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温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

彭慧丽 赵利娜 程艳芹 赵丽艳 封颖路 李明春

彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
引用本文: 彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
ZHANG Lianqing, LUO Yan, YANG Ti, YAO Jiachen, LI Wenyan. Mining and research on the adverse event signal of exenatide microspheres based on FAERS database[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(10): 445-450. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403057
Citation: PENG Huili, ZHAO Lina, CHENG Yanqin, ZHAO Liyan, FENG Yinglu, LI Mingchun. Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095

温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
详细信息
    作者简介:

    彭慧丽,硕士生,研究方向:中药制备工艺,Tel:15735013093,Email:15735013093@163.com

    通讯作者: 李明春,硕士,主任药师,硕士生导师,研究方向:药理学,Tel:(0532)51870518,Email:lmc401y@163.com
  • 中图分类号: 284.1

Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm

  • 摘要:   目的  优选温经活血巴布剂中挥发油的超临界CO2萃取工艺条件。  方法  在单因素考察萃取温度、分离斧I温度、萃取压力、萃取时间对萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素综合评分的基础上,正交设计优选萃取温度、萃取压力、萃取时间对所提挥发油综合评分的影响。  结果  单因素实验中,对所提挥发油综合评分影响较大的因素为萃取温度,萃取压力和萃取时间,正交实验结果表明萃取温度、萃取压力对挥发油综合评分有显著影响,优选的最佳工艺为:萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2.0 h。  结论  本实验优选的萃取工艺稳定可行,可用于该挥发油的提取制备。
  • 隐丹参酮(CTS)是中药丹参的有效成分之一,国内外研究证明CTS具有抗肿瘤、抗炎、神经保护、心血管保护、抗纤维化和调节代谢紊乱等药理特性,具有广阔的临床应用前景。抗肿瘤作用是近年来隐丹参酮药理活性研究的热点问题之一[1]。隐丹参酮对肺癌、肝胆癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、骨肉瘤癌、黑色素瘤、横纹肌瘤、食管鳞状癌等多种恶性肿瘤表现出一定的抑制活性,其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,调节免疫以及抑制包括STAT3在内的多种信号通路[2-4]。由于CTS中等强度的药理活性和选择性,近年来研究人员对CTS进行了大量结构修饰,期望获得靶点明确且药理活性更强的CTS衍生物,从而开发并应用于临床治疗。本文就隐丹参酮及其衍生物在抗肿瘤方面的作用及其机制进行综述。

    癌细胞的主要特点是具有无限的增殖能力。研究表明,CTS可以抑制多种肿瘤细胞增殖,包括胰腺癌细胞BxPC-3、慢性髓性白血病细胞K562/ADR、胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞Hey、前列腺癌细胞DU145、乳腺癌细胞MCF7、食管鳞状细胞癌ESCC等[5]

    细胞凋亡又称细胞程序性死亡,对于维持组织稳态和消除不需要或受损细胞起重要作用。研究发现,CTS可以诱导多种肿瘤细胞凋亡,包括骨髓瘤细胞U266、人结肠癌细胞系SW620 Ad300和HCT116、人胃癌细胞MKN-45、肝癌细胞Hepa1-6、非小细胞肺癌细胞A549 和H460 、黑色素瘤细胞A375、横纹肌肉瘤细胞Rh30等[6]

    高侵袭性和转移是癌细胞恶性特征,转移是癌症死亡的主要原因。因此,抑制癌细胞转移能有效降低癌症死亡率。研究发现,CTS能够抑制卵巢癌细胞A2780的迁移和侵袭[7]。此外,CTS还可以抑制食管癌细胞EC109、膀胱癌细胞T24、人舌鳞癌细胞CAL27、小鼠结肠癌细胞CT26等多种肿瘤细胞的迁移和侵袭[5]

    隐丹参酮不仅能够直接抑制多种肿瘤细胞的生长,还可以诱导机体产生抗肿瘤免疫反应,从而间接发挥抗肿瘤效应。研究发现,隐丹参酮能够通过增加CD4+T细胞的细胞毒作用,抑制人非小细胞肺癌H446细胞和乳腺癌MCF7细胞的生长[8]。此外,隐丹参酮还可以通过诱导小鼠树突状细胞成熟,促进抗原提呈功能,进而诱导T细胞活化增殖,抑制Lewis肺癌细胞的增殖[9]。肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 是肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,具有异质性,可分为M1和M2表型。M2表型的TAM能够促进肿瘤生长和转移,相反,M1表型则具有肿瘤抑制和促炎特性。研究发现,隐丹参酮和PD-L1联合治疗能够诱导巨噬细胞向M1极化,从而抑制小鼠肝癌Hepa1-6移植瘤的生长[10]

