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胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤之一，占恶性脑肿瘤的70%以上，具有恶性程度高、侵袭性强、治疗效果及预后差等特点，临床主要治疗手段为手术切除、放化疗或两者联合治疗[1]。然而，血脑屏障（BBB）的选择通透性以及肿瘤细胞的多药耐药（MDR）特点给胶质瘤的治疗带来了挑战[2]。
BBB指的是位于中枢神经系统的一种无孔微血管结构，主要由血管内皮细胞以及位于内皮细胞层囊腔表面的壁细胞组成[3]。BBB的主要功能是维护大脑内环境的稳态，严格管控物质进出大脑，保障大脑功能的正常运行。然而，这种保护作用限制了很多药物进入脑内，使得一些治疗脑部疾病的药物难以在病灶部位达到有效药物浓度，成为药物治疗脑部疾病的重要制约因素[3-4]。
冰片属芳香开窍类中药，又名2-茨醇，属于小分子脂溶性双环单萜类物质，其主要有效成分为龙脑。在《中国药典》2020版中，收录的冰片有两种：一种通过人工合成而得，名为冰片，又名合成龙脑；另一种为经樟科植物樟[Cinnamomum cam phora(L.)Presl]的新鲜枝、叶提取加工而得的天然冰片，又名右旋龙脑[5]。现代药理学研究表明冰片具有促进药物透过各种体内外屏障，抗菌、保护心脑血管、镇痛抗炎以及防止血栓等多种药理作用[6-7]。近年来，许多研究表明冰片与抗胶质瘤的化疗药物联合应用，可以明显提高化疗药物的生物利用度和治疗疗效，本文就近年来冰片对胶质瘤化疗的辅助治疗临床前研究作一综述，以期为胶质瘤的临床治疗提供新的思路。
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冰片作为一种新型的单萜类化学增敏剂，可以增加体内外BBB的通透性，当冰片与化疗药物联用时，可促进化疗药物顺利透过BBB进入肿瘤部位，从而提高化疗药物的生物利用度和疗效。
冰片能改善化疗药物的药动学，提高药物在肿瘤部位的蓄积。例如，段美美等[8]在考察天然冰片对顺铂在大鼠原位C6脑胶质瘤模型体内药动学及脑组织分布的影响中发现，在血浆中，与0.5%CMC-Na的溶媒对照组相比，冰片高剂量联用组t1/2β、Cmax显著增大，AUC显著减小；而在脑组织中，与溶媒对照组相比，冰片高、低剂量联用组AUC均显著增大，这说明天然冰片使顺铂更多的向脑组织转运，提高了顺铂在脑组织的生物利用度。此外，组织病理学观察发现，联用组的胶质瘤细胞核密度降低，细胞凋亡率升高。类似地，郭军洽等[9]同样证明了天然冰片可促进甲氨蝶呤(MTX)透过BBB，提高其在病灶部位的生物利用度，并且发现MTX药动学参数的改变与冰片呈剂量相关性，高剂量冰片能显著提高MTX的瘤区脑组织生物利用度。由此可见，冰片可以有效提高化疗药物的BBB透过率，改善药物在脑组织的生物利用度，为促进化疗药物增效提供有力的依据。
吉西他滨是一种临床上用于非小细胞肺癌和胰腺癌的化疗药物，有研究发现，瘤腔内直接注射吉西他滨对脑胶质瘤的治疗效果良好[10]，但由于该药水溶性较大，因此静脉给药后吉西他滨难以透过血脑屏障，脑部的生物利用度很低。张帆等[11]考察了冰片对吉西他滨药动学的影响，通过构建大鼠原位9Lacz胶质瘤模型，采用微透析法收集给药后脑肿瘤部位的脑脊液，实时监测冰片对吉西他滨在大鼠脑组织的浓度变化。结果发现，与单用吉西他滨组比较，吉西他滨联合冰片给药组Cmax及AUC均增加，t1/2延长，表明冰片提高了吉西他滨在9Lacz脑胶质瘤模型大鼠脑肿瘤区域的生物利用度。
为客观评价药动学的改善带来的确切疗效，进一步探究冰片对化疗药物抗胶质瘤的促进作用，有学者进行了两者联合用药的药效学研究。范成普等[12]在大鼠C6脑胶质瘤模型中将冰片和替莫唑胺联合应用，探讨了冰片对替莫唑胺疗效的影响。结果发现，与空白对照组、单用替莫唑胺组以及单用冰片组相比，冰片联合替莫唑胺组的肿瘤体积显著减小；另外，肿瘤组织HE染色显示，肿瘤细胞核密度以及细胞凋亡率与其它三组相比最低，细胞增殖受到抑制。该实验说明了冰片可以促进肿瘤细胞凋亡、减小肿瘤体积，增强替莫唑胺的抗胶质瘤作用。
