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性腺功能减退症是一种由多种原因引起的睾酮水平低于健康青年男子正常范围的疾病，临床症状为焦躁不安、健忘出汗、性功能减退等。从流行病学分析，该病在肥胖和糖尿病人群中发病较多；其次，多发病于中老年男性患者，也称迟发性性腺功能减退症（LOH）[1]。目前，西医治疗男性肥胖和LOH多以外源性和内源性补充睾酮为主，治疗手法单一，且存在诸多的争议。例如，在临床中，对于 LOH症状中失眠、潮热、健忘、注意力不集中等精神心理症状，单纯用睾酮补充治疗（TST），症状改善不显著[2-5]。中医治疗则根据患者在TST过程中所表现的不同证候采用不同的治疗方法，如心功能不全患者以补肾为主，情志精神患者以疏肝为主，生理体能欠佳者以健脾、补益为主等不同的治疗方法[5]。
杞贞滋阴合剂（沪药制备字Z20210006000），是上海市著名中医周智恒教授的经验方。该方中，君药是熟地黄、黄芪，起滋阴补肾、益气培元之功效；臣药是枸杞子、女贞子、山茱萸，起补肾、涩精、固肾之功效；佐药为沙苑子、当归，起益精养血之功效；锁阳阳中求阴为使药。全方共奏滋阴补肾、益气生精之功效。前期临床实验证明，杞贞滋阴合剂可以有效改善LOH患者体能不济、血管舒缩和睾酮水平低下等症状[6-7]。
网络药理学是通过“药物-基因-靶点-疾病”相互作用网络，预测药物作用机制的学科[8]。分子对接是通过受体和药物分子之间的相互作用来进行药物设计的方法。本研究通过网络药理学和分子对接技术，对杞贞滋阴合剂的作用机制进行研究，以期为该制剂的后期开发提供技术支持和理论依据。
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在中药综合数据库（TCMID）[9]、中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP） [10]、药物成分靶标数据库（HIT） [11]和文献中检索杞贞滋阴合剂的相关化学成分，再在TCMID，TCMSP，HIT，STITCH数据库中查找有效活性成分的靶点，取STITCH数据库中化合物靶标关联度400以上的靶标[12]，并使用NCBI数据库中的基因模块对生物靶标信息进行标准化，建立相关的化学成分靶标数据库。
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将化合物的物理化学特征与上市药物特征进行比较，采用Bickerton等提出的有效的类药性评估指标（quantitative estimate of druglikeness，QED）评估化学成分的类药性[13]。
$$ {\mathrm{QED}} = \exp \left(\frac{1}{n}\sum\nolimits_{i = 1}^n {\ln {d_i}} \right) $$ 参考DRUGBANK上市药物QED值，选择0.3为阈值筛选化合物。
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采用基于二项分布的富集评分算法来筛选核心方的作用靶标[14]。
$$ {P_i}(X \geqslant k) = {\sum\limits_{m = k}^n {C_n^m\left( p \right)} ^m}{\left( {1 - p} \right)^{n - m}} $$ 当P<0.01时，表明该靶标基因被至少k个活性化合物同时作用是小概率事件，则该靶标基因是核心方的主要作用靶标基因，并将含有主要作用靶标基因的化合物作为主要作用化合物。
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在GENECARD数据库[15]的Malacard模块中查找“性腺功能减退症”的靶点数据，以得分双倍中位数为筛选条件，在DisGeNet数据库查找“性腺功能减退症疾病”的靶点数据。合并以上两个数据库的筛选结果，并删除重复靶标。最后，使用韦恩图确定杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的主要靶标，并使用STRING数据库进行蛋白PPI网络分析。
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将得到的97个疾病靶标进行富集分析，其中，通路信息来自KEGG通路数据库[16]，基因本体GO富集分析信息数据来源于Gene Ontology数据库，再应用超几何分布模型评估靶标基因群是否与特定的GO及生物通路显著关联：