    耐药是导致肿瘤复发和治疗失败的主要原因。研究表明,CTS能够逆转慢性骨髓性白血病细胞K562对伊马替尼的耐药性[11],改善A549细胞对顺铂的耐药性[12]。此外,CTS还可以逆转P-糖蛋白(p-gp)过表达的结肠癌细胞SW620 Ad300对多柔比星和伊立替康的多重耐药[13]

    除了具有以上活性之外,CTS还可以与其他不同抗癌药物或细胞因子协同发挥抗肿瘤作用。例如,CTS和紫杉醇的联合用药比单独用药更能有效诱导舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-9细胞的凋亡[14]。新近研究发现,CTS与小剂量的抗PD-L1抗体合用对小鼠Lewis 肺癌的生长抑制作用明显优于CTS单独应用[9]

    自噬,即Ⅱ型程序性细胞死亡,作为凋亡之外的另一种可以杀死细胞的途径,是一种抑制癌细胞生长的新方法。研究显示,CTS可通过诱导结肠癌SW620 Ad300细胞和A549细胞自噬促进细胞死亡[15-16]

    CTS抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,以及调节免疫等作用的机制十分广泛,涉及靶点STAT3、酪氨酸蛋白磷酸酶SHP2、DNA拓扑异构酶和信号通路磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶Akt等。

    STAT3由Janus激酶(JAKs)激活,参与肿瘤增殖、凋亡、血管生成及免疫逃逸等。STAT3在大多数恶性肿瘤中被组成性激活,异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的重要过程。当705位酪氨酸残基磷酸化后,STAT3被激活,单体STAT3通过其SH2结构域形成二聚体,并从细胞质转移到细胞核中,调节其靶基因的表达,例如,上调cyclin D1、survivin、Mcl-1、MYC、BCL-XL表达,下调 p53表达,促进肿瘤细胞增殖和存活;上调MMP2/9、Twist1、Vimentin表达,促进肿瘤转移;上调TGF-β、IL-6/10、PD-1、PD-L1、VEGF表达,下调CD80/86、MHCII、TNF、IL-12、CCL5、CXCL10等表达,抑制肿瘤微环境免疫功能[17]。研究发现,CTS能够直接与STAT3的SH2结构域结合,特异性抑制STAT3 Tyr705的磷酸化,抑制STAT3二聚化[18-19],相比之下,姜黄素还能抑制Jak2的表达[20]。在人胰腺癌BxPC-3细胞中,CTS能够抑制BxPC-3细胞的STAT3信号通路进而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,达到抗肿瘤的作用[21]。另外,CTS作为p-STAT3抑制剂,能够有效阻断IL-6介导的STAT3活化,抑制肿瘤增殖,逆转BCR-ABL激酶非依赖性耐药途径[11]。此外,CTS和紫杉醇联合治疗能够有效地抑制舌鳞状癌TSCC细胞增殖和迁移,其作用机制同样与抑制STAT3信号通路相关[14]。沉默信息转录调控因子3(SIRT3)是一种蛋白质去乙酰化酶,参与癌症、心血管、神经系统等疾病的发展过程。研究发现CTS能够通过抑制STAT3/SIRT3 信号通路抑制人卵巢癌A2780 细胞增殖[22]。 上述研究表明,抑制STAT3信号通路对于CTS抗肿瘤至关重要,且CTS是一种特异性的STAT3抑制剂。

    含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)由基因PTPN11编码,PTPN11突变引起SHP2催化活性异常增加。研究发现,肺癌、结肠癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌和急性髓性白血病等病人均发现有PTPN11突变[23]。SHP2是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶,参与Ras-Erk、PI3K-Akt、Jak-Stat和NF-κB多条信号通路传导,调控细胞的增殖、迁移和凋亡等过程[24]。研究证明,CTS能与SHP2直接结合,是一个混合型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂,抑制SHP2 的IC50为22.50μmol/L,抑制SHP1的IC50为39.50μmol/L。用SHP2 siRNA敲减Hela细胞中SHP2后,CTS抑制Hela细胞生长的敏感性降低,提示SHP2是CTS的一个靶点,但是,CTS仍然可以进一步抑制SHP2敲减细胞生长,说明CTS还有其它作用靶点[25]。此外,有研究发现,CTS能够上调胶质瘤细胞 U87 SHP2蛋白酪氨酸磷酸酶活性,抑制STAT3 Tyr705的磷酸化,从而在体内外表现出抑制恶性胶质瘤活性[26]

