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基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制

潘宇炯 何志高 陈石秀 周桂 周昕 郁超

潘宇炯, 何志高, 陈石秀, 周桂, 周昕, 郁超. 基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
引用本文: 潘宇炯, 何志高, 陈石秀, 周桂, 周昕, 郁超. 基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
PAN Yujiong, HE Zhigao, CHEN Shixiu, ZHOU Gui, ZHOU Xin, YU Chao. Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
Citation: PAN Yujiong, HE Zhigao, CHEN Shixiu, ZHOU Gui, ZHOU Xin, YU Chao. Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111

基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
基金项目: 中医医院中药临床药学服务规范化建设项目[ZY(2021-2023)-0203-01]
详细信息
    作者简介:

    潘宇炯,本科,主管药师,研究方向:医院制剂生产及研究,Email:pyjandyyh@sina.com

    通讯作者: 周 昕,博士,主任药师,Email:2479707904@qq.com郁 超,博士,主任医师,Email:yubeyond@163.com
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2023)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202208111

Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking

  • 摘要:   目的  应用网络药理学研究杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。  方法  检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) 、中药综合数据库(TCMID)、药物成分靶标数据库(HIT)获取杞贞滋阴合剂的化学成分,从蛋白质-化学相互作用网络数据库(STITCH)中收集候选化合物的相关靶点。利用 GeneCards和DisGeNet数据库对性腺功能减退症的疾病基因进行映射,获得杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的潜在靶点。通过蛋白互作平台数据库(STRING)构建作用靶点之间的互作关系(PPI),将其导入 Cytoscap 软件构建 PPI 网络图。最后,通过对靶点基因进行GO、KEGG富集分析和分子对接,分析杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。  结果  共获得148种疾病与药物交集化合物、96个疾病与药物交集靶点、1085个疾病靶点;其中,与疾病相关的成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素等;通过GO富集分析共得到生物过程(BP)1792条、细胞组成(CC)31条、分子功能(MF)79条;通过KEGG富集分析得到FOXO通路、前列腺癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1通路等;通过分子对接显示,LEP与山柰酚的结合力最好也最稳定。  结论  杞贞滋阴合剂的活性成分可能是通过改善胰岛素抵抗和Leydig细胞睾酮合成酶表达来发挥治疗性腺功能减退症的作用。
  • 环孢素(cyclosporine A, CsA)是肾移植术后三联免疫抑制方案中的基础用药之一。环孢素个体差异大、治疗窗窄,静脉给药虽能更快达到目标浓度,但也更容易使血药浓度偏离治疗窗。研究表明,环孢素血药浓度的个体间差异受患者生理、病理、遗传等因素的影响[1],尤其是与其体内过程相关的基因多态性,如CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1(C1236T、G2677T/A、C3435T)、POR*28、PXR(C5705T、C39823T)和NFKB1-94 ins/del ATTG等。然而,目前如何根据基因型调整用药尚不明确,且针对环孢素注射液基因多态性的研究尚未见报道。因此,探究基因多态性对环孢素注射液血药浓度的影响,尝试建立以基因多态性为基础的个体化给药方案对优化临床用药具有一定的意义。

    回顾性收集了某三甲医院泌尿外科收住的行肾移植术的患者144例。纳入标准:①患者年龄≥18岁;②住院期间使用环孢素注射液联合霉酚酸类药物和糖皮质激素。排除标准:①严重肝功能不全者(ALT或AST值≥3倍正常上限);②无法获取病案资料的患者;③同时服用显著影响环孢素血药浓度的药物,如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑及地尔硫䓬。

    环孢素注射液连续多次给药后应用酶增强免疫分析法(EMIT)测定全血谷浓度,取稳态时的浓度作为最终的谷浓度(C0)。将剂量以体表面积进行校正,计算剂量校正谷浓度(C0/D′),即环孢素血药谷浓度/剂量×体表面积。

    采用离心柱型全血DNA快速提取试剂盒提取全血样本中的基因组DNA,获得DNA样本浓度为10~60 ng/ml。基因分型采用Sequenom Mass ARRAY®SNP检测系统进行检测,由上海吉凯基因化学技术公司完成。

    采用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料以($\bar x \pm s$)或Me(IQR)表示。采用独立样本t检验,比较单独使用环孢素注射液和联合使用环孢素注射液及糖皮质激素冲击治疗患者的C0及降低幅度的差异;采用χ2检验对各基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡(HWE)检验;采用在线软件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析各SNP位点间连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)状况;采用方差分析来计算各位点不同基因型患者间C0/D′的差异;采用Spearman相关性分析及多重线性回归分析建立基于基因多态性的个体化给药模型。