$$ P = 1 - \sum\limits_{i = 0}^{k - 1} {\frac{{\left( \begin{gathered} M \\ i \\ \end{gathered} \right)\left( \begin{gathered} N - M \\ n - i \\ \end{gathered} \right)}}{{\left( \begin{gathered} N \\ n \\ \end{gathered} \right)}}} $$ 经过错误发现率（False discovery rate, FDR） [17]法调整的P值，反映了杞贞滋阴合剂靶标或者疾病靶标与通路或GO的关联强度，本项目经调整后的P值，以小于0.01认为关联显著。
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利用Cytoscape软件的插件评估筛选核心靶标，组成核心网络，评估杞贞滋阴合剂疾病KEGG关联条目的关系。所有图片中形状大小、颜色深浅均以度值排序。
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取度值较高的核心靶点，导入PDB（
https://www.pdbus.org/ ），筛选条件以X-RAY下Resolution值小为首选标准，下载PDB文件，使用PYMOL软件，去水、去配体后备用；从PubChem数据库下载活性成分，运用AutoDock-Tools软件对受体蛋白及配体进行加氢、平衡电荷等操作后，对处理好的活性化合物与靶蛋白进行对接，并进行能量计算，最终运用PYMOL软件进行绘图。 -
通过TCMSP、TCMID、HIT数据库和文献检索获得495个活性化合物；然后在STITCH数据库中，筛选靶标关联度400以上的靶标，获得靶标7627个；再通过类药性分析，共得到246个满足类药性成分的化合物；并使用二项分布算法筛选核心方的作用靶标，筛选得到701个成分靶标和213个主要作用化合物。
通过GENECARD数据库筛选到1051个相关靶标，通过DisGeNet数据库筛选到305个相关靶标，合并删除重复疾病靶标后，共获得1085个与性腺功能减退症相关的疾病靶标基因。结合杞贞滋阴合剂的701个成分靶标，使用韦恩图确定杞贞滋阴合剂的96个疾病靶标和148种活性化合物，见表1。
表 1 杞贞滋阴合剂的主要有效活性成分
化合物 编码 化合物来源 QED 丁香酚 MOL000254 TCMSP 0.7 香草酸 MOL000114 TCMSP 0.7 异细辛醚 CID:636750 PUBCHEM 0.7 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 MOL001752 TCMSP 0.7 反式阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72 阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72 异丁香酚(正+反) MOL000206 TCMSP 0.73 芹菜素 MOL000008 TCMSP 0.74 DL-丁香树脂酚 MOL000396 TCMSP 0.74 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 MOL002850 TCMSP 0.75 丁香酚甲基醚 MOL000207 TCMSP 0.81 大豆异黄酮 MOL000390 TCMSP 0.82 黄豆黄素 MOL008400 TCMSP 0.83 刺芒柄花素 MOL000392 TCMSP 0.85 毛蕊异黄酮 MOL000417 TCMSP 0.89 槲皮素 MOL000098 TCMSP 0.51 木犀草素 MOL000006 TCMSP 0.6 山柰酚l MOL000422 TCMSP 0.64 注：表中PUBCHEM为通过文献检索杞贞滋阴合剂查阅到的相关化合物。 -
利用Cytoscape软件，以杞贞滋阴合剂的96个疾病靶标和148种活性化合物，建立“药物-成分-靶点”网络图，其中，度值较高的化合物有棕榈油、乙醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、果糖、硬脂酸等，见图1。
图 1 “药物-成分-靶点”网络图
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通过STRING数据库进行蛋白PPI网络分析，并利用Cytoscape软件，以疾病为靶标进行蛋白PPI网络分析，图中共有96个节点，1132条边，其中，度值排名前10的靶标是血清白蛋白（ALB）、INS、阿黑皮素原（POMC）、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6、FOS、ESR1，见图2。
