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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，以对称性多关节滑膜炎为主要临床表现，呈慢性、进行性及侵袭性，病情逐渐加重，最终可出现残疾，甚至累及脏器和神经系统而危及生命。目前RA 发病机制尚不明确，治疗主要是非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药及生物制剂等对症治疗或改善病情治疗，但存在不同程度的疗效限制、治疗费用高或长期应用副作用较大等问题。昆仙胶囊作为“九五”国家中医药重点科技攻关项目成果，由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等组成。已有的研究提示，原方中昆明山海棠有较好的抗炎镇痛与免疫调节作用，枸杞子、菟丝子与昆明山海棠配伍可有效降低其毒性，而淫羊藿与昆明山海棠配伍则可增强免疫调节作用，改善骨损伤。总之，该方有较好的抗炎镇痛、免疫调节及保护关节软骨的作用，可减轻滑膜炎症、修复关节软骨的损伤，毒副作用也相对较低[1-2]。临床研究显示，昆仙胶囊用于治疗RA患者效果显著，能有效缓解关节疼痛、晨僵症状，改善关节功能活动，不仅有较好的疗效，安全性也得到验证[3-6]。
近年来，RA发病机制的研究取得了较快进展，有关昆仙胶囊治疗RA的作用机制有待进一步挖掘研究。网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点（nodes）进行多靶点药物分子设计的新学科。本研究基于网络药理学技术，依托相应数据库和软件，构建“药物-成分-关键靶点-信号通路”网络，科学系统地分析昆仙胶囊对 RA 的作用机制，以期为后续的实验研究奠定基础。
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本研究通过计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索中药枸杞子、菟丝子、淫羊藿的活性成分，利用本草组鉴（即HERB数据库，http://herb.ac.cn/）检索昆明山海棠的活性成分。再根据化合物口服生物利用度（OB）与类药性指数（DL）筛选活性成分，其中，OB 阈值设为OB≥30%， DL阈值设为DL≥0.18 [7-8] 。最终得到81种有效活性成分，并通过TCMSP数据库获取其对应的靶点。
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以rheumatoid arthritis为关键词，检索 Genecards（https://www.genecards.org/）数据库及OMIM（https://omim.org/）数据库，收集 RA 的相关靶点。
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为探明药物活性成分靶点与疾病靶点之间的关系，将两部分靶点通过 Venn图制作网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）进行交集得出公共靶点，并导入Cytoscape3.7.2软件构建化合物-靶点网络。Cytoscape 软件的核心架构是网络，其中的每个节点代表基因或分子，而节点与节点之间的连接代表这些基因或分子之间存在相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目。
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为进一步探究靶点蛋白之间的相互作用，将所得的药物与疾病的公共靶点上传至在线STRING10.5软件(http://string db.org)，构建蛋白-蛋白相互作用网络模型。其参数修改物种为人（homosapiens），其他参数保持默认设置，获取PPI网络。
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利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析，其中，GO富集分析分为细胞组成、生物过程以及分子功能 3个部分。设定阈值P<0.05，保存富集分析的结果并将其可视化。
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使用TCMSP和HERB数据库检索枸杞子、菟丝子、淫羊藿及昆明山海棠的化合物共 384个：其中枸杞子有188个化合物，菟丝子有29个化合物，淫羊藿有130个化合物，昆明山海棠有37个化合物。依据OB≥30%且DL≥0.18筛选出化合物共131个：其中，枸杞子有45个，菟丝子有11个，淫羊藿有23个，昆明山海棠有7个。去除重复后，发现昆仙胶囊中活性成分81个，再通过TCMSP获取对应的药物成分靶点913个，删除重复后得到228个。部分活性成分见表1。
表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 -
通过 Genecards 数据库得到 RA 靶点4465，通过OMIN数据库得到RA相关靶点41个。通过交集去除重复靶点，共得到RA相关靶点4 494个。
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利用 Venn 图制作网站将昆仙胶囊活性成分对应的 228 个靶点与 RA 对应的4494 个靶点进行交集，获得162个共有靶点（图1）。将 162个共有靶点导入 Cytoscape 3.7.2 软件，构建“化合物-靶点”的网络图并进行可视化分析（图2）。网络图包含65个化合物节点、162个靶点节点（公共靶点）和227条边，用绿色表示枸杞子的活性成分，紫色代表淫羊藿的活性成分，红色表示昆明山海棠的活性成分，黄色代表公共活性成分，橘色代表菟丝子的活性成分，蓝色代表靶点。连接活性成分与靶点的边表示两者之间具有相互作用。依据网络拓扑学性质可知，节点较多的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。