    入组患者共144例,其中男性109例,女性35例,患者基本信息见表1

    表  1  研究对象的一般临床资料(n=144)
    指标统计描述百分率(%)
    年龄(岁)37.5(15)
    性别(男/女,例)109/3575.7/24.3
    体重(kg)59.46±10.47
    体表面积(m21.65(0.28)
    BMI(kg/ m221.21±3.14
    血红蛋白(g/L)101.56±24.05
    血细胞比容(%)30.84±7.16
    供体类型(尸体/亲属,例)122/2284.7/15.3
    环孢素使用天数(d)11(7)
    是否激素冲击(是/否,例)80/6455.6/44.4
    血肌酐是否降低(是/否,例)112/3277.7/22.3
      注:数据以($\bar x \pm s$)或Me(IQR)表示
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    对患者环孢素注射液C0及用药后的血肌酐降低幅度进行统计分析。结果显示,单独使用环孢素注射液(单独用药组)后肌酐降低的患者比例为68.8%;联合使用环孢素注射液和糖皮质激素冲击治疗(联合用药组)后肌酐降低的患者比例为85.0%。单独用药组比联合用药组具有更高的C0〔(189.50±38.56)ng/ml vs(172.87±44.27)ng/ml〕,经独立样本T检验,两组患者C0的差异具有统计学意义(P<0.05)。然而,对两组患者的肌酐降低幅度进行Mann-Whitney U检验发现,单独用药组患者的肌酐降低幅度显著低于联合用药组〔19.27(22.84)% vs 45.25(50.38)%;P<0.01〕(见表2)。

    表  2  单独用药与联合用药方案的血肌酐降低幅度差异
    用药方案例数及比例(N/%)肌酐降低例数及比例(N/%)C0(ng/ml)肌酐降低幅度(%)
    环孢素注射液64(44.4)44(68.8)189.50±38.5619.27(22.84)
    环孢素注射液+糖皮质激素80(55.6)68(85.0)172.87±44.27*45.25(50.38)**
     注:*P<0.05,**P<0.01,与单用环孢素注射液比较
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    入组患者的CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 G2677T/A、ABCB1 C3435T、PXR C5705T、PXR C25385T、NFKB1 -94 ins /del ATTG及POR*28(仅64例患者)等9个SNPs的基因型频率分布及HWE遗传平衡吻合度计算见表3。9个SNPs均符合HWE(P>0.05),说明研究对象来自同一孟德尔群体,具有良好的群体代表性。

    表  3  肾移植患者中9个SNPs基因分型以及等位基因频率(n=144)
    SNP(ID)基因型频率(%)等位基因频率(%)χ2P
    野生/野生野生/突变突变/突变野生突变
    CYP3A4*18BGG(*1*1)GA(*1*18B)AA(*18B*18B)GA0.0460.830
    rs224248080(55.6%)54(37.5%)10(6.9%)74.3%25.7%
    CYP3A5*3AA(*1*1)AG(*1*3)GG(*3*3)AG0.0050.945
    rs77674611(7.6%)57(39.6%)76(52.8%)27.4%72.6%
    ABCB1 C1236TCCCTTTCT0.9850.321
    rs112850314(9.7%)70(48.6%)60(41.7%)34.0%66.0%
    ABCB1G 2677T/AGGGT+GATT+TA+AAGT+A0.0700.791
    rs203258223(16.0%)71(49.3%)50(34.7%)40.6%59.4%
    ABCB1 C3435TCCCTTTCT1.2490.264
    rs104564254(37.5%)63(43.8%)27(18.7%)59.4%40.6%
    PXR C5705TCCCTTTCT2.9180.088
    rs381405587(60.4%)45(31.3%)12(8.3%)76.0%24.0%
    PXR C39823TCCCTTTCT2.2500.134
    rs227670740(27.8%)80(55.6%)24(16.6%)55.6%44.4%
    NFKB1-94 ins /delATTGII ID DD ID0.0360.849
    rs2836249145(31.3%)72(50.0%)27(18.7%)56.3%43.7%
    POR*28CCCTTTCT2.1930.139
    rs105786826(40.6%)25(39.1%)13(20.3%)60.2%39.8%
      注:①. 指插入突变纯合子;②. 指插入突变杂合子;③. 指缺失突变纯合子。
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    各位点不同基因型患者之间使用环孢素注射液的C0/D′的差异见表4。在9个SNPs中,CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C0/D′具有显著相关性,*1/*1基因型患者的C0/D′显著高于*18B/*18B基因型患者(P<0.05);CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 G2677T/A、ABCB1 C3435T、PXR C5705T、PXR C39823T、NFKB1-94 ins/del ATTG及POR*28基因多态性均与肾移植患者环孢素注射液的C0/D′无显著相关性(P>0.05)。

