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多细胞生物的出现是进化过程的一个里程碑事件，器官大小的精密调控对于多细胞动物的发育和再生过程都非常重要。Hippo 信号通路是多细胞动物体内调节细胞增殖和凋亡的主要信号通路之一，在组织稳态维持和器官大小调控中起着关键作用 [1] 。
Hippo信号通路由一系列蛋白激酶及转录共激活因子组成，可调节细胞增殖和凋亡[2-3]，在胚胎发育和组织器官生长发育中至关重要[4]。以哺乳动物为例，当Hippo信号通路激活的时候，在上游信号输入因子的作用下，MST1/2被磷酸化后与SAV结合，进一步激活LATS1/2以及MOB1A/B，两者结合后将下游的转录辅因子YAP/TAZ磷酸化，随后与14-3-3蛋白结合，最后被降解或隔离在细胞质中，无法进入细胞核进行转录，从而阻止细胞增殖。当Hippo信号通路被阻断或失活时，YAP/TAZ进入细胞核，与TEAD形成功能杂交转录因子，启动促增殖和促生存基因，促进细胞增殖（图1）[5-7]。
图 1 Hippo信号通路模式图
作为转录共激活因子，YAP/TAZ不具有DNA结合域，它们通过与转录因子TEAD1-4相互作用促进下游，如CTGF、CYR61、ANKRD1等靶基因的表达，从而启动YAP/TAZ的促增殖和抗凋亡功能，激活细胞周期和细胞存活基因的转录，促进器官的生长发育[8]。
当Hippo信号通路各组分处于相对平衡状态时，机体可保持正常生理功能，严格控制细胞的增殖与凋亡，进而调控器官的形状与大小。最近研究表明， Hippo 信号通路在心脏、肝脏、肌肉等多种组织器官的发育与再生中发挥重要作用。然而大多数哺乳动物的再生潜力有限，只有少数器官具有一定的再生能力。本文简要概述Hippo信号通路在器官再生中的作用机制，阐明其在器官发育、再生重塑中的作用，总结靶向 Hippo信号通路的小分子及多肽抑制剂，为临床治疗器官损伤等疾病提供理论依据。
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研究表明，Hippo 信号通路通过调节心肌细胞增殖与分化调控心脏大小与功能，维持心脏正常的生长发育 [9-10]。Hippo信号通路的主要效应因子YAP对心脏发育和出生后心肌细胞增殖都很重要。YAP 激活不但可以调控心脏在胚胎期的形态发生与发育[11]，促进新生和成年心肌细胞的增殖[12-14] ，而且可以提高新生小鼠心脏的再生能力[13,15]。
在小鼠心脏干细胞中，早期YAP缺失会引起细胞增殖减少，形成异常薄的心肌，导致心肌发育不良和收缩功能不全 [12]。同理，胎儿心肌细胞中YAP缺失会导致心肌细胞增殖下降和心脏发育不全[8]。YAP过表达可以使得成年哺乳动物的心肌细胞重新进入细胞周期，增强心肌细胞增殖，导致心肌异常增厚和小梁层扩张[11]。YAP的激活刺激了新生儿和成人心肌细胞的增殖，延长心脏再生窗口，增强损伤后的心脏修复能力[13]。
Heallen等[9,15]采用基因敲除的方法敲除胚胎小鼠心脏中的 SAV1、MST1/2 和Lats2，发现心肌细胞数量增加、小梁扩张和心肌增厚，心脏异常增大。Xiang等[16]发现转录因子Tbx20 在成年心肌细胞中过表达可降低 YAP 的磷酸化，激活多种心脏增殖途径，促进心肌细胞增殖和心脏修复并改善心功能。Li等[17]发现出生后特异性的敲除小鼠 α-连环蛋白可提高成年心肌细胞增殖能力。
Tian等 [18]证实MicroRNA簇miR302-367可以有效抑制Hippo通路，促进 YAP入核，诱导成年心肌细胞增殖并促进心脏再生。实验表明基于MicroRNA的治疗方法能够通过心肌细胞增殖，促进哺乳动物心脏修复和再生。Gabisonia及其团队[19]用 miRNA-199a 干扰 Hippo通路，证实使心肌再生并改善了猪心脏的收缩功能，但在这项研究中，心肌细胞失控，导致大多数动物在治疗2个月内死亡。
Li等[20]发现抑菌素M (OSM)是新生儿心脏再生过程中的调控因子，糖蛋白130（GP130）作为OSM的共受体，通过Y357磷酸化激活 YAP 来促进心肌细胞的增殖，改善心肌损伤后再生。该研究表明， GP130是改善心脏损伤、促进心肌再生的潜在治疗靶点。Hara等[21]和Ito等[22]发现新型含氟化合物TT-10（C11H10FN3OS2）可以增强YAP-TEAD活性，进而保护心脏免受缺血性损伤、促进心肌细胞增殖、改善小鼠心肌梗死后的心功能。
Lin等[23]在研究影响YAP有丝分裂活性的因素时发现，VGLL4的乙酰化可调节VGLL4对TEAD1-YAP的拮抗作用，影响新生儿心脏生长。研究表明，VGLL4的K225位点乙酰化降低了新生儿心脏中VGLL4与TEAD的相互作用， TEAD1-YAP相互作用促进心肌生长。通过K225R突变降低VGLL4乙酰化作用，促进TEAD1-VGLL4相互作用，抑制了TEAD1-YAP相互作用，促进TEAD1降解，从而使心肌细胞增殖减少（图2）。
图 2 VGLL4调节心脏生长模型