    DNA拓扑异构酶 (topos),包括DNA拓扑异构酶1(topo1)和DNA拓扑异构酶2(topo2),其中topo2因其在有丝分裂中的关键作用被认为是抗癌治疗的重要靶点[27]。研究表明,CTS能够显著降低前列腺癌PC3细胞中topo 2a的mRNA、蛋白和酶活性水平,并且在裸鼠异种移植模型中表现出良好的抗肿瘤作用[28]

    活性氧与肿瘤的发展密切相关,其过度产生可诱导多种生物学效应,包括抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬等[29]。研究发现,CTS能够促进胃癌MKN-28 细胞ROS的累积,通过调控MAPK和AKT信号通路诱导G2/M周期阻滞[30];通过ROS-线粒体途径,上调cleaved caspases-3、促凋亡蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2,从而诱导黑色素瘤细胞凋亡[31];诱导横纹肌肉瘤Rh30细胞ROS产生,激活JNK/p-38,抑制Erk1/2,导致细胞凋亡[32];刺激SW620 Ad300细胞中的ROS产生,诱导p38 MAPK激活,导致NF-κB从细胞质转移到细胞核中,最终导致自噬发生[15];刺激HepG2和MCF-7细胞产生ROS,激活内质网(ER)应激,增强不同抗癌药物或细胞因子(Fas/Apo-1、TNF-α、顺铂、依托泊苷或5-FU)诱导的细胞凋亡[33]

    雄激素受体(AR)和雌激素受体(ER)分别是治疗前列腺癌PCa和乳腺癌的主要靶点。研究发现CTS可以通过抑制AR二聚化有效抑制AR活性,从而抑制AR+ PCa细胞的生长[34];在异种移植动物模型中,CTS可以有效抑制人前列腺癌CWR22Rv1细胞的生长和AR靶基因的表达[35]。此外,CTS还能够抑制乳腺癌细胞的生长,通过竞争性地结合ERα抑制E2诱导的ER转录活性和ER靶基因的表达[36];同时,CTS可以有效地抑制体内异种移植瘤模型中ER信号,发挥抗肿瘤作用[37]

    磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路参与肿瘤的发生、生长、存活和转移。有研究发现CTS可抑制PI3K/AKT信号通路,增加caspase-3、caspase-9、PARP和Bax的表达,降低Bcl-2、survivin、细胞凋亡抑制蛋白的表达,诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡[38-39]。酪氨酸激酶胰岛素生长因子1受体(IGF-1R)在肿瘤细胞的生长、分化和进展中起关键的作用。研究表明,CTS能够通过下调IGF-1R/PI3K/Akt信号通路抑制人肺癌细胞的增殖[40]。此外,有文献报导CTS可以通过调节PI3K/Akt/mTOR信号,抑制结肠癌CT26细胞的侵袭[41]。在裸鼠异种移植实验中,CTS能够显著抑制小鼠体内异种移植物的生长,其作用机制与抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关[42]。以上研究表明PI3K/AKT信号通路可能是CTS抗肿瘤的有效信号通路之一。