    表  4  各位点不同基因型对环孢素C0/D′的影响
    位点(ID)基因型例数/占比[n,(%)]C0/D′[(ng/ml)/(mg/kg)]P
    CYP3A4*18B
    rs2242480
    *1/*180(55.6)1.52±0.420.044
    *1/*18B54(37.5)1.42±0.42
    *18B/*18B10(6.9)1.19±0.26*
    CYP3A5*3
    rs776746
    *1/*111(7.6)1.36±0.460.647
    *1/*357(39.6)1.45±0.37
    *3/*376(52.8)1.48±0.45
    ABCB1 C1236T
    rs1128503
    CC14(9.70)1.43±0.480.486
    CT70(48.6)1.50±0.41
    TT60(41.7)1.41±0.42
    ABCB1 G2677T/A
    rs2032582
    GG23(16.0)1.40±0.410.674
    GA+GT71(49.3)1.49±0.40
    AA+AT+TT50(34.7)1.44±0.46
    ABCB1 C3435T
    rs1045642
    CC54(37.5)1.46±0.410.596
    CT63(43.8)1.43±0.43
    TT27(18.7)1.53±0.43
    PXR C5705T
    rs3814055
    CC87(60.4)1.43±0.410.442
    CT45(31.3)1.48±0.45
    TT12(8.30)1.58±0.36
    PXR C39823T
    rs2276707
    CC40(27.8)1.55±0.490.262
    CT80(55.6)1.43±0.40
    TT24(16.6)1.38±0.35
    NFKB1(-94 ins/del ATTG)
    rs28362491
    II45(31.3)1.49±0.460.300
    ID72(50.0)1.41±0.41
    DD27(19.7)1.54±0.39
    POR*28
    rs1057868
    *1/*126(40.6)1.63±0.450.491
    *1/*2825(39.1)1.48±0.43
    *28/*2813(20.3)1.54±0.38
      注:*P<0.05,与*1/*1型比较。
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    参考单因素和多因素分析方法,将3个人口统计学指标(性别、年龄、体重)、3个临床指标(血红蛋白、血细胞比容、供体类型)和上述9个SNPs基因多态性定义为自变量,与环孢素注射液的C0/D′进行单因素相关分析。结果显示,在以上指标中,血红蛋白、血细胞比容和CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液的C0/D′呈正相关,CYP3A4*18B与环孢素注射液的C0/D′呈负相关。其他12个指标与环孢素注射液C0/D′均没有显著相关性,详见表5

    表  5  各观察指标与环孢素注射液C0/D′的相关性
    指标相关系数(r决定系数(R2P
    年龄0.1140.0130.175
    性别−0.0710.0050.400
    体重0.1400.0200.094
    血红蛋白0.4630.2140.000*
    血细胞比容0.4540.2060.000*
    供体类型0.1120.0130.180
    CYP3A4*18B−0.1760.0310.035
    CYP3A5*30.0430.0020.610
    ABCB1 C1236T−0.0560.0030.504
    ABCB1 G2677T/A0.0060.0000.943
    ABCB1 C3435T0.0220.0000.798
    PXR C5705T0.1000.0100.235
    PXR C39823T−0.1360.0180.103
    NFKB1(-94 ins/del ATTG)0.0030.0000.971
    POR*28−0.1300.0170.305
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    对上述3个相关因素与环孢素注射液C0/D′进行的初步多重逐步回归分析,排除存在共线性问题的因素,得到最佳模型。在最佳回归模型中,血红蛋白和CYP3A4*18B基因多态性对环孢素注射液C0/D′均有统计学意义(P值分别为0.000和0.024)。根据最佳回归模型得到的回归方程即环孢素注射液C0/D′的预测算法,方程式如下:

    Y=0.695+0.008X1−0.112X2,

    式中因变量Y为环孢素注射液C0/D′,因此,应用环孢素注射液的肾移植患者环孢素注射液维持剂量预测模型为:

    D′(mg/m2)=C/(0.695+0.008X1−0.112X2

    公式中:X1代表用药前患者的血红蛋白含量,X2代表CYP3A4*18B基因多态性;CYP3A4 *1/*1型患者X2=0,CYP3A4*1/*18B型患者X2=1,CYP3A4*18B/*18B型患者X2=2;C为临床TDM目标谷浓度值。

    糖皮质激素冲击治疗是肾移植术后发生急性排斥反应的一线治疗方案。然而,由于糖皮质激素冲击治疗不良反应多且发生率高,对于临床上仅发生或疑似发生亚临床或临界排斥反应的患者可能并不是最佳用药。蔡治涛等[2]收录在《2012年中国器官移植大会论文汇编》中的研究指出以静脉环孢素为基础的免疫抑制治疗方案是一种安全、有效的治疗手段。为探究环孢素注射液在临床上的疗效,本研究对两种治疗方案(环孢素注射液单药vs环孢素注射液和糖皮质激素联合用药)对肾移植术后发生亚临床或临界排斥反应的临床疗效进行研究,结果发现,环孢素注射液单药组在降低患者肌酐水平方面的疗效不及环孢素注射液和糖皮质激素联合用药组〔肌酐降低比例:68.8% vs 85.0%;肌酐降低幅度:19.27(22.84)% vs 45.25(50.38)%;P<0.01〕,但单药组具有更高的稳态谷浓度C0〔(189.50±38.56)ng/ml vs (172.87±44.27)ng/ml〕。该研究结果表明对于肾移植术后发生亚临床或临界排斥反应的患者,单用环孢素注射液仍然具有较好的临床疗效,且血药浓度处于比较安全的剂量范围,可能是比较适合该类患者的治疗方案。