图 2 杞贞滋阴合剂疾病靶标蛋白PPI网络图
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对杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的靶标基因进行GO富集分析，以P值小于0.01为关联显著,以此进行筛选，生物过程（BP）有1792条、细胞组件（CC）有31条、分子功能（MF）有79条，并取P值前15条的BP、CC、MF分别制得条形图。其中，MF主要集中在受体激动剂活性、激素活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、G蛋白偶联受体结合等；CC主要集中在分泌颗粒腔、细胞质膜结合囊泡腔、囊泡腔、内质网内腔等；BP主要集中在对肽类激素的反应、多细胞生物稳态、对营养水平的反应等，见图3。
图 3 疾病靶点GO富集分析（前10）
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对杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的靶标基因进行GO富集分析，以P值小于0.01为关联显著,并以此进行筛选，结果KEGG信号通路的富集分析报告中，复方靶标与性腺功能减退症相关的有132条信号通路，取P值前15条信号通路，制得气泡图和核心网络与前15条通路的关系图见图4。
图 4 疾病靶点KEGG富集分析图
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根据“药物-成分-靶点”网络分析得到排名前17的核心活性成分，剔除其中成药性较差的，例如，乙醇、棕榈油、果糖、硬脂酸等，最后选取槲皮素、山柰酚、木犀草素作为核心活性成分；从度值排名前8的核心靶点中，剔除与槲皮素、山柰酚、木犀草素无密切度的ALB和POMC，最后选取INS、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6六个靶点进行分子对接。其中，对接得分（kcal/mol值）绝对值>4.25代表结合活性一般，绝对值>5.0代表结合活性较好，绝对值>7.0代表结合活性较强[18]。由结果可知，主要核心靶点与核心化合物的结合值都超过了5.0，核心靶点TNF 和LEP的结合值整体高于其他靶点，其中，LEP 与山柰酚的结合力较强，见表2、图5。
表 2 成分与核心靶点分子对接结果
成分 靶点名称 PDB ID kcal/mol 槲皮素 INS 5HQI −5.3 TNF 1QTN −6.8 IL-6 YNXZ −6.3 LEP 1ax8 −6.5 IGF1 1imx −6.0 AKT1 1unq −6.2 山柰酚 INS 5HQI −5.2 TNF 1QTN −7.2 IL-6 YNXZ −6.4 LEP 1ax8 −7.2 IGF1 1imx −5.9 AKT1 1unq −6.1 木犀草素 INS 5HQI −5.4 TNF 1QTN −6.8 IL-6 YNXZ −6.4 LEP 1ax8 −7.0 IGF1 1imx −5.9 AKT1 1unq −6.4 
图 5 部分蛋白和活性成分分子对接图
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睾酮已被证明是维持代谢稳态的关键调节因子。现代研究证明，睾酮与胰岛素抵抗、血脂异常、炎症细胞因子合成增加等因素密切相关[19-23]。因此，临床治疗LOH除了补充睾酮，多以控制体重、改善胰岛素抵抗的方法达到改善患者的血清睾酮水平和性功能的目的。
本次研究，通过TCMSP、TCMID、HIT等数据库搜索，并进行类药性分析和二项分布算法筛选，共得到701个成分靶标和213个主要作用化合物，再通过建立“药物-成分-靶点”网络图，发现其中与疾病关联性较强的化合物是槲皮素、山柰酚、木犀草素等，主要作用的疾病靶点是AKT1、IL-6、IGF1、LEP等。有研究表明，槲皮素可刺激cAMP依赖性急性调节（Star）启动子的激活，增加Leydig细胞生成睾酮[24]；山柰酚可以改善雄性小鼠生殖器官重量、精子质量，减少睾丸组织损伤[25]；木犀草素能激活Star蛋白的表达，进而增加睾酮的产生[26]。又有研究表明，IL-6炎症细胞因子被释放到血液中，可能抑制Leydig细胞的发育[27]；AKT1蛋白可通过磷酸化，进而调节哺乳动物的睾丸功能，而IGF1可刺激多种AKT1的活性[28]；LEP可通过下丘脑PI3K/AKT通路刺激GnRH合成与释放，从而影响血清睾酮水平[29]。
