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纤维化是一种由器官慢性损伤或炎症反应引起的病理变化，其主要特征是细胞外基质（ECM）的过度积累，可见于心、肺、肝、肾、皮肤等多种组织器官，纤维化持续进展可导致组织结构破坏及器官功能障碍，最终引起器官衰竭[1]。尽管各组织器官的纤维化发病机制不尽相同，但其基本过程大抵相似，由器官损伤引起炎症免疫反应，进而激活局部肌成纤维细胞，降低组织收缩力，促进炎症介质的分泌和ECM的合成，从而逐步发展为纤维化。重要脏器的纤维化严重影响人类的健康，是目前世界医学的研究难题。
隐丹参酮（CTS）是一种从唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎中提取的脂溶性二萜类蒽醌化合物，具有抗炎[2]、抗肿瘤[3]、抗菌[4]、神经保护[5]、心血管保护[6]等多种药理活性，近年来研究发现其还具有良好的抗组织纤维化作用[7-9]。目前研究显示，隐丹参酮的抗纤维化作用机制主要与信号转导和转录激活因子3（signal transduction and transcriptional activator 3, STAT3）、转化生长因子β（transforming growth factor-beta, TGFβ）和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信号通路的抑制作用有关[7, 9，10]。本文主要就隐丹参酮对心、肺、肝、肾、皮肤等多种组织器官纤维化的治疗作用及其机制进行综述，为隐丹参酮的药物研究提供参考。
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心脏纤维化涉及由慢性压力、损伤、全身性疾病和药物导致的心脏重塑。其病理特征包括心肌胶原排列紊乱、ECM过度沉积、心脏成纤维细胞（CFs）过度增殖和表型改变[11]。心脏纤维化对许多心脏疾病具有促进作用，主要原因是瘢痕组织阻碍了心脏正常泵血功能，从而引起心房颤动、心力衰竭以及收缩和舒张功能受损等心脏问题。
在心血管疾病中，细胞内活性氧（ROS）可以通过对DNA、蛋白质、脂质和大分子造成非特异性氧化损伤或对细胞信号通路的特异性调节参与心脏重塑。ROS的水平及其作用受到多种酶的调节，如NADPH氧化酶（NOX)、一氧化氮合酶（NOS）、呼吸链复合物蛋白和细胞色素P450等。据报道，血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）在心脏纤维化发生发展中发挥关键性作用，主要通过诱导血管中NOX介导的ROS合成，促进心脏纤维化的发展[12]。Ma等[8]研究了隐丹参酮对AngⅡ诱导的心脏纤维化的作用，结果发现隐丹参酮能够通过减少纤维连接蛋白（FN）和结缔组织生长因子（CTGF）的产生，抑制促纤维化基因的表达和ECM的积累，进而预防心脏纤维化。此外，它还可以通过降低环氧化酶2（COX-2）、NOX-2和NOX-4的表达水平减少ROS生成，起到改善心脏功能的作用。同时，作者还研究了隐丹参酮对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的作用，发现隐丹参酮能够抑制ERK1/2的激活，对P38 MAPK和JNK的激活没有影响。以上结果表明，隐丹参酮可能通过抑制ERK1/2磷酸化，影响COX-2、FN、CTGF等的表达，从而起到缓解心脏纤维化的作用。
MMP-2和MMP-9系基质金属蛋白酶（MMPs）家族的重要成员，与ECM的重塑密切相关，在心脏纤维化及心血管疾病中发挥重要作用[13-14]。Tao等[15]研究隐丹参酮对异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化的影响，发现隐丹参酮能够有效改善异丙肾上腺素引起的心肌细胞排列紊乱、心脏顺应性下降和僵硬度增加等病理变化，其主要作用机制是通过激活MMP-2加速ECM降解从而达到缓解心脏纤维化的作用。此外，Shih-Hsiang等[14, 16]研究还发现隐丹参酮可以降低1型糖尿病大鼠心肌纤维化模型中STAT3、CTGF和MMP-9的蛋白表达水平，改善糖尿病引起的心功能受损和心肌纤维化。