Hélène Adihou等[24]报道了一种基于VGLL4-TEAD复合物晶体结构设计的高透膜性的蛋白模拟物，该蛋白模拟物4E以转录辅助因子VGLL4的螺旋片段（203–256）为模板进行环化得到。4E与TEAD共晶结构表明其以预期的方式与TEAD结合，从而抑制TEAD-VGLL4相互作用。实验发现Tat标记的拟蛋白(peptide 7)促进人心肌细胞中TEAD靶基因的表达，并促进幼年大鼠心肌细胞中YAP核易位和细胞周期活动，这是心肌细胞增殖所需的重要特征。
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肝的再生能力极强，在正常情况下99%的肝细胞处于G0期，在急性肝损伤或肝大部分切除后肝再生能力出众。研究表明Hippo 信号通路在肝脏发育、再生、肝细胞生长和肝癌发生发展等过程中都发挥了非常重要的作用。
肝细胞增殖受到Hippo通路活性的调控。在肝再生早期Hippo 通路信号受到抑制， YAP 活性增加；当肝再生终止后，MST1/2、LATS1/2 和非磷酸化 YAP 恢复到正常水平。YAP过表达可导致肝细胞增殖增加、肝细胞过度生长和肝癌的发展，肝体积在几周内增加约4倍；在缺乏Yap/Taz的情况下，肝再生严重受损，肝星状细胞的增殖扩张被阻断[25-26]。
Hippo通路上游调控因子MST1/2 、LATS1/2、Nf2和SAV1的急性缺失会导致YAP水平升高，肝细胞增殖，肝质量增加，进而引起肝肿大并可能导致肝癌[27-29]。LATS1/2敲除会导致未成熟的胆管上皮细胞的急速扩增、肝肿大并最终导致小鼠死亡。MST1/2活性调节YAP水平， MST1/2急性失活后YAP蛋白水平升高，敲除MST1/2对对乙酰氨基酚诱导的肝损伤有明显的保护作用 [30]。
Fan等[31]发现使用MST1/2抑制剂XMUMP-1(图3)，可激活下游效应YAP相关蛋白，促进细胞生长；也可以防止MST2过表达引起的细胞死亡，并导致核YAP募集增加，显著改善PHx（70％肝脏部分切除术）后小鼠的肝再生。因此利用XMUMP-1对Hippo信号通路进行调控，可能为肝再生研究和组织修复提供新的治疗选择。
图 3 MST1/2抑制剂和TAZ调节剂的化学结构
Zhou等[32]根据YAP-TEAD相互作用特点，以YAP为模板肽设计了一种环肽(17mer) (图4)，直接靶向TEAD来阻断YAP-TEAD复合物的形成，提示开发YAP-TEAD相互作用抑制剂是一种有前途的抗增殖策略。Liu等[33] 通过筛选发现卟啉类化合物维替泊芬(verteporfin, VP)可以影响YAP的表达，VP能够与YAP选择性结合并改变其构象，抑制YAP-TEAD相互作用，从而抑制下游靶基因转录。VP不仅对 YAP过表达或内源性YAP激活导致的肝过度生长有抑制作用，还对NF2缺失造成的小鼠肝癌也有一定治疗作用。
图 4 17mer环合示意图
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肌肉再生是依赖于干细胞并涉及几个步骤的复杂过程，肌肉组织再生主要通过肌肉干细胞的自我更新来实现[34]。研究发现，Hippo信号通路可以促进骨骼肌肉卫星细胞和成肌细胞增殖，调控成肌细胞分化，并促进骨骼肌蛋白合成。
骨骼肌的形成受到肌形成调节因子的精密调控。成肌细胞决定蛋白D (MyoD)是重要的生肌决定因子，成肌细胞决定蛋白G(MyoG)控制成肌细胞分化形成肌纤维。在YAP敲除的小鼠中，YAP的靶基因CTGF、ANKRD1均下调，肌肉蛋白合成速率下降，肌肉比重明显下降，小鼠的肌纤维变细[35]。YAP/TAZ表达增加可以使骨骼肌蛋白合成增加，促进肌肉卫星细胞和成肌细胞增殖；过表达YAP会明显地抑制成肌细胞的分化，而肌纤维面积变大，小鼠体重增加[36]。在成肌细胞中TAZ通过与TEAD4相互作用发挥作用，单独敲除TEAD4可显著降低MyoD的表达，导致肌管变短变薄[37]。
Park等[35]发现使用新型TAZ调节剂 TM-53和TM-54(图3)，可增加TAZ核定位，促进MyoD诱导的肌源性基因表达，从而增强成肌细胞的分化。此外，TM-53和TM-54还能减轻损伤后小鼠体外肌纤维损伤，显著增强肌肉再生，改善肌肉活性并提高小鼠的运动能力，提示TM-53和TM-54在治疗肌肉功能障碍方面具有一定作用。
Feng等[38]研究表明，VGLL4在不同阶段以YAP依赖或者不依赖的方式调控肌肉再生。肌肉干细胞中特异性地敲除VGLL4能够显著促进其增殖，抑制分化，导致肌肉卫星细胞增殖增加，成肌细胞分化受损，最终使得肌肉再生过程延迟。在肌肉再生早期，失活VGLL4可以使YAP-TEAD4复合物稳定存在，促进成肌细胞增殖。在肌肉再生后期，VGLL4作为MyoD的共激活剂，通过稳定MyoD-TEAD4的相互作用，在促进肌肉干细胞分化启动过程中发挥重要作用(图5)。研究发现VGLL4是一种调控分化阶段肌肉再生的新型激动剂，这为研究VGLL4对肌肉再生作用提供了新的思路并打开新的治疗前景。