通过KEGG富集分析共得到132条通路，并筛选出P值排名前15的通路，包括FOXO通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1通路等。其中，缺氧诱导因子-1（HIF1）是参与细胞缺氧反应的关键转录因子，并且在Leydig细胞中稳定表达，而Leydig细胞生成睾酮是雄性睾酮的主要来源，当HIF1上调时，睾酮水平显著降低[30]。在FOXO通路中，STAT3、IL-6、AKT1、IGF-1广泛参与了FOXO的激活，FOXO蛋白作为核转录因子，可以促进胰岛素或IGF-1在哺乳动物细胞的增殖[31]。
综上所述，杞贞滋阴合剂治疗LOH的主要活性成分和作用靶点主要涉及Leydig细胞睾酮合成酶表达和改善胰岛素抵抗。其中，Leydig睾丸间质细胞的功能和数量下降导致的雄激素缺乏是LOH的主要核心机制[32]。有研究表明，胰岛素可通过刺激下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）的产生和分泌，进而刺激黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的生物合成，而LH和FSH是睾丸功能的重要激素调节因子[33]。中医将糖尿病前期归于“消渴” 等范畴。《金匮要略》中消渴病篇提到：“男子消渴，小便反多，以饮一斗，小便一斗，肾气丸主之。”肾阳不足，则无力蒸腾气化水液[34]，而杞贞滋阴合剂的创始者周智恒教授认为LOH的病因正是肾气衰、真水枯竭，该方正是有滋阴补肾、益气生精之功效[6]。众所周知，胰岛素抵抗正是糖尿病的病理基础。由上可见，杞贞滋阴合剂的中医治疗LOH的理论和胰岛素抵抗的中医治疗理论相一致，也为本研究指出的杞贞滋阴合剂治疗LOH多涉及改善胰岛素抵抗提供了理论依据。本研究为杞贞滋阴合剂治疗性腺机能减退症探索了新的防治思路，但由于数据统计来自于多平台的数据收录和总结，结果还需后续实验研究做进一步的验证，从而完善杞贞滋阴合剂治疗LOH的作用机制。
Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking
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摘要:
目的 应用网络药理学研究杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP） 、中药综合数据库（TCMID）、药物成分靶标数据库（HIT）获取杞贞滋阴合剂的化学成分，从蛋白质-化学相互作用网络数据库（STITCH）中收集候选化合物的相关靶点。利用 GeneCards和DisGeNet数据库对性腺功能减退症的疾病基因进行映射，获得杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的潜在靶点。通过蛋白互作平台数据库（STRING）构建作用靶点之间的互作关系（PPI），将其导入 Cytoscap 软件构建 PPI 网络图。最后，通过对靶点基因进行GO、KEGG富集分析和分子对接，分析杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。 结果 共获得148种疾病与药物交集化合物、96个疾病与药物交集靶点、1085个疾病靶点；其中，与疾病相关的成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素等；通过GO富集分析共得到生物过程（BP）1792条、细胞组成（CC）31条、分子功能（MF）79条；通过KEGG富集分析得到FOXO通路、前列腺癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1通路等；通过分子对接显示，LEP与山柰酚的结合力最好也最稳定。 结论 杞贞滋阴合剂的活性成分可能是通过改善胰岛素抵抗和Leydig细胞睾酮合成酶表达来发挥治疗性腺功能减退症的作用。 Abstract:Objective To investigate the mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism by using the network pharmacology approach. Methods The active components of Qizhenziyin mixture were obtained by searching TCMSP , TCMID and HIT databases.The related targets of candidate compounds were obtained by searching STITCH databases. The potential targets