    CTS虽然具有广谱的抗肿瘤活性,但是其药理作用中等,疏水性强且难吸收,口服生物利用度只有2.1%,这些缺点严重阻碍了其开发和应用[43]。近年来,针对CTS存在的问题,人们尝试对CTS进行结构改造,期望获得生物活性高、水溶性好的化合物。刘航[44]等基于CTS是一种STAT3抑制剂,通过对CTS及其骨架类似物进行修饰,设计合成了CTS衍生物62个,其中新化合物46个,通过报告基因法检测发现有27个新化合物对STAT3转录抑制效果优于CTS,IC50最低0.5976 μmol/L。Wang等基于STAT3的药物设计策略,设计合成了一种亲和力和抑制活性更强的新型CTS衍生物LYW-6,该化合物与STAT3结合解离常数Kd约为6.6μmol/L,能够显著抑制STAT3磷酸化、二聚化、核转位以及转录活性。在细胞水平上,LYW-6能选择性抑制高STAT3活性的结肠癌细胞增殖、迁移,促进凋亡,体内可抑制结肠癌的生长和转移,是一个具有开发前景的抗肿瘤活性化合物[45]。为了改善CTS的水溶性,Xu等合成了几种CTS的钠盐衍生物,结果发现这些衍生物比CTS更易溶解,同时保留了CTS的生物活性,其中钠盐衍生物PTS33可以有效地抑制二氢睾酮DHT诱导AR反式激活和PCa细胞生长[46]

    CTS具有广谱的抗肿瘤活性,该活性与抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,逆转耐药性,诱导自噬等作用相关。除直接作用于肿瘤细胞外,CTS还可以通过增强CD4+T细胞的细胞毒作用、诱导DC细胞成熟和促使巨噬细胞M1型极化,间接杀伤肿瘤细胞。分子机制研究表明,CTS可直接结合STAT3和SHP2,有效调节JAK/STAT3、NF-κB、PI3K/AKT和IGF-1R等信号通路发挥抗肿瘤作用。隐丹参酮特异性抑制STAT3信号通路,而不抑制STAT家族中的其他蛋白,是其一大特点。因为尽管其他天然产物也有抗肿瘤作用,但不是特异性STAT3抑制剂,例如姜黄素,是一种STAT抑制剂,但在治疗24 h后降低了STAT3的表达。虽然CTS表现出良好的药理活性,但水溶性差和生物利用度低等问题限制了其广泛应用。因此,基于靶点STAT3,以CTS作为先导化合物,设计并合成一系列CTS衍生物,有望开发出新型STAT3抑制剂用于癌症治疗。

  • 图  1  温经活血巴布剂挥发油混合对照品、供试品、阴性供试品HPLC图

    A. 混合对照品;B温经活血巴布剂挥发油供试品;C.缺独活、羌活的阴性供试品;1.蛇床子素;2.异欧前胡素

    图  2  单因素试验结果

    A.萃取温度;B.分离斧Ⅰ温度;C.萃取压力;D.萃取时间

    表  1  正交试验设计及结果

    试验号因素萃取得率
    (%)
    蛇床子素含量
    (mg/g)
    异欧前胡素含量
    (mg/g)
    综合评分*
    (Y)
    ABCD
    111112.5520.3410.5069.95
    212222.9822.1910.9076.79
    313334.4320.85 9.3985.70
    421233.5523.8611.4585.05
    522313.7525.9911.7789.94
    623123.8027.3812.7894.28
    731323.0023.7711.0078.95
    832133.3824.8111.1783.90
    933213.7527.4010.7889.15
    K1232.44233.95248.13249.04
    K2269.27250.63250.99250.02
    K3252269.13254.59254.65
    R 36.83 35.18 6.46 5.61
    注:*综合评分(Y)计算公式见“2.3”项;因素A:萃取温度;因素B:萃取压力;因素C:萃取时间;因素D:空白
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    表  2  正交因素试验水平表

    水平因素
    A.萃取温度(T/ ℃)B.萃取压力(P/MPa)C.萃取时间(t/h)
    150202.0
    255253.0
    360304.0
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    表  3  方差分析结果

    方差来源方差平方和自由度均方FP
    A226.3662113.18337.819<0.05
    B206.4562103.22834.493<0.05
    C 6.9862 3.496 1.167>0.05
    D(误差) 5.9852 2.993
    F0.05(2,2)=19.0
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    表  4  3批中药材萃取得率和主要含量工艺验证试验结果

    批号萃取得率
    (%)
    蛇床子素含量(mg/g)异欧前胡素含量(mg/g)
    202107243.7027.8112.84
    202108013.8127.5012.73
    202108103.7926.9112.52
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-09-18
  • 修回日期:  2022-01-05
  • 网络出版日期:  2023-08-18
  • 刊出日期:  2023-08-25

温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
    作者简介:

    彭慧丽,硕士生,研究方向:中药制备工艺,Tel:15735013093,Email:15735013093@163.com

    通讯作者: 李明春,硕士,主任药师,硕士生导师,研究方向:药理学,Tel:(0532)51870518,Email:lmc401y@163.com
  • 中图分类号: 284.1