图 1 昆仙胶囊活性成分靶点与RA疾病靶点的公共靶点
图 2 昆仙胶囊主要成分-靶点网络
排名前5位的活性成分分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素，分别能与103个、44个、36个、32个、31个靶点蛋白发生作用。排名前5位的靶点分别为孕酮受体（PGR）、前列腺素过氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素过氧化物合酶1（PTGS1）、盐皮质激素受体基因（NR3C2）、雄激素受体（AR），分别能与34个、32个、19个、18个、13个化合物发生作用。
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应用STRING软件构建PPI网络(图3)，此网络图中通过162个公共靶点得出，共有边84条，同时得到网络中关键靶点的频次。根据“度值>均值”筛选出关键节点20个，包括：IL-6、IKBKB、FOS、EGFR、EGF、CXCL8、CHUK、CCNB1、MYC、IL4、IL1B、VEGFA、JUN、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP8、STAT3、IL10、AKT1。度值排名前5位的靶点分别是AKT1、IL10、STAT3、CASP8及CDKN1A，可能为昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。
图 3 昆仙胶囊靶蛋白PPI网络图
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GO生物过程（图4）主要包括：活性氧代谢过程的调控、正调控血管生成、凋亡信号通路的负调控、细胞对化学应激的反应等；分子功能（图5）包括：激酶活性的调节、肽酶活性的调节、DNA结合转录因子活性的正调控、激酶调节活性等；细胞组成（图6）包括：囊腔、宿主细胞内部分、突触前膜固有成分等；KEGG富集分析（图7）主要包括：IL-17信号通路、乙型肝炎、催乳素信号通路、麻疹等，其中，IL-17信号通路的占比最高，其次为乙型肝炎。
图 4 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的生物过程（P<0.05）
图 5 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的分子功能 (P<0.05)
图 6 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的细胞组成(P<0.05)
图 7 昆仙胶囊干预类风湿关节炎的KEGG富集分析（P<0.05)
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RA致残率较高，是对健康危害较大的风湿病之一。昆仙胶囊由昆明山海棠、枸杞子、菟丝子及淫羊藿等中药组成，治疗RA疗效显著，但具体作用机制尚不十分明确。本研究借助网络药理学方法，获得昆仙胶囊治疗RA的主要活性分子及相关的靶点基因，进行GO 功能富集和 KEGG 功能分析，预测其治疗RA可能的物质基础和作用机制，为后续研究提供思路和依据。
从“化合物-靶点”的网络图可以看出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素是昆仙胶囊中治疗RA的主要活性成分。槲皮素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，临床研究提示，单用槲皮素治疗的RA患者晨僵、疼痛和活动后疼痛明显减轻，疾病活动评分（DAS）和健康评估问卷（HAQ）得分降低，有良好的治疗效果[9]。槲皮素能调节核转录因子κB（NF-κB）通路；抑制TNF-α、IL-1β、IL-17和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平；减少炎症细胞向关节部位募集来缓解RA的炎症[10]。槲皮素可降低基质金属蛋白酶 2（MMP-2）的表达和活性，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移[11]；促进RA成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡和抑制 FLS的迁移和侵袭来减轻 RA[12-13]。此外，调节破骨/成骨细胞和Th17/Treg平衡可能是槲皮素的另一种调节RA的机制[14]。木犀草素具有良好的抗炎活性，能明显降低胶原诱导性关节炎大鼠足跖的炎性肿胀程度，潜在抑制RA NLRP3炎性小体过表达、降低caspase-1、RANKL、VEGF和HIF-1α蛋白表达并增强OPG蛋白表达起到骨关节保护作用[15]。山奈酚拮抗bFGF / FGFR3 / RSK2轴可有效降低胶原诱导性关节炎小鼠的临床和组织学评分。山奈酚发挥抗关节炎作用的主要机制是抑制RA FLS增殖和迁移以及显著抑制Th17分化和破骨细胞生成[16]。β-谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分，具有抗炎、调节人体甾体激素、抗氧化及抗肿瘤等作用[17]。研究显示，含有β-谷甾醇的白术醇提物具有显著的抗炎作用，可明显降低佐剂型关节炎大鼠血清和组织中的 TNF-α、C-反应蛋白和 IL-2 的含量[18]。研究证实，雷公藤甲素又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，具有较为显著的抗炎作用，RA病人用药后关节肿痛明显减轻，有很好的治疗效果。研究提示，雷公藤甲素可通过调节细胞因子、酶类、核转录因子 B 的表达，抑制炎症因子分泌，抑制血管的生成和诱导细胞的凋亡，保护软骨和基因调控等方面发挥抗 ＲA 药理作用[19]。