冰片还可以与纳米药物联合应用提高药物的靶向性。CCKRK肽是一种与肿瘤新生血管内皮细胞的硫酸乙酰肝素受体高度亲和的配体[13]。Lv等[14]将冰片与CCKRK肽修饰的紫杉醇前药自组装氧化还原响应纳米粒（CGKRK-PSNPs）联用，结果发现，冰片可增强CGKRK-PSNPs在体外血脑屏障模型中的转运；在裸鼠颅内U87MG胶质瘤中，通过实时荧光图像观察到CGKRK-PSNPs与冰片联用时药物的较高积累，且裸鼠中位生存期(39天)延长，这表明冰片促进了CGKRK-PSNPs纳米粒进入BBB，从而提高其抗胶质瘤疗效。
以上研究通过构建动物胶质瘤模型，通过灌胃冰片结合化疗药物注射的方式将两者联合应用研究了冰片对化疗药物的影响。一方面，从药动学的角度阐明了冰片可以有效促进化疗药物透过BBB，提高脑组织生物利用度；另一方面，通过药效学实验结果证明了冰片可以提高化疗药物的抗胶质瘤效果。
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研究发现，纳米递药系统能够帮助药物更好地穿过BBB，在中枢神经系统发挥治疗作用[15]。因此，在基于冰片能促进药物跨BBB的基础上，有学者尝试将冰片与化疗药物共载于纳米递药系统中，形成冰片药物复合纳米粒，以期更方便更高效地将化疗药物靶向递送至脑组织。
经冰片修饰的多柔比星纳米粒能提高其在小鼠体内的抗胶质瘤效果。Meng等[16]将冰片与DSPE-PEG(2000)-COOH结合，合成了一种新型载体DSPE-PEG(2000)-BO，并将多柔比星载入其中，利用该载体通过静电自组装法制备了冰片修饰的负载阿霉素的纳米胶束(DOX BO-PMs)。体外研究结果显示，DOX BO-PMs显著提高了多柔比星通过BBB的运输效率以及抑制胶质瘤细胞增殖的作用；体内药效学研究显示，DOX BO-PMs显著抑制胶质母细胞瘤的生长和转移。
研究发现，冰片与京尼平苷经鼻灌注联合给药，京尼平苷的生物利用度增加[17]，这说明冰片可以促进药物在鼻腔的吸收。赵等[18]采用乳化-溶剂挥发法制备出一种载多西紫杉醇的经鼻给药纳米靶向系统(DTX-Bo-RGD-NPs) ，该给药系统由冰片与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）共同修饰。利用荧光染料Dir与纳米粒结合，经大鼠C6胶质瘤模型评价了DTX-Bo-RGD-NPs的体内靶向性，结果发现，DTX-Bo-RGD-NPs中的Dir在脑肿瘤组织中的荧光强度是未加冰片修饰的（DTX-RGD-NPs）1.74倍；C6大鼠脑胶质瘤原位模型药效学结果显示，DTX-RGD-NPs组荷瘤大鼠生存期为18.5天，而DTX-Bo-RGD-NPs组的生存期为21天；DTX-Bo-RGD-NPs的肿瘤细胞凋亡率是DTX-RGD-NPs的1.40倍。这说明冰片与化疗药物共载显著提高经鼻给药的纳米药物向脑组织转运，有望为难治性疾病脑胶质瘤的治疗提供一种新型的经鼻给药治疗手段, 提高难治性脑胶质瘤的治疗效果。
冰片与化疗药物共载制备成纳米给药系统相比普通单一药物的纳米粒表现出更强的脑靶向作用。与直接联用相比，共载的形式将更方便于临床使用，但是冰片与药物物理混合还是共修饰或共载的效果比较还有待研究。
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活性氧(ROS)是由线粒体和其他细胞器产生的一组寿命较短、高活性的含氧分子，可诱导DNA损伤[19]。癌细胞区别于正常细胞的特征之一是它们能够产生更多的ROS，以及它们对抗氧化防御系统的依赖性增强[20]。许多化疗药物可通过诱导ROS产生，促进胶质瘤细胞的凋亡[7,21-23]，现在一些研究发现冰片也具有相同促进作用。
冰片与化疗药物联用可增加ROS的产生达到增强抗胶质瘤效果。Cao等[24]发现天然冰片联用顺铂使U251细胞活力降低，亚G1期细胞数量增加；免疫印迹实验表明天然冰片通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases) 和触发ROS过度产生来促进顺铂诱导肿瘤细胞凋亡；郭源源等[25]也同样发现冰片通过增加细胞ROS水平增强紫杉醇的抗U87细胞作用。Liu等[26]利用冰片增强ROS产生的特点，将天然冰片与抗胶质瘤药物替莫唑胺联用，发现裸鼠U251胶质瘤模型的肿瘤体积相比对照组显著减小。