摘要:   目的  优选温经活血巴布剂中挥发油的超临界CO2萃取工艺条件。  方法  在单因素考察萃取温度、分离斧I温度、萃取压力、萃取时间对萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素综合评分的基础上,正交设计优选萃取温度、萃取压力、萃取时间对所提挥发油综合评分的影响。  结果  单因素实验中,对所提挥发油综合评分影响较大的因素为萃取温度,萃取压力和萃取时间,正交实验结果表明萃取温度、萃取压力对挥发油综合评分有显著影响,优选的最佳工艺为:萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2.0 h。  结论  本实验优选的萃取工艺稳定可行,可用于该挥发油的提取制备。

English Abstract

彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
引用本文: 彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
ZHANG Lianqing, LUO Yan, YANG Ti, YAO Jiachen, LI Wenyan. Mining and research on the adverse event signal of exenatide microspheres based on FAERS database[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(10): 445-450. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403057
Citation: PENG Huili, ZHAO Lina, CHENG Yanqin, ZHAO Liyan, FENG Yinglu, LI Mingchun. Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
  • 温经活血汤作为海军第九七一医院的院内处方,由川芎、红花、独活、羌活、秦艽、甘草等十四味中药材组成,可用于因“瘀、湿、寒”引起的各部位疼痛,如风湿性关节炎等,具有“温经散寒、活血消肿、祛风胜湿、通痹止痛”的功效。温经活血巴布剂是在温经活血汤基础上改良的新型制剂,该剂型在保持其原有药效作用的基础上,改善了汤剂在储存过程中易腐败的特点[1]。处方中川芎、红花、独活、羌活含有的挥发性成分是温经活血巴布剂发挥其药效作用的重要组成部分,其中独活、羌活的重要药效成分蛇床子素、异欧前胡素因其不溶于水的物理特性,故在全方水提时难以提出[2-5]。为更好地提取药材中的药效成分,本实验拟采用超临界CO2萃取技术[6-8],在单因素试验的基础上,正交设计优选川芎、红花、独活、羌活的挥发油提取工艺。

    • 安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),FA1604型电子分析天平(上海衡平仪器仪表厂),DHG-9023型电热恒温鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂),KH-100B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司),HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司),HA221-40-11 超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司)。

    • 川芎(批号:200701)、红花(批号:200801)、羌活(批号:200201)、独活(批号:200301)均购自青岛天成中药饮片有限公司,经山东中医药大学张华教授鉴定川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根茎、红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花、羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang的干燥根茎和根、独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim, f. biserrata Shan et Yuan的干燥根,均符合《中华人民共和国药典》(2020年版)中的相关规定,为正品药材;蛇床子素对照品(批号:823A027)、异欧前胡素对照品(批号:A1229A025)均购自北京索莱宝科技有限公司,纯度均>98%;高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯(天津四友有限公司);其余试剂均为分析纯。

    • 按处方比例称取一定量的川芎、红花、羌活、独活药材,放入萃取釜中按设置好的温度和压力加热加压提取至结束后,从解析釜Ⅰ出料口接收黄色膏状提取物,计算所得萃取得率(萃取得率=所得提取物的质量/药材质量×100%)。

    • 精密称定蛇床子素、异欧前胡素适量分别置于25 ml容量瓶中,加甲醇定容后配制成210.40 μg/ml的蛇床子素、163.20 μg/ml的异欧前胡素对照品母液。精密量取蛇床子素对照品母液5 ml、异欧前胡素对照品母液3 ml于10 ml容量瓶中,用甲醇定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,得混合对照品溶液。

    • 精密称定超临界提取挥发油150 mg于25 ml容量瓶中,加甲醇超声处理后定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,得供试品溶液。

    • 按处方比例称取缺羌活、独活的药材,按“2.1”项下工艺操作,同“2.2.2”项下进行样品处理,得阴性供试品溶液。

    • 色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),进样量:10 μl,流速:1.0 ml/min,柱温:20 ℃,检测波长:321 nm。流动相与洗脱条件:A相为乙腈,B相为水。梯度洗脱为:0~8 min,30%→62%A;8~22 min,62%A。