靶点PPI网络图提示，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等可能是昆仙胶囊治疗RA的关键靶点。现有研究提示，蛋白激酶B1(AKT1) 与RA滑膜成纤维细胞生成有关[20]，IL-10 在RA 患者血清中存在异常高表达，IL-10具有多种免疫功能，可以抑制炎症和细胞免疫反应，加强与适应性免疫和清除功能相关的耐受性，抑制由单核细胞和巨噬细胞产生的促炎因子[21]。STAT3 是一个关键性 RA致病因子，能够抑制成纤维样滑膜细胞（FLS）凋亡，促进 T 细胞存活及抗体产生，受促炎因子调控而失衡的 STAT3 信号可导致慢性滑膜炎的产生，抑制STAT3 的磷酸化对缓解关节炎症状、促进 FLS凋亡意义重大[22]。Caspase-8在滑膜抗原呈递细胞中发挥功能，通过控制RIPK3的作用来调节对炎症刺激的反应，这种微妙的平衡维持了关节内的稳态[23]。RA患者滑膜组织和成纤维样滑膜细胞（HFLS）中CDKN1A下调。若CDKN1A过表达可显著抑制HFLS的增殖和侵袭，并下调肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6-的表达，上调了IL-10的表达[24]。
通路富集分析结果表明，昆仙胶囊治疗 RA的作用可能主要与干预IL-17、乙型肝炎及催乳素等信号通路有关，尤其是IL-17信号通路占比最大，达到57.89%。IL-17信号通路是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一，ACT1作为IL-17信号通路的衔接蛋白，与其关键底物TRAF6结合，激活下游NF-κＢ、JNK等核内基因信号通路，诱导炎性细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的表达，继而促进RA滑膜细胞增殖和活化，参与并加重RA病情[25]。RA和牙周炎是影响全世界人群的两种常见的慢性炎症性疾病。两种条件之间的关联一直是许多研究的重点，试图探索这种关联的潜在机制。催乳激素除了促乳作用外，在免疫和炎症中具有多种作用。一些数据表明，滑膜和牙周组织中的催乳素水平显著增加，并且这种增加与疾病活动和组织破坏有关。干预催乳素相关的通路，可能给RA的治疗带来新的机遇[26]。
综上所述，昆仙胶囊可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素等主要成分，作用于AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A等多个靶点，调节IL-17信号通路、乙型肝炎及催乳素等信号通路，从而抑制炎症反应、调节免疫功能、促进FLS凋亡和抑制FLS迁移和侵袭等以治疗 RA。本研究提示，昆仙胶囊治疗 RA 呈现出多成分、多靶点、多通路协同作用优势，为后续的实验研究和临床应用提供了依据。
致谢 感谢海军军医大学中医系博士研究生蔡孟成在网络药理学方面给予的技术支持及靶点筛选方面的意见与建议。
Mechanism of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis based on network pharmacology
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摘要:
目的 采用网络药理学方法，探讨昆仙胶囊治疗类风湿关节炎（RA）的分子靶点及可能的作用机制。 方法 利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）结合本草组鉴（HERB）检索昆仙胶囊所含中药的化学成分，并依据 TCMSP 数据库的口服生物利用度（OB）和类药性指数（DL）筛选出主要有效活性成分，并获取其对应的靶点。通过 Genecards数据库与OMIM数据库筛选出 RA 的靶点，利用 Venn图制作网站获取药物与疾病的共同靶点，运用Cytoscape构建“活性成分-靶点”网络；使用 String 数据库绘制靶蛋白相互作用（PPI）网络，利用Cytoscape软件中的ClueGo功能对公共靶点进行GO富集分析和KEGG富集分析。 结果 该研究共筛选出昆仙胶囊的有效活性成分81个，作用靶点913个，去除重复得到228个。从GeneCard数据库与OMIM数据库中获得RA的靶点4494个，通过交集获得公共靶点162个。揭示了槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇及雷公藤甲素等5种成分是昆仙胶囊中的主要活性成分，AKT1、IL-10、STAT3、CASP8及CDKN1A可能是该药治疗RA的关键靶点。GO及KEGG富集分析结果显示，昆仙胶囊干预RA的作用机制主要与活性氧代谢过程的调控、激酶活性的调节、IL-17信号通路等有关，涉及感染、炎症及免疫的重要生物过程和信号通路。 结论 本研究从网络药理学角度，初步探讨了昆仙胶囊治疗RA的物质基础和作用机制，提示了其多成分、多靶点、多途径的整体调节特点，为后续分子生物学实验研究提供了思路与依据。 