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紧密连接是维持BBB功能的重要组成部分，控制着依靠浓度梯度被动运输进入大脑的物质。紧密连接由闭锁蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)、连接黏附分子家族(JAM)以及与它们相连的紧密连接蛋白(ZO)组成[27]。
冰片可逆性开放紧密连接。陈艳明等[28]在体外血脑屏障模型的研究中发现，冰片能使细胞间紧密连接变得松散、细胞吞饮囊泡增大、数量增多，而移除冰片24 h后上述作用消失，这说明冰片开放BBB的作用可逆。
Duan等[29]在大鼠C6胶质瘤模型中研究了天然冰片对BBB通透性的影响，通过顺铂在大鼠脑内的浓度变化评价天然冰片对BBB的开放程度，结果发现，与对照组相比，冰片低剂量组和高剂量组中顺铂在脑组织的生物利用度显著提高；免疫组化及ELISA实验表明冰片可逆下调了ZO-1和纤维型肌动蛋白（F-actin）的表达水平。这说明冰片可能通过下调紧密连接相关蛋白的表达增加了BBB的通透性，从而促进了顺铂进入脑内。
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P-糖蛋白（P-gp）是一种由MDR基因编码的糖蛋白，主要存在于血管内皮细胞中，参与各种药物和毒素的外排，P-gp在肿瘤细胞中大量表达是导致肿瘤细胞耐药的主要原因，后续研究发现P-gp在血脑屏障毛细血管上也有大量表达[30-32]。因此，克服P-gp的外排作用一方面可以使化疗药物更多的透过血脑屏障，提高并维持药物在脑脊液的浓度；另一方面也可以减少肿瘤细胞的耐药性。
维拉帕米是一种P-gp抑制剂，研究发现维拉帕米能够在体外逆转P-gp引起的耐药性[33]。陈艳明等[34]研究表明冰片可以通过抑制细胞膜上P-gp的活性明显地增强长春新碱所致人宫颈癌细胞系（Hela）和犬肾细胞系（MDCK）的细胞毒性，而这种作用与P-gp拮抗剂维拉帕米相似。Tang等[35]制备出一种共载冰片和紫杉醇的脂质白蛋白纳米粒(BOR/PTX LANs) ，以P-gp抑制剂环孢霉素A作为阳性对照，发现冰片通过抑制P-gp的外排作用增加C6细胞对紫杉醇的摄取。
Wang等[36]以维拉帕米作为阳性对照，以罗丹明123（Rh123）的大鼠肠吸收参数和表观渗透系数（Papp）为考察指标研究冰片对P-gp的影响。结果发现，冰片显著增加Caco-2细胞对Rh123的吸收，提高Rh123在大鼠空肠和回肠的吸收速率和Papp，该实验证实了冰片可以抑制肠道中P-gp的表达。Yu等[37]发现大鼠口服冰片后海马体和下丘脑中的Rh123明显增加，说明冰片对这两个区域中P-gp的抑制作用较强。进一步通过蛋白表达实验和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）发现冰片对P-gp的抑制作用与降低海马体和下丘脑中多药耐药基因1a（MDR1a）、多药耐药蛋白基因1b（MDR1b）、多药耐药蛋白1（Mrp1）有关。
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缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一种转录因子，在肿瘤细胞的缺氧微环境中被激活，有研究发现HIF-1α的表达水平与胶质瘤的病理分级呈正相关[38]。