    大量研究表明,遗传因素如编码药物转运体、代谢酶、作用靶点和核受体的基因多态性[3]是引起药物在人体内的处置和药物反应的个体性差异的主要原因,其中CYP3A4*18B、CYP3A5*3、ABCB1(C1236T、G2677T/A、C3435T)、POR*28、PXR(C5705T、C39823T)以及NFKB1-94 ins/del ATTG对环孢素药动学的影响较为重要。

    CYP3A4和CYP3A5是环孢素的主要代谢酶,其编码基因的多态性可能影响酶的表达,进而影响环孢素的药动学。研究表明,CYP3A4*18B(或称CYP3A4*1G,82266G>A;rs2242480),是与环孢素的体内代谢相关的SNPs之一,在中国人群中突变频率为29.5%[4],该位点的突变可能会提高CYP3A4的活性[5],增加环孢素的代谢从而降低其血药浓度。Li等[6]研究发现,携带CYP3A4*18B/*18B基因型患者的环孢素血药浓度显著低于*1/*1及*1/*18B基因型患者,但*1/*1与*1/*18B基因型患者间差异无统计学意义。本研究结果显示,*1/*1基因型患者的环孢素注射液的C0/D′显著高于*18B/* 18B基因型患者(P<0.05),但*1/*1与*1/*18B基因型患者间差异无统计学意义。该结果与文献报道一致。CYP3A5*3(6986A>G;rs776746)是另一个与环孢素的体内代谢相关的SNP,在中国人群中的突变频率高达75.4%[7]。当*1突变为*3时可导致mRNA剪接发生改变和蛋白质截断,使CYP3A5酶活性降低或消失,减少环孢素经CYP3A5酶的代谢,从而使环孢素血药浓度升高。目前该位点基因多态性与环孢素血药浓度相关性的研究结论尚不统一[8-11]。本研究结果显示,CYP3A5*3基因多态性均与环孢素注射液的C0/D′无相关性。出现这一结果可能主要是环孢素由CYP3A酶系中的CYP3A4代谢,其对环孢素的清除率是CYP3A5的2.3倍[12]所导致。

    P糖蛋白(P-gp)在环孢素的转运中发挥着重要作用,静脉给药可被肝脏P-gp将药物转移至胆道使药物胆汁排泄增加,从而使血药浓度降低。P-gp是多重耐药基因ABCB1编码的产物,因此ABCB1基因多态性可影响P-gp的表达从而影响环孢素的血药浓度。本研究结果显示,ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和ABCB1 G2677T/A基因多态性与环孢素注射液的C0/D′无相关性,分析原因可能是由于P-gp主要位于小肠黏膜成熟上皮细胞的刷状缘上,只有小部分分布于肝细胞,因此,由ABCB1基因多态性导致的P-gp表达和活性的改变对环孢素注射液血药浓度的影响较小。

    孕烷X受体(PXR)编码基因多态性很可能会影响PXR表达或功能,进而影响CYP3A酶及P-gp的表达,从而影响环孢素的药动学。研究报道[13-14],C5705T(rs3814055)、C39823T(rs2276707)与CYP3A4表型、活性和含量有关,且二者在中国人群中的突变频率分别是38.06%和78.95%[15]。但截至目前,PXR基因多态性是否与环孢素药动学具有相关性尚存在争议。本研究结果显示,PXR C5705T及C39823T基因多态性与环孢素注射液血药浓度无相关性。

    NFKB1-94 ins/del ATTG中ATTG 4个碱基的缺失(deletion)引起启动子活性的降低,进而降低NF-κB的表达和功能,较少炎症反应的发生,从而减少对环孢素代谢的影响。Zhang等[10]研究发现,NFKB1 -94ATTG插入突变的纯合子个体(-94ATTG ins/ins)环孢素的C0/D'显著高于缺失突变(-94ATTG del/del)的个体〔(75.9±32.9)vs.(55.1±15.1)ng/ml per mg/kg,P=0.026〕。然而,本研究却发现缺失突变纯合子患者的C0/D′高于插入突变纯合子患者,但差异无统计学意义(P>0.05)。出现此结果的原因可能是该基因对环孢素的血药浓度的影响主要是通过受NF-κB的炎症反应而实现的,属于间接作用,所以可能对环孢素注射液的C0/D′影响较小,在其他主要影响因素的作用下导致缺失突变纯合子患者的C0/D′高于插入突变纯合子患者。

    POR*28在中国人群中突变率为29.6%[16]。有研究报道,POR*28能够增加CYP3A的活性,从而增加环孢素经CYP3A的代谢使得其血药浓度降低。Elens等[17]分析了174例肾移植患者的POR*28的基因型及环孢素的部分药动学参数,结果发现,POR*28/*28患者的C0/D'较POR*1/*28和*1/*1患者低15.1%(CI 95%=224.8~24.2%;P=0.03),但POR*1/*28型和POR*1/*1型间无显著性差异。然而,本研究结果显示,POR*28/*28基因型患者环孢素的C0/D′与POR*1/*28和*1/*1基因型患者间并无显著性差异。