Abstract:Objective To explore the molecular targets and associated potential pathways of Kunxian capsule in the treatment of rheumatoid arthritis (RA) based on network pharmacology. Methods The constituents of Kunxian capsule were searched by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database, Analysis Platform (TCMSP) and a high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine（HERB）.The potential active ingredients and targets were retrieved based on TCMSP database. RA related gene targets were retrieved through GeneCards database and OMIM database. Venn online software was used to obtain the common target of drugs and diseases. The “compound-target” network diagram was constructed with Cytoscape software. String database was used to draw the protein interaction (PPI) network. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis of the intersection network were conducted by Bioconductor Database. Results 81 active ingredients and 913 targets were identified. 228 targets were obtained after removing the duplicates. 4494 target genes directly related to RA were obtained from the GeneCards databases and OMIM databases. 162 genes were obtained from the intersection of component-target and disease-target. It was revealed that five ingredients including quercetin, luteolin, kaempferol, β-sitosterol and triptolide are the main active ingredients in Kunxian capsule. AKT1, IL-10, STAT3, CASP8 and CDKN1A may be the main therapeutical targets. The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that the mechanism of Kunxian capsule is mainly related to the regulation of reactive oxygen metabolism, the regulation of kinase activity, and IL-17 signaling pathway. The important biological processes and signaling pathways include infection, inflammation and immunity. Conclusion This research preliminarily explored the mechanism of Kunxian capsule in the treatment of RA by network pharmacology and suggested that the overall regulation is characterized by multi-components, multi-targets, and multi-channels. It provided some ideas for further molecular biology experiments. -
Key words:
- Kunxian capsule /
- rheumatoid arthritis /
- network pharmacology
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随着我国经济的发展以及居民生活水平的提高，越来越多的人来到高原生活、工作和旅游，但由于高原地区氧分压较低，高原病的发病率呈现逐年上升的趋势[1]。高原脑水肿（HACE）是高原病发生发展过程中最为严重的阶段，其临床表现为头痛、协调丧失、虚弱、意识水平降低[2]，并对机体造成不可逆的损伤。7-羟乙基白杨素（7-hydroxyethyl chrysin，7-HEC）是课题组前期筛选发现并合成的具有自主知识产权的抗高原缺氧化合物[3]，研究发现[4-5]，其对脑缺血再灌注大鼠和模拟高原低压性缺氧致脑组织损伤大鼠均具有明显的保护作用，并能够减轻低压低氧诱导的认知功能损伤[6]，在抗高原缺氧方面表现出优异的活性与前景。因此，本文主要从7-HEC对高原脑水肿的可能作用机制出发，探究其与自噬、周期、凋亡等通路之间的关系，为防治高原脑水肿的可能作用机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂与仪器
27只SPF级雄性Wistar大鼠（体重180～200 g），购自联勤保障部队第九四〇医院动物实验科，合格证号：SCXX（军）2012-0029，动物伦理委员会编号：2021KYLL173。