合成冰片通过靶向mTORC1/eIF4E通路下调HIF-1α表达，诱导原发胶质瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤生长。Wang等[39]研究了合成冰片对大鼠C6胶质瘤移植模型以及人原发性胶质瘤细胞增殖的抑制作用。研究结果表明，与对照组相比，冰片组显著地抑制了肿瘤生长，诱导胶质瘤细胞凋亡，且具有浓度依赖性；蛋白印迹实验表明冰片可以下调Bcl-2的表达，上调Bax和caspase-3的表达；而在细胞转染了过表达HIF-1α的质粒后，这种作用被逆转，这说明冰片是通过HIF-1α介导诱导人原代培养胶质瘤细胞凋亡。此外，还发现mTORC1 siRNA抑制了eIF4E的表达，eIF4E siRNA抑制了HIF-1α的表达，提示mTORC1/eIF4E通路参与缺氧条件下人脑胶质瘤原代培养细胞HIF-1α的表达调控。
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冰片与化疗药物联用增加药物透过BBB，提高病灶部位有效药物浓度，增强抗胶质瘤效果；冰片与化疗药物共载制备成冰片药物复合纳米粒使纳米粒的靶向性进一步增强，给药更加方便。冰片增效作用机制主要包括诱导ROS产生，增强对肿瘤细胞的DNA损伤作用；打开BBB的紧密连接，提高化疗药物生物利用度；抑制P-gp，有效逆转肿瘤细胞的MDR；下调HIF-1α的表达，诱导胶质瘤细胞凋亡等。冰片的辅助作用有效地改善化疗药物对胶质瘤细胞的多药耐药性，降低血脑屏障对化疗药物的阻碍与外排作用。但值得注意的是，基于冰片与化疗药物联合应用于胶质瘤的研究还处在临床前研究阶段，目前也暂无相关制剂上市，要实现从实验室到临床的转变还需解决一些问题，比如冰片种类的选择、冰片增效的安全有效剂量范围等。冰片与化疗药物联用及共载达到靶向增效目的是一种新型的给药策略，有望为胶质瘤的临床治疗提供新的思路与方法，具有广阔的开发前景。
Advances in preclinical studies on borneol as an adjuvant for glioma
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摘要: 胶质瘤是一种常见的原发性恶性脑肿瘤，目前临床主要治疗手段为手术切除联合放化疗，但由于血脑屏障的选择通透性和肿瘤细胞的多药耐药性特点，使得治疗效果并不理想。近年来，研究发现冰片具有开放血脑屏障以及促进化疗药物渗透的作用，冰片与化疗药物联用或共载，化疗药物能更多地靶向胶质瘤组织，增加疗效。本文就近年来冰片与化疗药物联合应用的临床前研究进行综述，以期为胶质瘤的治疗提供有益参考。Abstract: Glioma is a common primary malignant brain tumor. At present, the main clinical treatment is surgical resection combined with radiotherapy and chemotherapy. Due to the selective permeability of the blood-brain barrier and the characteristics of multi-drug resistance of tumor cells, the therapeutic effect is not ideal. In recent years, studies have found that borneol could open the blood-brain barrier and promote the infiltration of chemotherapy drugs. When borneol is combined with or co-carried with chemotherapy drugs, chemotherapy drugs could target more glioma tissues and increase efficacy. The preclinical studies on the combination of borneol and chemotherapy drugs in recent years were reviewed in this article, in order to provide useful reference for the treatment of glioma.