of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism were obtained by mapping the disease genes of hypogonadism with Genecards and DisGeNet databases. The protein interaction platform database (STRING) was used to construct the interaction relationship between action targets. The target protein interaction （PPI） network was constructed by introducing Cytoscape software. The mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism was explained through the enrichment analysis of GO, KEGG and molecular docking technology. Results A total of 148 drug-disease chemical compounds, 96 drug-disease intersection targets, 1085 disease targets were obtained; the components for treating diseases are: quercetin, kaempferol, luteolin, etc; enrichment analysis of GO revealed 1792 biological processes （BP）, 31 cellular components (CC) and 79 molecular functions (MF); the results of KEGG pathway enrichment analysis indicated such as FOXO signaling pathway, prostate cancer, AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications, HIF-1 signaling pathway, etc.The results of molecular docking showed that kaempferol and LEP had the best and stable binding energy. Conclusion The active components of Qizhenziyin mixture may play a role of the treatment of hypogonadism by improving insulin resistance and the expression of testosterone synthetase of Leydig cells. -
Key words:
- Qizhenziyin mixture /
- hypogonadism /
- network pharmacology /
- molecular docking
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皮肤是人体最大的器官，日常生活中难免受到损伤形成伤口，如轻微的皮肤擦伤、割伤和烧伤等。对于日常的小伤口，一般可以任其自愈，但若稍不注意沾水或接触外界细菌，则容易造成感染，影响伤口愈合，甚至造成溃烂。我们常用的创面处理方法有：使用创可贴覆盖；双氧水或碘伏消毒处理；纱布包扎等。这些处理方法存在着防水透气性差、撕除时疼痛和使用不便等问题。20世纪60年代，Winter博士的研究证实了湿润的伤口环境有助于上皮组织更快的形成，并以此为依据提出了“湿性愈合”的概念[1]。这一研究提高了人们对伤口护理的认识，也为研发封闭敷料奠定了基础。由于传统的敷料不能在伤口处使用较长时间，也不能为伤口愈合提供一个湿润的环境，因此，各种高科技的湿性疗法的伤口护理产品层出不穷。在日本及美国等发达国家，出现以硝化纤维为主要材料的新型创伤敷料[2-4]，可用于密封小型伤口甚至保护烧伤创面。此类创伤敷料在使用前为液体形态，涂抹在伤口后有机溶剂迅速挥发，短时间覆盖伤口形成保护膜，具有防水、杀菌、预防伤口感染等优点[5-7]。本研究拟以市售小林液体创可贴为基础，以硝化纤维为膜材，优化处方，制备一种性能更为优良的液体创伤敷料。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Shimadzu HS-20气相色谱仪（日本Shimadzu公司）；拉力试验机（上海和晟仪器有限公司）；AL204型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；D2400型纯水/超纯水一体机（美国明澈公司）；25型无极调速电动搅拌机（江苏江阴科技器械厂）。