7-HEC由实验室景林临副教授自行合成；MDA、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CDK2、CDK6、CyclinD1、CyclinE2、PARP、Bax、Bcl-2、P62、LC3B抗体（英国Abcom公司）；BCA蛋白试剂盒（Solarbio公司）；脱脂奶粉（美国BD公司）；Western Bright TM ECL（美国Advansta）。
IEC-Micromax高速离心机（美国ThermoElectron公司）；Tissuelyser快速研磨仪（上海净信科技公司）；BP210S电子天平（赛多利斯有限公司）；HP-8453紫外分光光度计（美国惠普公司）；SpectraMax i3全自动荧光酶标仪（美国Molecular Devices公司）；FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱（中航贵州风雷航空军械有限责任公司）。
1.2 动物分组及高原脑水肿模型的建立[7]
将27只SPF级雄性Wistar大鼠适应性饲喂3 d后，随机分为3组，正常对照组、缺氧模型组、7-HEC给药组。给药组连续灌胃7-HEC（350 mg/kg）7 d，对照组和模型组给予等量灭菌注射用水。第四天，模型组和给药组放入大型低压低氧动物实验舱中，以10 m/s速度减压上升至相当于海拔6000 m处，缺氧处理3 d后处死，取脑组织。缺氧处理期间，氧舱温度：8:00～20:00，12 ℃，20:00～次日8:00，2 ℃；动物自由摄食及饮水；给药组继续灌胃给药。
1.3 脑组织氧化应激指标的检测
每组分别取6只大鼠脑组织标本，准确称重后，按质量（g）∶体积（ml）=1∶9 加入生理盐水制成10 %组织匀浆，采用WST-1法检测SOD活性、采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，以上操作均按试剂盒说明书进行。
1.4 蛋白质印迹法测定凋亡、周期、自噬相关蛋白的表达
每组选取3只大鼠脑组织，称重后加入9倍量高效裂解液，使用组织研磨仪进行组织匀浆，于冰上裂解30 min，低温离心后吸取上清匀浆液10 μl，BCA法测蛋白含量，剩余上清与4×上样缓冲液按体积3∶1比例混匀，封口膜封口，95 ℃煮沸10 min进行蛋白变性，取等量蛋白样品上样，采用 SDS-PAGE 进行分离，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜上，含5 %脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液漂洗4次，每次10 min。加入二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次10 min。配制ECL发光液，按照A液和B液1∶1进行配制，涂抹发光液，放入ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。
1.5 统计学分析
实验结果以（
$ \bar x \pm s $ ）表示，采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，选用单因素方差分析法进行组间变量分析，LSD-t 法比较组间差异。以P<0.05表示有显著性差异，以P<0.01表示有极显著性差异。2. 结果
2.1 氧化应激相关指标的测定
大鼠脑组织中氧化应激相关指标MDA与SOD的测定结果如图1所示，与对照组相比，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量显著性升高，SOD活力显著性下调（P<0.05），当给予7-HEC时，缺氧组大鼠脑组织中MDA含量下调，SOD活力上调，且差异具有统计学意义（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与机体氧化应激的调节，起到防护高原脑水肿的效果。
2.2 凋亡相关蛋白的表达
如图2所示，大鼠脑组织中PARP与Bcl-2的蛋白表达在缺氧组下调，给药后显著上调（P<0.01），大鼠脑组织中Bax的蛋白表达在缺氧组上调，给药组显著下调（P<0.01），为进一步探讨Bcl-2与Bax对凋亡的易感性，对Bax/Bcl-2的比例进行比较，结果显示，与对照组相比，缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞凋亡从而防治高原脑水肿。
图 2 大鼠脑组织中凋亡相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.3 周期相关蛋白的表达
如图3所示，与对照组相比，大鼠脑组织中周期相关蛋白CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2的表达在缺氧组均下调（P<0.05）；与缺氧组相比，在给药组中，CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2蛋白的表达显著上调（P<0.05）。结果提示，7-HEC可能参与细胞周期调控从而防治高原脑水肿。
图 3 大鼠脑组织中周期相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较；*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较2.4 自噬相关蛋白的表达
如图4所示，大鼠脑组织中P62的蛋白表达在缺氧组极显著上调，给药后显著下调（P<0.01）；与对照组相比，大鼠脑组织中LC3-B的蛋白表达在缺氧组显著下降，与缺氧组相比，给药组极显著上调（P<0.01）。结果提示，7-HEC可能参与细胞自噬过程从而防治高原脑水肿。