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肺纤维化（PF）是间质性肺病的终末期，其病理特征是肺实质的破坏、ECM的沉积以及成纤维细胞和肺泡上皮细胞表型发生变化。PF包括早期炎症和晚期纤维化两个病理过程。首先，由外界刺激引起肺上皮细胞损伤，受损的细胞能够刺激产生各种炎症细胞因子，引发炎症反应；同时，为了防止自身死亡，受损细胞还会诱导产生促增殖和促纤维化细胞因子，最终导致肺纤维化。早期炎症反应是导致继发性损伤的主要机制之一，其中包括激活转录因子，释放下游炎症细胞因子。
TGF-β、IL-1β、IL-6和IL-10等细胞因子在肺纤维化发展过程中扮演重要角色。巨噬细胞是炎症早期TGF-β的主要产生者，TGF-β作为促纤维化细胞因子可直接诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，促进成纤维细胞的生长、活化和胶原合成[17]。诸多研究表明，受TGF-β影响，上皮细胞亦可经上皮间质转化（EMT）过程获得多种间质细胞表型，从而参与PF的形成[ 18, 19]。Jiang等人[20]研究隐丹参酮对大鼠放射性肺损伤（RILI）的治疗作用，发现隐丹参酮能改善辐射诱导的肺系数增加、肺形态异常、肺泡间隔增厚和胶原纤维聚集等病理特征，其主要作用机制可能是通过降低TGF-β1、IL-6、IL-10、NOX-4和CCL3/CCR1等炎症因子的表达,促进基质金属蛋白酶MMP-1的表达，从而达到改善肺纤维化的作用。 Zhang等[9]研究隐丹参酮对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的疗效，结果发现低浓度隐丹参酮能够有效降低ECM的沉积，如FN、Ⅰ型胶原（Col-1）和Ⅲ型胶原蛋白（Col-3）等，并且随着给药浓度的增加，E-cadherin显著增加，α-SMA显著降低。除此之外，研究还发现隐丹参酮不仅能够抑制经典的TGF-β/Smad信号通路，还可以抑制JAK/STAT信号通路，这提示隐丹参酮治疗肺纤维化的机制可能与抑制上述信号通路诱导的EMT过程相关。
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肝纤维化是肝脏损伤后发生的伤口愈合反应，是一个动态可逆过程。ECM过度沉积是肝纤维化的主要病理特征，肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化的核心事件[21]。引发肝纤维化的诱因有饮酒、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和胆汁淤积性肝病等[22]。肝炎是肝纤维化发展的必经阶段，因此，抗炎也被认为是防治肝纤维化的重要策略。
炎症小体是控制炎症反应和协调抗菌宿主防御的多蛋白信号平台，炎症小体的组成之一NLRP3是表征最好的炎症体，NLRP3被激活后会自我寡聚化并募集衔接蛋白ASC，激活pro-caspase1介导促炎细胞因子的成熟和分泌，引起NASH。
Liu等[2]研究发现隐丹参酮能够剂量依赖地抑制NLRP3炎症小体激活物诱导的caspase-1 p20激活、IL-1β分泌和LDH释放。Ca2+是NLRP3激活的重要因素之一，在ATP诱导的骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）内，隐丹参酮能够以剂量依赖的方式抑制Ca2+的动员和线粒体活性氧（mtROS）的生产，进而抑制NLRP3炎症小体的激活。此外，研究还发现隐丹参酮能够通过抑制NLRP3，减少IL-7A的表达，进而缓解NASH。
Nagappan等[23]研究了隐丹参酮对乙醇诱导的酒精性肝病的疗效和机制，发现隐丹参酮通过激活AMPK/SIRT1通路减少肝脏脂肪生成和增加脂肪酸氧化来改善乙醇诱导的酒精性肝病。此外，隐丹参酮还可以通过调控NF-κB信号通路降低由乙醇引起的tnf-α、il-6和mcp1等炎症基因的mRNA水平。综上所述，隐丹参酮抗肝纤维化的可能作用机制与其激活AMPK/SIRT1信号转导和抑制NF-κB的活化有关。
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肾纤维化是许多慢性肾病（CKD）的常见结果，其主要病理特征是成纤维细胞和ECM的过度积累以及功能性肾单位的丧失[24]。已有研究发现，肾纤维化是由多种介质、机制和途径介导的，如：细胞因子、转化生长因子-β和核转录因子等。肾间质纤维化是多数进行性肾病中肾功能丧失的主要原因，而炎症反应和氧化应激损伤是肾间质纤维化发展的主要驱动力。