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Key words:
- glioma /
- borneol /
- chemotherapy /
- blood-brain barrier
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乳腺癌是多发于女性中的恶性肿瘤性疾病，威胁着广大女性的健康[1-2]。据统计，全球女性癌症中，乳腺癌发病率和致死率均高于肺癌，目前居于首位，2020年约230万人诊断出患有乳腺癌，致死病例约68.5万[3]。先天性因素、膳食、环境、工作、发育成长阶段及雌激素类药物等多种因素都能成为乳腺癌的诱发因素[4-5]。目前，乳腺癌早期诊断普遍使用的是影像学检查（临床乳腺体格检查、超声、乳腺X线摄影、磁共振成像等）[6]以及肿瘤标志物(CEA、CA153、VEGF、TSGF等)临床筛查[7]，前者操作复杂且具有一定的组织伤害性[8]，后者局限于需多项联合检测且特异性不高[7，9]，均难以满足临床需求。尽管手术、化疗技术在不断提高，但是抗肿瘤药物疗效有限，乳腺癌患者预后效果不佳，尤其是晚期复发和转移普遍。因此，寻找乳腺癌细胞早期代谢生物标志物，进行安全灵敏的早期诊断，对于乳腺癌诊疗具有重要意义[10]。
作为继基因组学、转录组学、蛋白质组学的后起之秀，代谢组学以研究不同病理生理或基因突变条件下对机体内源性小分子化合物代谢变化为核心[11]。内源性小分子化合物是基因和蛋白质的下游产物，从分子生物层面实时动态地反映上游基因及外部因素对机体功能的影响[12]。代谢组学采用以高灵敏度、高通量为特征的现代仪器分析技术方法，对机体的内源性小分子化合物进行动态分析[13]。伴随乳腺癌发展，患者机体内与氨基酸、糖类、脂质等代谢有关的小分子代谢物会发生异常变化。利用代谢组学方法，将改变的内源性代谢物作为生物标志物，在此基础上寻找相关代谢途径，合理推测乳腺癌的发病机制，揭示生物标志物与乳腺癌发生发展间的关联，最终帮助乳腺癌的临床诊疗。本文主要综述代谢组学在乳腺癌早期诊断、药理研究与药效评估、疾病进程监测以及预后评估的研究进展。
1. 代谢组学概述
代谢组学以相对分子质量<1000的内源性代谢物为研究对象，研究样本包括血浆、尿液、唾液、脑脊液、细胞以及组织提取液等[14-16]，其中，血液和尿液最为常见[17]，研究思路为收集生物样品、样品分离、检测鉴定、分析数据、建立模型、获取细胞活动终产物信息，整个过程综合分析优势明显。按照研究目的分类，非靶向代谢组学和靶向代谢组学是两种常见策略[18]，前者进行轮廓分析，旨在获得较多的生物体内源性代谢物[12]，后者通过靶向分析，希望获得特定的内源性代谢物[19]。
代谢组学目前主流的仪器分析方法为核磁共振法(NMR)和质谱（MS）联用技术，后者主要包括液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[20]，以上分析技术各有其特点。NMR可获取大量的物质结构信息，所得样品分析无偏向、无损伤但灵敏度较低[21]。MS通过有损的离子化分析，提供物质分子量及结构信息，灵敏度更高、扫描速度快[22]，常与色谱在线联用以实现分离分析功能。GC-MS灵敏度高但不适用于热稳定性差的样品的分析，LC-MS则克服了GC-MS的劣势，可分析难挥发、热不稳定物质，分离选择性好、效率高，分析时间也随超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）的推广得到进一步缩短，因此LC-MS实际应用范围更广[19，23]。近年来质谱成像（MSI）技术发展迅速，随之空间代谢组学作为代谢组学新的补充诞生，解决了传统代谢组学研究代谢物在组织中的空间信息缺失问题[24-26]。
代谢组学的数据分析步骤为数据预处理、数据归一化和数据统计，即通过数据的过滤、补齐、归一化等去除仪器或生物偏差后，利用统计方法处理代谢组数据，其中，统计方法是从高维复杂的数据中提取出有效信息的关键。统计方法按照变量的多少分为单变量统计方法和多变量统计方法。常用的单变量统计方法有t检验、非参数检验、方差分析，主要用于实验-对照类研究中寻找两组间的差异代谢物[27]。多变量分析方法有传统算法和机器算法两类，常用的传统算法有偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）[28]及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA)、主成分分析（PAC），以上又称为模式识别方法，适用于构建预测模型[29]。机器算法应用日益广泛[30]，目前常用的有随机森林（RF）[31]、支持向量机(SVM)[32]、神经网络(ANNs)[33]等。经以上手段获取具有统计学意义的数据，再与多种生化及代谢的数据库对比，继而对所得物质筛选鉴定，最终寻找到潜在的代谢标志物。
