生发展密切相关,有助于子宫内膜异位症的诊断。IL-1家族在EM发生发展中作用显著，与正常女性相比，EM患者静脉血中IL-1β浓度显著增高。不仅仅是IL-1β，研究显示，IL-1β前体蛋白（proIL-1β）也可以加重炎症反应，EM患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β水平均高于健康女性。IL-1家族细胞因子的损伤，导致EM患者腹腔免疫机制的紊乱，局部以及全身IL-1β、IL-18调控机制的缺陷，使得内膜组织的侵袭性以及生长性大幅增加，从而导致EM[22-24]。炎症相关通路的高富集也与之前网络图中TNF、IL-6等炎性相关靶点的高度值相对应，进一步强调了活血化瘀药物通过抗炎作用治疗EM的作用机制。细胞凋亡是一种独特的程序性细胞死亡，细胞的有效清除而不会引起炎症反应，EM特征为异位内膜细胞凋亡率下降。与健康女性子宫内膜相比，EM异位内膜抗凋亡因子表达增加，促凋亡因子表达减少，证实了细胞凋亡在EM的发病中确有作用，并和炎症反应存在一定关联[25]。EM发生发展过程中亦伴随着血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM患者异位内膜血管内皮生长因子(VEGF)表达量增高，抗血管生成因子(sFlt-1)表达量下降，证实VEGF信号通路、血小板激活通路均参与此过程，与前面靶点分析也形成呼应[26-27] 。脑源性神经营养因子是各种慢性疾病中慢性疼痛形成和维持的调节因子，EM伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神经营养因子浓度明显高于无疼痛EM患者[28]。利用KEGG通路分析，可以发现活血化瘀药对于炎症、凋亡、疼痛、血管生成等相关通路均具备调控作用，进一步强调了临床上活血化瘀药对于EM的治疗价值。
综上所述，活血化瘀中药可通过多靶点、多通路协同作用方式对EM进行治疗，体现了中医药治疗疾病特色。上述七味中药中，桃仁、泽兰对于EM的作用低于其余活血化瘀药，而红花、益母草在EM治疗体系中，EM相关靶点高于其余中药，可能会起到更好的疗效，在临床上可尝试推广使用。本研究从网络药理学角度出发，根据活血化瘀中药有效成分和作用靶点，在一定程度上对活血化瘀中药治疗EM进行了机制的解析，为指导临床用药提供了一定的依据。但本研究仅仅基于TCMSP数据库，利用计算机软件从理论上对活血化瘀中药治疗EM作用机制做了探析，还需要通过实验和临床实践来进一步证实，而且还需要扩大活血化瘀药物探究范围，结合临床实际，深入剖析活血化瘀药共同点与差异之处。
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表 1 荧光定量 PCR 引物序列表
引物名称 引物序列（5'→3') 片段长度（bp） 退火温度（℃） R-TP53-S GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC 220 60 R-TP53-A GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA 60 R-fas-S AGCGTTCGTGAAACCGACAAC 172 60 R-fas-A AGTGTTTCCTGTCCGTGTACTCC 60 R-fasl-S GCAAATAGCCAACCCCAGCAC 186 60 R-fasl-A ACGAAGTACAACCCAGCCTCA 60 R-BAX-S GGGCCTTTTTGCTACAGGGTTT 284 60 R-BAX-A AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACCAC 60 R-GAPDH-S CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138 60 R-GAPDH-A GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT 60 
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表 2 不同浓度5-FU 及正极性驻极体和不同浓度5-FU联用对瘢痕细胞生长的影响（单位：μg/ml，n=12）
组别 0 10 40 160 24 h组 1.00±0.028 0.99±0.028 0.77±0.027 0.49±0.033 48 h组 1.00±0.024 0.98±0.025 0.65±0.028 0.41±0.028 72 h组 1.00±0.020 0.96±0.033 0.53±0.017 0.21±0.046 +5000 V与5-FU联用72 h组 0.90±0.034 0.47±0.051 0.15±0.051
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表 3 不同实验组作用于瘢痕成纤维细胞后p53、fas、Bax和fasl mRNA的表达水平（平均值±SD，n=3）
组别 p53 fas Bas fasl 对照组 1.00±0.00 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.03 5-FU组 1.60±0.06 2.23±0.11 1.81±0.13 2.01±0.19 +5000 V 驻极体组 1.30±0.10 1.61±0.21 1.41±0.10 1.50±0.12 +5000 V+5-FU组 1.92±0.14 2.81±0.29 2.20±0.17 2.49±0.21
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