图 4 大鼠脑组织中自噬相关蛋白电泳图及蛋白表达量（$ \bar x \pm s $ ，n=3）#P<0.05，##P<0.01，与对照组比较； **P<0.01，与模型组比较3. 讨论
氧化应激是一种有害事件，可导致活性氧大量产生或抗氧化防御功能不足，损害神经血管单元的完整性，造成神经元不可逆死亡，进而血脑屏障破坏形成脑水肿[8]。MDA是脂质过氧化的产物，其含量可以间接反映组织氧化应激的水平，SODs是一类具有催化超氧化物生成过氧化氢的抗氧化酶[9]，可以直接或间接地反映氧化应激的水平。本研究发现，经给药干预后，大鼠脑组织MDA含量显著降低，SOD活力显著提高，表明7-HEC可改善脑水肿大鼠的氧化损伤，从而对脑水肿起到一定的预防作用。
研究表明，缺氧与细胞周期、凋亡、自噬密切相关，细胞周期蛋白表达异常会引发细胞凋亡[10]。细胞周期失调的细胞有机会通过DNA损伤反应的各种机制来阻止DNA修复、细胞周期调节和DDR基因转录。目前研究认为，自噬是另一种DDR机制，它通过促进或防止细胞死亡来应对DNA损伤，从而发挥作用[11]。细胞周期从G1期到S期的调节因子是CDK2蛋白，自噬主要影响细胞周期的G1期和S期，因此自噬与周期也存在密不可分的关系。
细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡方式，是一种正常的生理变化。缺氧是细胞凋亡的诱导因子之一，细胞凋亡加剧是低氧环境诱发机体机能损伤的重要途径[12]。其受Bax和Bcl-2控制。Bcl-2蛋白的过表达在动物模型中被证明可以减轻肝和肾的损伤，而Bax的过度表达则可诱导细胞凋亡[13]。本实验的结果表明，缺氧组大鼠脑组织中Bax/Bcl2比值降低，诱导细胞凋亡，加重脑水肿，7-HEC可上调Bax/Bcl2比值，进而抑制细胞凋亡，起到抗高原脑水肿的作用。
细胞周期在细胞增殖和分裂中起着关键作用，其由两类蛋白精确调控，CDKs、cyclin作为关键的周期蛋白。这两类蛋白决定了细胞维持在停滞状态或继续进行细胞周期。细胞周期抑制已被证明可以提供神经保护，减少星形胶质细胞瘢痕形成和微胶质激活，并改善创伤性脑损伤后的运动和认知恢复[14]。在本实验中，缺氧环境可下调周期蛋白的表达，而7-HEC可上调周期蛋白的表达，对高原脑水肿起到一定的预防作用。
缺氧与自噬密切相关。缺氧条件下，会诱导自噬的发生。自噬是一种高度调控的连续过程，它是一种重要的程序性细胞死亡[15]。LC3蛋白与P62蛋白相互作用，是自噬的标志物。P62蛋白通常存在于自噬体中，并在自溶酶体形成时被降解[16]。LC3蛋白是哺乳动物自噬蛋白和自噬小体标记物，LC3B是自噬体标记的四种不同亚型中使用最广泛的一种。自噬受体包括P62等一系列连接泛素化底物和LC3的适配器，自噬体一旦形成，就会经历成熟阶段，然后与溶酶体融合，发生自噬。此外，P62还可调节细胞凋亡，主要通过选择性减少胞质中促凋亡蛋白来减轻细胞死亡，保护机体免受伤害[17]。在本实验中7-HEC可下调P62、上调LC3B的表达，从而促进自噬，保护机体免遭高原脑水肿损害。
凋亡、自噬、周期三种生物过程相互联系，相互影响，作用于机体，保障机体的正常运行。凋亡、自噬、周期相关因子的变化又会影响氧化应激通路的发生发展。在本实验中，7-HEC降低大鼠脑组织中MDA含量，上调SOD含量，从而抑制HACE引发的氧化应激；其还可上调周期和自噬蛋白的表达，从而增强大鼠脑神经元细胞的增殖活性，加速损伤细胞的自噬，保护机体免受HACE的损害。综上，7-HEC可抑制细胞凋亡和周期，增强自噬，进而抑制机体氧化应激，从而达到防护高原脑水肿的作用。
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表 1 昆仙胶囊部分活性成分
成分代码 化合物名称 OB(%) DL MOL000006 木犀草素（luteolin） 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素（quercetin） 46.43 0.28 MOL000211 迈林（mairin） 55.38 0.78 MOL000296 赫达拉汀（hederagenin） 36.91 0.75 MOL000354 异鼠李素（isorhamnetin） 49.6 0.31 MOL000358 β-谷固醇（beta-sitosterol） 36.91 0.75 MOL000359 谷甾醇（sitosterol） 36.91 0.75 MOL000422 山奈酚（kaempferol） 41.88 0.24 MOL000449 豆甾醇（stigmasterol） 43.83 0.76 MOL000622 甘露聚糖（magnograndiolide） 63.71 0.19 MOL000953 胆固醇(cholesterol) 37.87 0.68 MOL001323 谷固醇α1(sitosterol alpha1) 43.28 0.78 MOL001494 甘露醇 (mandenol) 42 0.19 MOL001495 亚油酸乙酯（ethyl linolenate） 46.1 0.2 MOL001510 24-表氨酯（24-epicampesterol） 37.58 0.71 MOL001558 芝麻素（sesamin） 56.55 0.83 MOL001645 乙酸亚油酯（linoleyl acetate） 42.1 0.2 MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol 36.91 0.75 MOL001792 甘草苷元（liquiritigenin） 32.76 0.18 MOL001979 羊毛甾醇（lanosterol） 42.12 0.75 
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