2. 代谢组学在乳腺癌中的应用
2.1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中的应用
Catarina等[34]采用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析了40位BC患者和38位对照（CTL）健康志愿者尿液代谢谱，采用K-S非参数检验和t检验及OPLS-DA等模式识别方法，发现BC患者肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等代谢物表现出高敏感性和特异性，代谢途径分析表明，差异代谢物出现可能与BC患者甘氨酸、谷氨酸、丁酸、糖酵解、TCA循环、牛磺酸和丙酮酸代谢途径遭到破坏有关。获得的差异代谢物具有作为生物标志物的潜力，可将BC患者与CTL区分，应用于早期诊断。
约1/4乳腺癌细胞都是三阴性乳腺癌细胞（TNBC），其特点是易转移浸润且复发率高[16]。Fang等[35]基于早期发现的40种氨基酸目标化合物，使用亲水作用色谱法-串联质谱（HILIC-MS/MS），对TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞36种细胞内和34种细胞外小分子物质进行代谢组学分析。运用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验及OPLS-DA模式识别方法研究，发现与正常细胞相比，两种乳腺癌细胞氨基酸代谢库均明显扩大；与非TNBC相比，TNBC细胞内谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰丝氨酸和N-乙酰甲硫氨酸代谢明显增加(变化倍数>2，P<0.01, VIP>1)，TNBC对细胞外谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸和赖氨酸摄取显著增加，对谷氨酸和L-半胱氨酸-谷胱甘肽排泄升高(P<0.01，VIP>1)。研究结果表明，TNBC细胞具有独特的氨基酸代谢特征，对其量化分析可为TNBC患者提供更多新的早期治疗目标靶点。
Daniele等[36]使用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF/MS），对23名BC患者和35名口腔健康妇女唾液进行非靶向代谢组学分析，使用t检验、卡方检验等单因素统计方法，对比METLIN数据库，鉴定出乳腺癌组中有31种化合物上调（P<0.05），其中，患者与健康人群相比，发现7种寡肽（H-Arg-Arg-Ser-OH，H-His-Lys-(Ala-Ser)-OH or (Gly-Thr)-OH，H-Ala-Lys-Phe-Trp-OH or H-Gly-Lys-Thr-Ser-OH or H-Arg-Arg-Ser-Ser-OH，H-Phe-Ile-Gln-Arg-OH，H-Glu-Phe-Gln-Arg-OH or H-Ile-Lys-Gln-Trp-OH，H-Phe-Lys-Lys-Trp-OH or H-Phe-Gln-Arg-Tyr-OH，H-Phe-Phe-Gln-Trp-OH）和6种甘油磷脂（PG14∶2、PA32∶1、PS28∶0、PS40∶6、PI31∶1、PI38∶7）表达上调，表现出明显的代谢差异，说明唾液代谢物有望区分乳腺癌患者和健康人群，适用于早期诊断。
依据不同亚型乳腺癌患者的代谢物差异性可以用于乳腺癌诊断甚至个性化治疗。Leticia等[37]采集了4种常见LA型、LB型、HER2+型和TN型乳腺癌患者和健康对照组的血浆样本，利用非靶向超高液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）代谢组学方法进行分析，通过单变量非参数Wilcoxon秩和检验区分乳腺癌患者和健康受试者的数据差异，多变量PAC和PLS-DA评价统计模型质量，初步确定了4种乳腺癌分子亚型中变化显著的代谢物：LA，TN和HER2分子亚型患者血浆中L-色氨酸浓度显著降低，可能与L-色氨酸代谢激活芳烃受体帮助癌细胞免疫逃逸有关[38]；4种亚型乳腺癌患者磷酸乙醇胺、磷脂血浆浓度降低，提示乳腺癌中脂质代谢差异具有重要意义。上述代谢组学数据表明，色氨酸和部分脂质具有作为乳腺癌诊断的生物标志物潜力，有望推动乳腺癌患者血浆诊断和个性化治疗的发展。