1.2 试药
小林液体创可贴（日本小林制药株式会社）；硝化纤维（衡水东方化工有限公司）；蓖麻油、樟脑、苯甲醇、乙酸丁酯、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（均为国药集团化学试剂有限公司）；棕榈酸异丙酯（IPP，青岛优索化学科技有限公司）；乙酸乙酯（上海联试试剂有限公司）。
2. 方法与结果
2.1 市售产品小林液体创可贴中苯甲醇含量及溶剂组成的测定
2.1.1 苯甲醇的含量测定
采用高效液相色谱法测定，色谱条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱：ODS-C18色谱柱；流动相：甲醇-水（50∶50 V/V）；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：40 ℃；检测波长：257 nm。
标准曲线的绘制：精密称定苯甲醇对照品151.3 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度；精密量取上述溶液1、2、2.5、3、4 ml于25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定244.3 mg市售产品于50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，苯甲醇对照品及市售产品均在5.87 min附近有峰且峰型良好。标准曲线回归方程为：Y = 13040X + 212.7 (r=0.999)；经计算得市售产品苯甲醇的使用量为4.0%。
2.1.2 溶剂组成的测定
采用气相色谱法测定，色谱条件：采用 HS-20气相色谱仪；色谱柱：DB-624毛细管柱；载气：H2 50 ml/min；空气450 ml/min；进样量：1 μl；柱温：40 ℃/min持续3 min，10 ℃程序升温至200 ℃，持续1 min；检测器温度：250 ℃；气化室温度：220 ℃；FID检测器。
标准曲线的绘制：精密称定异丙醇1.0077 g，乙酸乙酯0.9933 g，乙酸丁酯1.0014 g于100 ml容量瓶中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合均匀，用DMF稀释至刻度。分别取上述溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 ml置于25 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定1.186 0 g市售产品于100 ml容量品中，加入适量的DMF超声溶解，用DMF稀释至刻度，精密量取1 ml上述液体于10 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，异丙醇对照品及市售产品均在6.84 min附近有峰且峰型良好，乙酸乙酯对照品及市售产品均在9.25 min附近有峰且峰型良好，乙酸丁酯对照品及市售产品均在14.07 min附近有峰且峰型良好；苯甲醇标准曲线、乙酸乙酯标准曲线和乙酸丁酯标准曲线的回归方程分别为：
Y = 20152X + 2.692， r=1.000
Y = 15311X + 33.45 ，r=0.999
Y = 24428X – 17.33， r=0.999
经计算得市售产品中异丙醇的使用量为35.1%，乙酸乙酯的使用量为21.4%，乙酸丁酯的使用量为5.3%。即三者使用比例为：6.6∶4∶1。
2.2 液体创伤敷料及敷料薄膜的制备
2.2.1 液体创伤敷料的制备方法
采用硝化纤维（4%~8%）作为成膜材料，蓖麻油（1%~9%）为增塑剂，苯甲醇（4%）为抑菌剂，棕榈酸异丙酯（IPP，2%）为皮肤柔润剂，樟脑（0.3%）为芳香剂，以异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯（三者比例为6.6∶4∶1）作为溶剂制备创伤敷料。制备方法如下：于50 ml烧杯中精密称定处方量蓖麻油、苯甲醇、IPP、樟脑，加入上述3种混合溶剂使混合均匀，加入处方量硝化纤维，密封静置过夜待硝化纤维充分溶解，过夜后搅拌使硝化纤维混合均匀，超声除气泡即得。
2.2.2 敷料薄膜的制备方法