    • 分别精密吸取混合对照品溶液,挥发油供试品溶液,缺羌活、独活的阴性供试品溶液按“2.2.4”项下条件进样测定,记录色谱图。测得成分蛇床子素、异欧前胡素色谱峰达到了较为理想的分离效果,分离度均>1.5,理论板数均≥5 000,且阴性供试品对测定无干扰,混合对照品、供试品及阴性供试品色谱图见图1

      图  1  温经活血巴布剂挥发油混合对照品、供试品、阴性供试品HPLC图

    • 取混合对照品溶液,分别吸取2、5、10、20、30、40 μl注入液相色谱仪,记录峰面积。以对照品溶液的进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。得蛇床子素回归方程为Y=28.273X−1.521,r=1.000(n=6);异欧前胡素回归方程为Y=21.251X+21.496, r=1.000(n=6)。结果表明,蛇床子素在21.04~420.80 μg范围内线性良好,异欧前胡素在12.24~195.84 μg范围内线性良好。

    • 精密量取对照品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件重复进样6次,记录各成分色谱峰面积。结果表明蛇床子素、异欧前胡素的峰面积RSD分别为0.98%和0.64%,结果表明仪器精密度良好。

    • 取同一供试品溶液,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.4”项下色谱条件进样测定,记录各成分峰面积,蛇床子素和异欧前胡素的RSD分别为1.50%和1.36%,结果表明所提挥发油在室温条件下24 h内稳定。

    • 同样的条件下制备供试品溶液6份,按“2.2.4”项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算含量,结果蛇床子素和异欧前胡素的平均含量分别为17.34 mg/g和8.09 mg/g,RSD分别为1.85%和1.57%,结果表明该方法重复性良好。

    • 取已知含量的挥发油供试品6份,分别精密称定50 mg于10 ml容量瓶中,按药材成分含有量1∶1的比例,分别精密加入蛇床子素、异欧前胡素对照品按“2.2.2”项下制备供试品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件进行含量测定,测定两种成分的平均加样回收率为100.01%和99.65%,RSD分别为1.10%和1.13%,表明该方法稳定可行。

    • 取各操作下的供试品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件分别进样,记录峰面积,按外标一点法进行所测指标的含量测定,测定结果如表1所示。

      表 1  正交试验设计及结果

      试验号因素萃取得率
      (%)
      蛇床子素含量
      (mg/g)
      异欧前胡素含量
      (mg/g)
      综合评分*
      (Y)
      ABCD
      111112.5520.3410.5069.95
      212222.9822.1910.9076.79
      313334.4320.85 9.3985.70
      421233.5523.8611.4585.05
      522313.7525.9911.7789.94
      623123.8027.3812.7894.28
      731323.0023.7711.0078.95
      832133.3824.8111.1783.90
      933213.7527.4010.7889.15
      K1232.44233.95248.13249.04
      K2269.27250.63250.99250.02
      K3252269.13254.59254.65
      R 36.83 35.18 6.46 5.61
      注:*综合评分(Y)计算公式见“2.3”项;因素A:萃取温度;因素B:萃取压力;因素C:萃取时间;因素D:空白
    • 影响超临界提取挥发油的主要因素有萃取温度、分离斧Ⅰ温度、萃取压力和萃取时间等,按照“2.1”项下实验方法,以萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素含量的综合评分为考察指标综合评价[6-7],各指标权重系数分别为:0.40、0.30、0.30,综合评分公式:Y(得分)=(本组萃取得率/最高组萃取得率×0.40+本组蛇床子素含量/最高组蛇床子素含量×0.30+本组异欧前胡素含量/最高组异欧前胡素含量×0.30)×100,考察萃取温度(40、45、50、55、60 ℃)、分离斧Ⅰ温度(40、45、50、55、60 ℃)、萃取压力(20、25、30、35、40 MPa)、萃取时间(1、2、3、4、5 h)对所提挥发油的影响。采用控制变量的方法,当改变其中一个因素时,其余因素为萃取温度40 ℃、分离斧Ⅰ温度40 ℃、萃取压力20 MPa、萃取时间1.0 h,确定各因素的大致范围,实验结果如图2所示。

      图  2  单因素试验结果

      图2可得,在萃取温度,分离斧Ⅰ温度、萃取压力、萃取时间4个影响因素中,萃取温度、萃取压力、萃取时间3个因素对挥发油综合评分影响较大,而分离斧Ⅰ温度影响较小,故确定后续操作在分离斧Ⅰ温度为50 ℃的基础上,萃取温度选取50、55、60 ℃ 3个水平,萃取压力选20、25、30 MPa 3个水平,萃取时间选取2、3、4 h 3个水平进行正交试验。