基于以上研究，笔者对代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现部分特征代谢物的应用进行归纳总结，见表1。
表 1 代谢组学在乳腺癌早期诊断中发现的特征代谢物作者 样本来源 技术方法 统计学方法 特征代谢物 Catarina等 尿液 1H-NMR K-S非参数检验和t检验与PAC,PLS-DA和OPLS-DA 肌酸、甘氨酸、丝氨酸、二甲胺、三甲胺N-氧化物、
α-羟基异丁酸酯、甘露醇、谷氨酰胺等Fang等 TNBC、非TNBC及正常的乳腺上皮细胞 HILIC-MS/MS Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验与OPLS-DA 胞内：谷氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、
N-乙酰丝氨酸、N-乙酰甲硫氨酸
胞外：谷氨酰胺、丝氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸谷氨酸、
L-半胱氨酸-谷胱甘肽Daniele等 唾液 UPLC-Q-TOF-MS t检验、卡方检验等 7种寡肽和6种甘油磷脂 Leticia等 血浆 HPLC-HRMS 非参数Wilcoxon秩和检验、PAC、PLS-DA 色氨酸、磷酸乙醇胺、磷脂 综上所述，基于代谢组学，针对不同乳腺癌患者所能提供的研究样品，采用合适的仪器、数据分析方法获取差异显著的内源性小分子代谢物信息，有效减小检查手段对乳腺癌患者造成的机体损伤，并丰富乳腺癌早期诊断方法，使代谢组学成为乳腺癌早期诊断的有力辅助工具。
2.2 代谢组学在乳腺癌药理研究和药效评价中的应用
癌细胞无限增殖需要大量的能量和物质基础。癌细胞具有特殊的代谢方式，即在有氧条件下倾向于糖酵解而不是三羧酸循环来产生能量[39]，这种新陈代谢重编程称为Warburg效应[40]。一方面，糖酵解中间产物可以合成肿瘤细胞生长所需蛋白质和脂质等生物大分子[41]，同时线粒体损伤可限制丙酮酸进入，使更多丙酮酸在胞质内通过无氧氧化释放能量[42]。另一方面，癌细胞可持续摄取营养物质[43]以及通过加强糖异生途径弥补Warburg效应缺陷。基于癌细胞特殊的代谢重编程，通过药物代谢组学分析，监测机体用药后内源小分子代谢物变化有利于乳腺癌药理研究和药效评估。
Ghanem等[44]对经抗坏血酸处理的管腔和基底样乳腺癌细胞，进行了代谢组学分析，结合细胞存活率数据，发现高剂量抗坏血酸使得乳腺癌细胞糖酵解过程中磷酸丙糖途径（PPP）被严重破坏，ATP水平下降，代谢物重新定向积累为脂质小滴，以及磷酸戊糖途径中代谢物和酶活性增加；细胞死亡依赖于抗坏血酸诱导的氧化应激和ROS积累、DNA损伤以及细胞内辅助因子(包括NAD+/NADH)耗竭效应。综上表明，高剂量抗坏血酸通过诱发乳腺癌细胞“氧化还原危机和能量灾难”发挥细胞毒作用。
Arminan等[45]通过NMR技术检测及主成分分析方法分析处理数据，以评估在N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-阿霉素共聚物（HPMA-Dox）影响下体外细胞培养模型和体内原位乳腺癌模型的精准抗癌效果，并结合蛋白质表达和流式细胞技术，研究了给药前后原位乳腺癌患者内源性小分子化合物相关生化改变，发现与游离Dox给药相比，用HPMA-Dox进行治疗后，乳腺癌细胞凋亡增加，糖酵解减弱，磷脂水平降低，且HPMA-Dox在体内模型的血液循环时间增加，同时肿瘤储积高、心脏储积低，说明HPMA-Dox药代动力学加强、组织分布得以优化。提示HPMA-Dox可作为一种更精确的抗癌药物模式用于乳腺癌临床治疗。
Panis等[14]将120名单侧乳腺浸润性癌患者随机分为未经化疗组(CA组，n=50)、单剂量短期紫杉醇静脉滴注组(PTX组，n=30)、心脏剖面健康组(CTR组，n=40)，采用LC-MS对其血浆样品进行分析后发现，与CA组乳腺癌患者相比，单剂量短期紫杉醇静脉滴注可使患者血浆高密度脂蛋白水平显著降低，过氧化氢水平升高；与CTR组相比，PTX组患者C反应蛋白和肌酸激酶分数明显升高。以上表明单剂量短期紫杉醇静脉滴注就足以引起脂质代谢显著改变，可能导致毒性累积效应，进一步增加乳腺癌患者心脏病发生风险。可见，代谢组学可参与化疗药物给药优化方案研究，提高药物抗癌效果。