精密称定2 g按“2.2.1”项制备的液体创伤敷料，加入20 ml乙酸乙酯稀释使之混合均匀、黏度下降并充分溶解。将此液体置于90 mm培养皿中待溶剂挥干后可见均一透明无色薄膜。所制薄膜外观如图1所示。
2.3 评价指标的确立
按照中华人民共和国医药行业标准YY/T 0471-2004对直接接触类创伤敷料，进行舒适性、防水性、透气性的考察。舒适性考察主要为考察敷料薄膜的抗张强度及断点伸长百分率[8-9]；防水性考察薄膜的防水能力；透气性考察薄膜的水蒸气透过率（MVTR）[10]。抗张强度及断点伸长百分率的考察运用拉伸试验机，并采用公式1、公式2进行计算；防水性的考察采用倒杯法，记录24 h后的重量差异，如图2所示，以公式3进行计算；MVTR的考察方法：在西林瓶中加入蒸馏水，用薄膜覆盖密封，使水液面距薄膜（5±1）mm，置干燥器中，记录24 h后的重量差异，以公式4进行计算。
$$ {\text{抗张强度}}= {\rm{F}}/{\rm{S}}\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\;\;\;\;\; $$ (1) $$ {\text{断点伸长百分率}} = {{\rm{L}}_{{\rm{max}}}}/{{\rm{L}}_{\rm{o}}} \times 100 {\text%} $$ (2) $$ {\text{水分损失率}}= \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/{{\rm{M}}_{\rm{W}}}\quad\;\;\; $$ (3) $$ {\text{水蒸气透过率}} = \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/\left( {{\rm{s}} \times t} \right) $$ (4) 式中，F为拉伸力；S为薄膜面积；Lmax为拉伸最大距离；L0为初始膜长；M0为初始西林瓶重量；M24h为24 h后西林瓶重量；MW为西林瓶内水重量；s为瓶口面积；t为时间24 h。
2.4 硝化纤维用量的考察
分别采用4%、6%、8%的硝化纤维制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，其断点伸长百分率、防水性能考察的水透过率及MVTR值随着硝化纤维用量的增加呈下降趋势，抗张强度随着硝化纤维用量的增加呈上升趋势。其考察结果如图3~图6所示：
由图3、图4可知，硝化纤维的用量为4%、6%时，断点伸长百分率在170%以上，可认为薄膜韧性较好，在伤口表面有较好的舒适性，而硝化纤维用量为8%时，其断点伸长百分率较低，不足150%；在硝化纤维用量为4%时，所制薄膜过薄，导致其抗张强度较差，不及2.0 MPa。从图5可知，MVTR值在0.3~0.6 mg/(cm2·h)之间，随硝化纤维用量增加而减小，但均具有一定的透气性；由图6可知，三个不同梯度的硝化纤维在24 h内其水损失率均在2.5%以下，可认为防水性良好。综上考察结果，本次采用的硝化纤维用量为6%。
2.5 蓖麻油用量的考察
确定硝化纤维使用量为6%后，分别采用1%、5%、9%用量的蓖麻油制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，由图7、图8可知，其断点伸长百分率随蓖麻油用量增加呈上升趋势，在蓖麻油使用量为1%时断点伸长百分率较差，不及150%，在5%~9%上升趋势明显且在蓖麻油用量为9%时达到190%，断点伸长百分率值数据较为理想；抗张强度随蓖麻油用量未呈明显下降趋势，反而是在蓖麻油使用量为5%时具有最大的抗张强度，而伸长率较好的9%用量蓖麻油处方抗张强度明显较小，在2.5 MPa左右，故蓖麻油用量选用浓度为5%。
关于蓖麻油对防水性能和透气性能的影响如图9、图10所示，蓖麻油用量为1%时其MVTR值明显高于5%和9%时，且其水损失率也高于5%和9%时，由于5%与9%的防水性没有太大的差异。由此可以得出的结论是，随着蓖麻油的加入，创伤敷料的透气性变差，同时其防水性能却有所增强，1%用量蓖麻油透气性能极佳，但机械性能及防水性相对较差，又因其水损失率24 h也没有达到5%，也可以认为其防水性能良好。所以下一步的考察尽量满足透气性的需求。
综合断点伸长百分率、抗张强度、MVTR值、水损失率，在保证机械强度的同时尽量满足其透气性的要求。拟在1%~5%之间再另设梯度进行考察。拟定蓖麻油使用量为2%、3%、4%时对上述指标再行考察。
由图11、图12可知处方断点伸长百分率及抗张强度在1%~5%范围内随蓖麻油用量的增加总体上均有一定的上升趋势。断点伸长百分率在蓖麻油用量为1%、2%时相差不大，在2%~5%时有明显的上升趋势；抗张强度在蓖麻油用量1%、2%时和4%、5%时相差不大，在蓖麻油用量从2%~4%时有明显的上升趋势。