    本研究所建立的给药剂量模型,只纳入血红蛋白和CYP3A4*18B基因多态性两个因素,经检验模型是有意义的(F=23.85,P<0.001),但该模型只能解释25.3%(R2=0.253)的个体差异,可能存在其他的对环孢素注射液C0/D′具有显著影响的因素,如药物相互作用(保肝药物、胃黏膜保护药物以及活血药物等)、患者术后内环境变化等,这些都可能影响环孢素注射液的体内药动学过程。这也是本研究存在的不足之处。

    综上所述,本研究首次研究了基因多态性与环孢素注射液血药浓度的相关性并发现只有CYP3A4*18B基因多态性与环孢素注射液C0/D′呈显著相关,而其他8个SNPs基因多态性对环孢素注射液C0/D′无影响。但由于目前国内外关于环孢素注射液的相关研究几乎空白,现有参考资料较少,本研究作为初探,其结果仍需进一步进行大样本量的临床验证,对模型进行优化。

  • 图  1  “药物-成分-靶点”网络图

    注:粉色节点为靶点基因,颜色越深,度值越大;不同颜色圆形代表不同中药含有的化合物,其中,橙色代表由多种中药共同含有的化合物,菱形代表中药。

    图  2  杞贞滋阴合剂疾病靶标蛋白PPI网络图

    图  3  疾病靶点GO富集分析(前10)

    图  4  疾病靶点KEGG富集分析图

    A. 度值前15的通路气泡图;B. 核心网络与度值前15的通路相关性

    图  5  部分蛋白和活性成分分子对接图

    表  1  杞贞滋阴合剂的主要有效活性成分

    化合物 编码 化合物来源 QED
    丁香酚 MOL000254 TCMSP 0.7
    香草酸 MOL000114 TCMSP 0.7
    异细辛醚 CID:636750 PUBCHEM 0.7
    2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 MOL001752 TCMSP 0.7
    反式阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72
    阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72
    异丁香酚(正+反) MOL000206 TCMSP 0.73
    芹菜素 MOL000008 TCMSP 0.74
    DL-丁香树脂酚 MOL000396 TCMSP 0.74
    2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 MOL002850 TCMSP 0.75
    丁香酚甲基醚 MOL000207 TCMSP 0.81
    大豆异黄酮 MOL000390 TCMSP 0.82
    黄豆黄素 MOL008400 TCMSP 0.83
    刺芒柄花素 MOL000392 TCMSP 0.85
    毛蕊异黄酮 MOL000417 TCMSP 0.89
    槲皮素 MOL000098 TCMSP 0.51
    木犀草素 MOL000006 TCMSP 0.6
    山柰酚l MOL000422 TCMSP 0.64
    注:表中PUBCHEM为通过文献检索杞贞滋阴合剂查阅到的相关化合物。
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    表  2  成分与核心靶点分子对接结果

    成分 靶点名称 PDB ID kcal/mol
    槲皮素
    INS 5HQI −5.3
    TNF 1QTN −6.8
    IL-6 YNXZ −6.3
    LEP 1ax8 −6.5
    IGF1 1imx −6.0
    AKT1 1unq −6.2
    山柰酚
    INS 5HQI −5.2
    TNF 1QTN −7.2
    IL-6 YNXZ −6.4
    LEP 1ax8 −7.2
    IGF1 1imx −5.9
    AKT1 1unq −6.1
    木犀草素
    INS 5HQI −5.4
    TNF 1QTN −6.8
    IL-6 YNXZ −6.4
    LEP 1ax8 −7.0
    IGF1 1imx −5.9
    AKT1 1unq −6.4
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-08-31
  • 修回日期:  2023-09-18
  • 网络出版日期:  2024-01-19
  • 刊出日期:  2024-01-25

基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
    基金项目:  中医医院中药临床药学服务规范化建设项目[ZY(2021-2023)-0203-01]
    作者简介:

    潘宇炯,本科,主管药师,研究方向:医院制剂生产及研究,Email:pyjandyyh@sina.com

    通讯作者: 周 昕,博士,主任药师,Email:2479707904@qq.com郁 超,博士,主任医师,Email:yubeyond@163.com
  • 中图分类号: [文章编号] 2097-2024(2023)00-0000-00 [DOI] 10.12206 /j.issn.2097-2024.202208111

摘要:   目的  应用网络药理学研究杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。  方法  检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) 、中药综合数据库(TCMID)、药物成分靶标数据库(HIT)获取杞贞滋阴合剂的化学成分,从蛋白质-化学相互作用网络数据库(STITCH)中收集候选化合物的相关靶点。利用 GeneCards和DisGeNet数据库对性腺功能减退症的疾病基因进行映射,获得杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的潜在靶点。通过蛋白互作平台数据库(STRING)构建作用靶点之间的互作关系(PPI),将其导入 Cytoscap 软件构建 PPI 网络图。最后,通过对靶点基因进行GO、KEGG富集分析和分子对接,分析杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制。  结果  共获得148种疾病与药物交集化合物、96个疾病与药物交集靶点、1085个疾病靶点;其中,与疾病相关的成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素等;通过GO富集分析共得到生物过程(BP)1792条、细胞组成(CC)31条、分子功能(MF)79条;通过KEGG富集分析得到FOXO通路、前列腺癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1通路等;通过分子对接显示,LEP与山柰酚的结合力最好也最稳定。  结论  杞贞滋阴合剂的活性成分可能是通过改善胰岛素抵抗和Leydig细胞睾酮合成酶表达来发挥治疗性腺功能减退症的作用。