左旋肉碱、酰基肉碱和相关酶是癌症代谢网络中的重要介质。以往研究中LC-MS对乳腺癌中左旋肉碱、酰基肉碱的研究都是均质组织分析，缺乏异质性癌症组织中肉碱的空间分布差异[46]。Sun等[47]利用MSI对异种移植小鼠模型和人类癌组织样本及正常组织中的17种肉碱进行成像并开发了高空间分辨率基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）方法，发现由170个癌症样本和128个正常样本组成的肉碱谱模型能准确区分乳腺癌，L-肉碱和短链酰基肉碱在人类乳腺癌和异种移植小鼠模型中都有显著改变，乳腺癌中由肉碱系统介导的β氧化代谢途径改变，并且首次发现代谢酶CPT2和CRAT在乳腺癌组织中差异表达。证明肉碱代谢在乳腺癌的代谢物和酶水平上都被重新编程。
2.3 代谢组学在乳腺癌疾病进程监测及预后评估中的应用
心理神经病症(PN)是指许多乳腺癌患者在化疗期间及化疗之后出现疼痛、疲劳和抑郁症状。Debra等[48]使用液相色谱高分辨率质谱法对19位早期乳腺癌女性化疗前后血清样本分别进行非靶向和靶向代谢组学分析，非靶向分析发现化疗后乳腺癌患者乙酰-L-丙氨酸和硫酸吲哚酚浓度升高，5-氧代-L-脯氨酸浓度降低；色氨酸途径靶向分析表明尿氨酸水平、犬尿氨酸/色氨酸水平升高。t检验和Pearson相关系数进一步揭示上述差异代谢物与PN症状显著相关，促进了早期乳腺癌女性PN症状发展程度生物学机制研究。
研究表明，患者他莫昔芬体内代谢物因多昔芬浓度与雌激素受体α(ERα)阳性乳腺癌复发有关[49]，同时他莫昔芬本身和其他代谢物也表现出抗雌激素抗肿瘤活性[50]。Vries等[50]用细胞增殖法测定他莫昔芬、(Z)-因多昔芬、(Z)-4-羟基他莫昔芬、N-去甲基他莫昔芬抗刺激素活性，建立抗雌激素活性评分模型(AAS)，采用Cox回归方法研究AAS与复发的关系，证明因多昔芬浓度可作为他莫昔芬和代谢物抗雌激素作用的代替，与乳腺癌复发显著相关。
Kamil等[51]用LC-MS/MS对小鼠原位接种4T1转移性乳腺癌细胞进行血浆代谢组学分析和脂质组学分析，建立PLS-DA模型。结果显示，荷癌小鼠癌细胞早期转移表现为L-精氨酸代谢减弱，精氨酸酶和多胺合成增强；晚期转移表现为精氨酸代谢途径改变，不对称二甲基精氨酸血浆浓度升高，能量代谢重新编程为糖酵解，戊糖磷酸途径加速以及三羧酸循环速率降低，脂质分布模式改变，包括总磷脂酰胆碱减少，与二酯结合的磷脂分数减少以及溶血磷脂增加，以上代谢变化在一定程度上表征了癌症转移进展。
目前，OncotypeDX 21基因表达检测技术常用来评估乳腺癌的复发以指导乳腺癌治疗，但在临床的不确定性和基因组不一致的情况下，许多早期乳腺癌的患者仍然会受到过度治疗[52-54]。McCartney等[55]利用1H-NMR分析了87例内分泌受体阳性、HER2阴性早期乳腺癌（eBC）患者血清，使用RF建立eBC患者复发风险的统计模型。最终根据代谢组学特征进一步细分复发风险，并有效区分了每个Oncotype风险分类：在7例复发中代谢组学分析准确预测了其中的6例，1例复发发生在低风险组，3例发生在中风险组，3例发生在高风险组，成功建立了一种通过血清代谢组学分析进一步完善OncotypeDX基因检测风险评分的方法。
3. 总结与展望
乳腺癌在全球发病率日益上升，长期困扰广大女性健康，成为全球医疗卫生领域研究焦点[56]。目前，乳腺癌的早期诊断、药物开发应用以及预后测评等方面还需攻克众多难关，迫切需要新的研究技术的支持。代谢组学以高通量、高灵敏度为特征的技术在乳腺癌领域应用日趋广泛，为乳腺癌潜在代谢标志物的筛选，药物靶点发现、药物潜在作用机制等提供新思路[11]。与其他研究方法相比，代谢组学具有无创取样、研究对象相对简单、检测工作量较小、可实现实时监测、全面综合分析等明显优势。同时，代谢组学作为一门新兴组学，虽然已取得部分进展，但本身发展仍处于探索阶段，应用于临床实践还有所不足：代谢组学研究具有数据维度高的特点，采集与处理过程中可能存在信息丢失、低含量差异代谢物可能被掩盖的问题；数据库不够完善，目前大量未知代谢物的结构鉴定和细胞功能研究困难，对已鉴定出产物的变化机制研究大多仍不明确难以直接指导临床；联用技术操作和数据分析处理的综合性专业人才储备不足等。在精准医疗浪潮推动下，进一步完善代谢组学研究的标准化流程后，利用代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白组学以及微生物菌群学[57]对乳腺癌进行多学科技术互补、大数据综合分析，将有利于乳腺癌的早期诊断、发病机制研究以及疾病预后相关诊疗方案的系统优化，为乳腺癌个性化靶向治疗提供更合理的科学指导。
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