    • 对单因素试验结果进行分析,确定以萃取温度、萃取压力、萃取时间为考察因素,采用 L9(34)正交试验法,优选最佳提取工艺条件。具体因素水平表见表2。试验设计及结果见表1,方差分析结果见表3,统计分析使用SPSS 22.0软件。

      表 2  正交因素试验水平表

      水平因素
      A.萃取温度(T/ ℃)B.萃取压力(P/MPa)C.萃取时间(t/h)
      150202.0
      255253.0
      360304.0

      表 3  方差分析结果

      方差来源方差平方和自由度均方FP
      A226.3662113.18337.819<0.05
      B206.4562103.22834.493<0.05
      C 6.9862 3.496 1.167>0.05
      D(误差) 5.9852 2.993
      F0.05(2,2)=19.0

      由极差分析可以得出影响所提药材综合评分的因素大小为A>B>C,即萃取温度>萃取压力>萃取时间,各因素水平的强弱顺序为:A2>A3>A1,B3>B2>B1,C3>C2>C1。同时方差分析结果表明因素A萃取温度和因素B萃取压力对于超临界所提挥发油的综合评分有显著性影响, 因素C萃取时间的3个水平相差不大,无显著影响。结合极差分析和方差分析结果,在综合考虑实际操作的前提下,为获得好的提取效果,确定因素A选择水平2,因素B选择水平3,因素C选择水平1,即本试验最佳提取工艺组合为A2B3C1,萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2 h。

    • 按比例称取3份同一批号的处方量药材,按照正交试验优选条件进行萃取,测定所得挥发油的萃取得率和每1.00 g萃取物中所含蛇床子素、异欧前胡素的含量,实验结果如表4所示。计算其相应结果得平均萃取得率为3.77%,RSD为1.56%,蛇床子素平均含量为27.41 mg/g,RSD为1.66%,异欧前胡素平均含量为12.69 mg/g,RSD为1.28%,表明正交试验所得萃取工艺条件稳定可行。

      表 4  3批中药材萃取得率和主要含量工艺验证试验结果

      批号萃取得率
      (%)
      蛇床子素含量(mg/g)异欧前胡素含量(mg/g)
      202107243.7027.8112.84
      202108013.8127.5012.73
      202108103.7926.9112.52
    • 本实验对甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行比较,结果显示乙腈洗脱能力较甲醇更好,出峰时间早且分离好,乙腈-水与乙腈-0.1%磷酸水相比得出的图无明显区别,表明调节洗脱液酸碱性对分离物质无太大影响,故流动相选择乙腈-水。波长选择为321 nm是因为在该波长处蛇床子素、异欧前胡素均有较好吸收。

    •   本次实验中选择蛇床子素、异欧前胡素为液相检测指标,其中蛇床子素具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗血小板凝聚等作用,是独活发挥其祛风除湿、通痹止痛功效的主要药效成分[11-12]。羌活具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌细胞增殖、抗血栓等作用,而异欧前胡素作为羌活的重要活性成分,故将其作为本次实验的考察指标[5]。同时未考察红花中活性成分是因为红花主要活性成分为羟基红花黄色素A,虽然其同样具有活血化瘀的药理作用,但其溶解性为水溶性,不在挥发油成分中。川芎的主要药效成分——阿魏酸,虽具有抗氧化、抑菌消炎、抗血栓的作用,但在经液相检测过程中发现挥发油中虽含阿魏酸,但其提取量过低且在阿魏酸出峰位置有其他物质干扰,经调节流动相比例和切换检测波长等方法未将其去除,故未将其列入检测指标范围内。

    • 常用的挥发油提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法等。水蒸气蒸馏法是指将药材用水浸泡后,采用直接加热蒸馏或通入水蒸气蒸馏,使挥发油与水共同蒸馏出来后收集馏液,冷却后分离油层的方法。超临界CO2萃取法是指应用CO2超临界流体提取植物的挥发油,该方法较水蒸气蒸馏法可以有效防止挥发油中易热解成分的破坏且可以提高产品质量和提高收率。

参考文献 (12)

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