English Abstract

潘宇炯, 何志高, 陈石秀, 周桂, 周昕, 郁超. 基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
引用本文: 潘宇炯, 何志高, 陈石秀, 周桂, 周昕, 郁超. 基于网络药理学和分子对接技术探讨杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的作用机制[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
PAN Yujiong, HE Zhigao, CHEN Shixiu, ZHOU Gui, ZHOU Xin, YU Chao. Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
Citation: PAN Yujiong, HE Zhigao, CHEN Shixiu, ZHOU Gui, ZHOU Xin, YU Chao. Mechanism of Qizhenziyin mixture in the treatment of hypogonadism based on network pharmacology analysis and molecular docking[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(1): 24-31. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202208111
  • 性腺功能减退症是一种由多种原因引起的睾酮水平低于健康青年男子正常范围的疾病,临床症状为焦躁不安、健忘出汗、性功能减退等。从流行病学分析,该病在肥胖和糖尿病人群中发病较多;其次,多发病于中老年男性患者,也称迟发性性腺功能减退症(LOH)[1]。目前,西医治疗男性肥胖和LOH多以外源性和内源性补充睾酮为主,治疗手法单一,且存在诸多的争议。例如,在临床中,对于 LOH症状中失眠、潮热、健忘、注意力不集中等精神心理症状,单纯用睾酮补充治疗(TST),症状改善不显著[2-5]。中医治疗则根据患者在TST过程中所表现的不同证候采用不同的治疗方法,如心功能不全患者以补肾为主,情志精神患者以疏肝为主,生理体能欠佳者以健脾、补益为主等不同的治疗方法[5]

    杞贞滋阴合剂(沪药制备字Z20210006000),是上海市著名中医周智恒教授的经验方。该方中,君药是熟地黄、黄芪,起滋阴补肾、益气培元之功效;臣药是枸杞子、女贞子、山茱萸,起补肾、涩精、固肾之功效;佐药为沙苑子、当归,起益精养血之功效;锁阳阳中求阴为使药。全方共奏滋阴补肾、益气生精之功效。前期临床实验证明,杞贞滋阴合剂可以有效改善LOH患者体能不济、血管舒缩和睾酮水平低下等症状[6-7]

    网络药理学是通过“药物-基因-靶点-疾病”相互作用网络,预测药物作用机制的学科[8]。分子对接是通过受体和药物分子之间的相互作用来进行药物设计的方法。本研究通过网络药理学和分子对接技术,对杞贞滋阴合剂的作用机制进行研究,以期为该制剂的后期开发提供技术支持和理论依据。

    • 在中药综合数据库(TCMID)[9]、中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP) [10]、药物成分靶标数据库(HIT) [11]和文献中检索杞贞滋阴合剂的相关化学成分,再在TCMID,TCMSP,HIT,STITCH数据库中查找有效活性成分的靶点,取STITCH数据库中化合物靶标关联度400以上的靶标[12],并使用NCBI数据库中的基因模块对生物靶标信息进行标准化,建立相关的化学成分靶标数据库。

    • 将化合物的物理化学特征与上市药物特征进行比较,采用Bickerton等提出的有效的类药性评估指标(quantitative estimate of druglikeness,QED)评估化学成分的类药性[13]

      $$ {\mathrm{QED}} = \exp \left(\frac{1}{n}\sum\nolimits_{i = 1}^n {\ln {d_i}} \right) $$

      参考DRUGBANK上市药物QED值,选择0.3为阈值筛选化合物。

    • 采用基于二项分布的富集评分算法来筛选核心方的作用靶标[14]

      $$ {P_i}(X \geqslant k) = {\sum\limits_{m = k}^n {C_n^m\left( p \right)} ^m}{\left( {1 - p} \right)^{n - m}} $$

      P<0.01时,表明该靶标基因被至少k个活性化合物同时作用是小概率事件,则该靶标基因是核心方的主要作用靶标基因,并将含有主要作用靶标基因的化合物作为主要作用化合物。

    • 在GENECARD数据库[15]的Malacard模块中查找“性腺功能减退症”的靶点数据,以得分双倍中位数为筛选条件,在DisGeNet数据库查找“性腺功能减退症疾病”的靶点数据。合并以上两个数据库的筛选结果,并删除重复靶标。最后,使用韦恩图确定杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的主要靶标,并使用STRING数据库进行蛋白PPI网络分析。

    • 将得到的97个疾病靶标进行富集分析,其中,通路信息来自KEGG通路数据库[16],基因本体GO富集分析信息数据来源于Gene Ontology数据库,再应用超几何分布模型评估靶标基因群是否与特定的GO及生物通路显著关联:

      $$ P = 1 - \sum\limits_{i = 0}^{k - 1} {\frac{{\left( \begin{gathered} M \\ i \\ \end{gathered} \right)\left( \begin{gathered} N - M \\ n - i \\ \end{gathered} \right)}}{{\left( \begin{gathered} N \\ n \\ \end{gathered} \right)}}} $$