由图13、图14可知在蓖麻油用量为1%~5%范围内MVTR值及水损失率随处方中蓖麻油用量的增加而呈下降趋势。
综合以上几个因素对处方中的蓖麻油用量进行考察，从所制薄膜的机械性能来看，在蓖麻油用量为1%~3%时，断点伸长百分率不及160%，抗张强度较差，不及3.60 MPa，故此用量不予考虑，从所制薄膜的防水透气效果来看，4%、5%用量均有一定的透气效果，且防水性测试结果显示二者水损失率均不超过2.50%。综上考虑，确定蓖麻油的使用量为4%。
3. 讨论
本文对市售产品的抑菌剂含量及溶剂组成进行了分析，以此作为基础对自制的液体创伤敷料进行单因素考察，确定了硝化纤维的最终用量为6%，蓖麻油的使用量为4%，所成薄膜具有良好的机械性能，具有透气性的同时又有着良好的防水效果。硝化纤维为主要的成膜材料，其用量对几个评价指标均有影响，其主要原因是其使用量的不同可造成所成薄膜的厚度不同，即创伤敷料薄膜厚度与硝化纤维用量成正比，其膜的厚度必然影响各项指标性能。蓖麻油作为增塑剂，对处方的影响主要在于：蓖麻油的加入能改变硝化纤维聚合物链之间的结构，使链与链之间的作用力产生变化从而在一定程度上影响薄膜的塑性。其次，蓖麻油的加入，可能堵塞了硝化纤维薄膜的纳米孔道，故呈现出其用量增加透气性能下降的趋势。
皮肤创伤，在临床和日常生活中都较为常见，伤口愈合的速度一定程度上取决于创伤表面环境，创伤表面环境需保持一定的潮湿性，即湿润表面可以加速伤口愈合，因此良好的创伤敷料，应具有一定的透气性，对于日常伤口来说，由于伤口表面的复杂，使用在创伤表面的敷料也应具有一定的机械性能。本实验主要探讨了硝化纤维和蓖麻油的用量对创伤敷料性能的影响，为下一步制备性能更加优良的创伤敷料提供研究基础。
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图 1 “药物-成分-靶点”网络图
注：粉色节点为靶点基因，颜色越深，度值越大；不同颜色圆形代表不同中药含有的化合物，其中，橙色代表由多种中药共同含有的化合物，菱形代表中药。
表 1 杞贞滋阴合剂的主要有效活性成分
化合物 编码 化合物来源 QED 丁香酚 MOL000254 TCMSP 0.7 香草酸 MOL000114 TCMSP 0.7 异细辛醚 CID:636750 PUBCHEM 0.7 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 MOL001752 TCMSP 0.7 反式阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72 阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72 异丁香酚(正+反) MOL000206 TCMSP 0.73 芹菜素 MOL000008 TCMSP 0.74 DL-丁香树脂酚 MOL000396 TCMSP 0.74 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 MOL002850 TCMSP 0.75 丁香酚甲基醚 MOL000207 TCMSP 0.81 大豆异黄酮 MOL000390 TCMSP 0.82 黄豆黄素 MOL008400 TCMSP 0.83 刺芒柄花素 MOL000392 TCMSP 0.85 毛蕊异黄酮 MOL000417 TCMSP 0.89 槲皮素 MOL000098 TCMSP 0.51 木犀草素 MOL000006 TCMSP 0.6 山柰酚l MOL000422 TCMSP 0.64 注：表中PUBCHEM为通过文献检索杞贞滋阴合剂查阅到的相关化合物。 
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表 2 成分与核心靶点分子对接结果
成分 靶点名称 PDB ID kcal/mol 槲皮素 INS 5HQI −5.3 TNF 1QTN −6.8 IL-6 YNXZ −6.3 LEP 1ax8 −6.5 IGF1 1imx −6.0 AKT1 1unq −6.2 山柰酚 INS 5HQI −5.2 TNF 1QTN −7.2 IL-6 YNXZ −6.4 LEP 1ax8 −7.2 IGF1 1imx −5.9 AKT1 1unq −6.1 木犀草素 INS 5HQI −5.4 TNF 1QTN −6.8 IL-6 YNXZ −6.4 LEP 1ax8 −7.0 IGF1 1imx −5.9 AKT1 1unq −6.4
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