图 5 VGLL4调节成肌细胞增殖和分化的模型
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皮肤是保护机体免受外部损伤的最大器官，通过基底膜分为表皮层及真皮层。表皮通过不断更新来维持皮肤的动态平衡，表皮组织的自我更新和伤口愈合主要依赖于表皮干细胞[39]。
YAP主要分布于皮肤基底细胞的细胞核中，是表皮干细胞增殖和组织扩张的关键调节剂，对表皮稳态的维持和伤口愈合都特别重要[40-41]。在小鼠皮肤表皮干细胞中，敲除YAP会导致严重的表皮发育不全，小鼠的表皮变薄，角质层减少，导致表皮组织形成不足，无法维持表皮形态[42]。在成年小鼠皮肤中缺失YAP和TAZ可轻微影响基底层细胞的增殖，并引起毛发脱落[41]。相反，Sav1突变体中YAP的过度激活导致基底干细胞过度增殖，从而导致皮肤增厚，皮肤过度增生并伴有不成熟分化，最终导致鳞状细胞癌[43]。
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综上所述，Hippo 信号通路与人类组织器官大小调控与再生密切相关。近年来，关于Hippo 信号通路在器官再生过程中的作用机制研究取得了一些进展，同时也确认了一些影响Hippo信号通路的相关靶点，但是人们对 Hippo 信号通路的认识还不够完善，比如需进一步探究如何精细调节 Hippo 通路信号及影响因子等。另外，Hippo 信号通路与其他信号通路在调控器官再生相关机制中既有交叉又有重合，将来的研究需要考虑这些信号通路的参与所带来的干扰。
近期研究发现了很多潜在化合物能够调节Hippo信号通路的活性，但是大部分药物的研究局限于动物试验阶段，进入临床试验的药物比较少。同时也产生了很多新的问题，很多药物的作用靶点缺乏特异性，可能会带来其他不良反应，因此有必要进行进一步的研究。
Research progress on the mechanism of Hippo signaling pathway in organ regeneration
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摘要: Hippo 信号通路是多细胞动物体内调节细胞增殖和凋亡的主要信号通路之一，在组织稳态维持和器官生长调控中都发挥着非常重要的功能。大多数哺乳动物的再生潜力有限，近年来研究表明 Hippo 信号通路在多种组织器官的再生中至关重要。该综述主要介绍Hippo信号通路在器官再生中的作用以及相关靶点和抑制剂的研究进展，分析Hippo信号通路促进再生的机制，为器官再生相关疾病的治疗提供理论参考。
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关键词:
- Hippo 信号通路 /
- 器官再生 /
- 靶点 /
- 抑制剂
Abstract: Hippo signal pathway is one of the main signal pathways regulating cell proliferation and apoptosis in multicellular animals, which plays a vital role in the maintenance of tissue homeostasis and the regulation of organ growth. Most mammals have limited regenerative potential, and recent studies have shown that Hippo signal pathway is critical in the regeneration of various tissues and organs. The role of Hippo signaling pathway in organ regeneration and the research progress of related targets were introduced, the mechanism of Hippo signaling pathway promoting regeneration analyzes were aralyzed in this review, which provide theoretical reference for the treatment of diseases related to organ regeneration.-
Key words:
- Hippo signaling pathway /
- organ regeneration /
- target /
- inhibitor
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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