      经过错误发现率(False discovery rate, FDR) [17]法调整的P值,反映了杞贞滋阴合剂靶标或者疾病靶标与通路或GO的关联强度,本项目经调整后的P值,以小于0.01认为关联显著。

    • 利用Cytoscape软件的插件评估筛选核心靶标,组成核心网络,评估杞贞滋阴合剂疾病KEGG关联条目的关系。所有图片中形状大小、颜色深浅均以度值排序。

    • 取度值较高的核心靶点,导入PDB(https://www.pdbus.org/),筛选条件以X-RAY下Resolution值小为首选标准,下载PDB文件,使用PYMOL软件,去水、去配体后备用;从PubChem数据库下载活性成分,运用AutoDock-Tools软件对受体蛋白及配体进行加氢、平衡电荷等操作后,对处理好的活性化合物与靶蛋白进行对接,并进行能量计算,最终运用PYMOL软件进行绘图。

    • 通过TCMSP、TCMID、HIT数据库和文献检索获得495个活性化合物;然后在STITCH数据库中,筛选靶标关联度400以上的靶标,获得靶标7627个;再通过类药性分析,共得到246个满足类药性成分的化合物;并使用二项分布算法筛选核心方的作用靶标,筛选得到701个成分靶标和213个主要作用化合物。

      通过GENECARD数据库筛选到1051个相关靶标,通过DisGeNet数据库筛选到305个相关靶标,合并删除重复疾病靶标后,共获得1085个与性腺功能减退症相关的疾病靶标基因。结合杞贞滋阴合剂的701个成分靶标,使用韦恩图确定杞贞滋阴合剂的96个疾病靶标和148种活性化合物,见表1

      表 1  杞贞滋阴合剂的主要有效活性成分

      化合物 编码 化合物来源 QED
      丁香酚 MOL000254 TCMSP 0.7
      香草酸 MOL000114 TCMSP 0.7
      异细辛醚 CID:636750 PUBCHEM 0.7
      2-甲氧基-4-乙烯基苯酚 MOL001752 TCMSP 0.7
      反式阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72
      阿魏酸 MOL000360 TCMSP 0.72
      异丁香酚(正+反) MOL000206 TCMSP 0.73
      芹菜素 MOL000008 TCMSP 0.74
      DL-丁香树脂酚 MOL000396 TCMSP 0.74
      2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 MOL002850 TCMSP 0.75
      丁香酚甲基醚 MOL000207 TCMSP 0.81
      大豆异黄酮 MOL000390 TCMSP 0.82
      黄豆黄素 MOL008400 TCMSP 0.83
      刺芒柄花素 MOL000392 TCMSP 0.85
      毛蕊异黄酮 MOL000417 TCMSP 0.89
      槲皮素 MOL000098 TCMSP 0.51
      木犀草素 MOL000006 TCMSP 0.6
      山柰酚l MOL000422 TCMSP 0.64
      注:表中PUBCHEM为通过文献检索杞贞滋阴合剂查阅到的相关化合物。
    • 利用Cytoscape软件,以杞贞滋阴合剂的96个疾病靶标和148种活性化合物,建立“药物-成分-靶点”网络图,其中,度值较高的化合物有棕榈油、乙醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、果糖、硬脂酸等,见图1

      图  1  “药物-成分-靶点”网络图

    • 通过STRING数据库进行蛋白PPI网络分析,并利用Cytoscape软件,以疾病为靶标进行蛋白PPI网络分析,图中共有96个节点,1132条边,其中,度值排名前10的靶标是血清白蛋白(ALB)、INS、阿黑皮素原(POMC)、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6、FOS、ESR1,见图2

      图  2  杞贞滋阴合剂疾病靶标蛋白PPI网络图

    • 对杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的靶标基因进行GO富集分析,以P值小于0.01为关联显著,以此进行筛选,生物过程(BP)有1792条、细胞组件(CC)有31条、分子功能(MF)有79条,并取P值前15条的BP、CC、MF分别制得条形图。其中,MF主要集中在受体激动剂活性、激素活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、G蛋白偶联受体结合等;CC主要集中在分泌颗粒腔、细胞质膜结合囊泡腔、囊泡腔、内质网内腔等;BP主要集中在对肽类激素的反应、多细胞生物稳态、对营养水平的反应等,见图3

      图  3  疾病靶点GO富集分析(前10)

    • 对杞贞滋阴合剂治疗性腺功能减退症的靶标基因进行GO富集分析,以P值小于0.01为关联显著,并以此进行筛选,结果KEGG信号通路的富集分析报告中,复方靶标与性腺功能减退症相关的有132条信号通路,取P值前15条信号通路,制得气泡图和核心网络与前15条通路的关系图见图4