动物研究表明，隐丹参酮能够有效预防和治疗单侧输尿管梗阻（UUO）[7, 10]。Liang等[10]研究发现隐丹参酮能够显著降低UUO小鼠肾脏中FN和Col-1的表达，减少巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，具有直接的抗纤维化作用。进一步研究发现该作用可能是通过阻断NF-κB和Nrf-2/HO-1信号转导抑制小鼠炎症反应和氧化应激实现的。Smad通路和非Smad通路p38 MAPK是涉及肾纤维化和EMT的主要下游信号转导机制，可激活整合素β1，整合素β1是一种介导细胞与ECM之间相互作用的细胞膜表面糖蛋白受体家族分子，在肾脏的纤维化和修复过程中起重要作用。Zhang等[7]研究发现隐丹参酮对MAPK信号没有影响，但能够选择性抑制Smad3的磷酸化和整合素β1启动子活性。以上结果表明，隐丹参酮主要通过抑制NF-κB和经典的Smad信号通路起到治疗肾纤维化的作用。
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隐丹参酮具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗纤维化、抗肿瘤和抗菌以及心血管保护作用，其在抗纤维化方面作用尤为显著。尽管各种器官纤维化的病理表现不尽相同，但是其病理过程均与ECM代谢失常、EMT发生发展、成纤维细胞的活化、关键细胞因子以及信号通路的激活有显著的相关性。体内体外研究表明，隐丹参酮抗纤维化的可能机制有：①调控STAT3、NF-κB、TGF-β/Smad和MAPK信号通路，减少胶原蛋白和纤维的形成。②调控MMPs和TIMPs，影响纤维的生成和降解。③调控α-SMA、Col-1和Col-3的蛋白表达水平。④调控细胞的氧化应激途径，逆转纤维化。⑤调节免疫，减轻炎症。虽然目前已有多项研究证实了隐丹参酮在体内外的抗纤维化作用，但是大部分的研究仍处于初始阶段, 其抑制组织ECM积累、EMT发展、炎性介质释放等具体作用机制仍需进一步深入研究。此外，由于隐丹参酮的水溶性较差，对其进行结构改造和修饰，以增加水溶性和生物利用度也是值得关注的重要问题。
综上所述，隐丹参酮作为一种高效低毒的天然化合物，在各器官组织中具有良好的抗纤维化作用，期待通过进一步明确其关键作用靶点和改善生物利用度，早日实现其在抗纤维化方面的临床应用。
Research progress of cryptotanshinone on anti-fibrosis and its mechanism
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摘要: 隐丹参酮（CTS）作为一种高效低毒的天然化合物，在各器官组织中具有良好的抗纤维化作用，但目前其作用机制尚未明确，且无系统的文献综述对其抗纤维化潜在机制进行描述。笔者综述了隐丹参酮治疗各脏器纤维化的疗效及其机制，并提出了未来展望。Abstract: As a natural compound with high efficiency and low toxicity, cryptotanshinone (CTS) has a good anti-fibrosis effect in various organs and tissues. However, its mechanism of action has not been clearly defined, and there is no systematic literature review to describe its potential anti-fibrosis mechanism. The efficacy and mechanism of cryptotanshinone in the treatment of fibrosis in various organs were summarized and the use prospects were put forward in this paper.
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Key words:
- cryptotanshinone /
- renal fibrosis /
- pulmonary fibrosis /
- cardiac fibrosis /
- liver fibrosis /
- mechanism
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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