      图  4  疾病靶点KEGG富集分析图

    • 根据“药物-成分-靶点”网络分析得到排名前17的核心活性成分,剔除其中成药性较差的,例如,乙醇、棕榈油、果糖、硬脂酸等,最后选取槲皮素、山柰酚、木犀草素作为核心活性成分;从度值排名前8的核心靶点中,剔除与槲皮素、山柰酚、木犀草素无密切度的ALB和POMC,最后选取INS、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6六个靶点进行分子对接。其中,对接得分(kcal/mol值)绝对值>4.25代表结合活性一般,绝对值>5.0代表结合活性较好,绝对值>7.0代表结合活性较强[18]。由结果可知,主要核心靶点与核心化合物的结合值都超过了5.0,核心靶点TNF 和LEP的结合值整体高于其他靶点,其中,LEP 与山柰酚的结合力较强,见表2图5

      表 2  成分与核心靶点分子对接结果

      成分 靶点名称 PDB ID kcal/mol
      槲皮素
      INS 5HQI −5.3
      TNF 1QTN −6.8
      IL-6 YNXZ −6.3
      LEP 1ax8 −6.5
      IGF1 1imx −6.0
      AKT1 1unq −6.2
      山柰酚
      INS 5HQI −5.2
      TNF 1QTN −7.2
      IL-6 YNXZ −6.4
      LEP 1ax8 −7.2
      IGF1 1imx −5.9
      AKT1 1unq −6.1
      木犀草素
      INS 5HQI −5.4
      TNF 1QTN −6.8
      IL-6 YNXZ −6.4
      LEP 1ax8 −7.0
      IGF1 1imx −5.9
      AKT1 1unq −6.4

      图  5  部分蛋白和活性成分分子对接图

    • 睾酮已被证明是维持代谢稳态的关键调节因子。现代研究证明,睾酮与胰岛素抵抗、血脂异常、炎症细胞因子合成增加等因素密切相关[19-23]。因此,临床治疗LOH除了补充睾酮,多以控制体重、改善胰岛素抵抗的方法达到改善患者的血清睾酮水平和性功能的目的。

      本次研究,通过TCMSP、TCMID、HIT等数据库搜索,并进行类药性分析和二项分布算法筛选,共得到701个成分靶标和213个主要作用化合物,再通过建立“药物-成分-靶点”网络图,发现其中与疾病关联性较强的化合物是槲皮素、山柰酚、木犀草素等,主要作用的疾病靶点是AKT1、IL-6、IGF1、LEP等。有研究表明,槲皮素可刺激cAMP依赖性急性调节(Star)启动子的激活,增加Leydig细胞生成睾酮[24];山柰酚可以改善雄性小鼠生殖器官重量、精子质量,减少睾丸组织损伤[25];木犀草素能激活Star蛋白的表达,进而增加睾酮的产生[26]。又有研究表明,IL-6炎症细胞因子被释放到血液中,可能抑制Leydig细胞的发育[27];AKT1蛋白可通过磷酸化,进而调节哺乳动物的睾丸功能,而IGF1可刺激多种AKT1的活性[28];LEP可通过下丘脑PI3K/AKT通路刺激GnRH合成与释放,从而影响血清睾酮水平[29]

      通过KEGG富集分析共得到132条通路,并筛选出P值排名前15的通路,包括FOXO通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗、HIF-1通路等。其中,缺氧诱导因子-1(HIF1)是参与细胞缺氧反应的关键转录因子,并且在Leydig细胞中稳定表达,而Leydig细胞生成睾酮是雄性睾酮的主要来源,当HIF1上调时,睾酮水平显著降低[30]。在FOXO通路中,STAT3、IL-6、AKT1、IGF-1广泛参与了FOXO的激活,FOXO蛋白作为核转录因子,可以促进胰岛素或IGF-1在哺乳动物细胞的增殖[31]

      综上所述,杞贞滋阴合剂治疗LOH的主要活性成分和作用靶点主要涉及Leydig细胞睾酮合成酶表达和改善胰岛素抵抗。其中,Leydig睾丸间质细胞的功能和数量下降导致的雄激素缺乏是LOH的主要核心机制[32]。有研究表明,胰岛素可通过刺激下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的产生和分泌,进而刺激黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的生物合成,而LH和FSH是睾丸功能的重要激素调节因子[33]。中医将糖尿病前期归于“消渴” 等范畴。《金匮要略》中消渴病篇提到:“男子消渴,小便反多,以饮一斗,小便一斗,肾气丸主之。”肾阳不足,则无力蒸腾气化水液[34],而杞贞滋阴合剂的创始者周智恒教授认为LOH的病因正是肾气衰、真水枯竭,该方正是有滋阴补肾、益气生精之功效[6]。众所周知,胰岛素抵抗正是糖尿病的病理基础。由上可见,杞贞滋阴合剂的中医治疗LOH的理论和胰岛素抵抗的中医治疗理论相一致,也为本研究指出的杞贞滋阴合剂治疗LOH多涉及改善胰岛素抵抗提供了理论依据。本研究为杞贞滋阴合剂治疗性腺机能减退症探索了新的防治思路,但由于数据统计来自于多平台的数据收录和总结,结果还需后续实验研究做进一步的验证,从而完善杞贞滋阴合剂治疗LOH的作用机制。

参考文献 (34)

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