随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药^[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端^[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得^[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等^[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖^[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上^[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用^[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍^[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。

1.   材料与仪器

1.1   实验材料

黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。

1.2   实验试剂

D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：20230420）、丙酮（批号：20230807）、石油醚（批号：20220507）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。

1.3   实验仪器

鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。

1.4   实验动物

SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。

2.   方法

2.1   黑蒜多糖的提取

取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。

2.2   多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法^[14]测定多糖含量。

2.2.1   葡萄糖标准曲线绘制

精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。

2.2.2   样品测定

精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。

计算公式：黑蒜多糖得率（%）=$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $

黑蒜多糖纯度（%）=$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $

式中：$ W $1为黑蒜质量（g）；$ W $2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $为提取溶剂体积（ml）；$ D $为样品稀释倍数。

2.3   动物实验给药剂量及配置

乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d^[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。

CO.D混悬液：参考贾红慧等^[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。

黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等^[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。

墨汁^[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。

含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。

2.4   实验动物分组及给药方法

2.4.1   小鼠小肠墨汁推进实验

小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。

按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。

计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%

2.4.2   小鼠排便实验

分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。

计算公式：粪便含水量（%）=$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $

式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。

2.5   统计学方法

采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（$ \bar{X} $±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

3.   结果与分析

3.1   黑蒜多糖的得率和纯度

精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=2.2829 X+0.0764，相关系数r=0.9982，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。

3.2   黑蒜多糖对小鼠体重的影响

从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。

表  1  黑蒜多糖对小鼠体重的影响

组别	小鼠小肠墨汁推进实验			排便实验
	初始体重 （m/g）	最终体重 （m/g）		初始体重 （m/g）	最终体重 (m/g)
空白组	21.28±1.15	22.23±1.19		21.80±1.02	22.90±0.61
模型组	21.20±1.36	22.24±1.22		21.58±1.00	22.64±0.84
阳性组	21.17±1.18	22.31±1.28		21.42±1.01	22.81±0.91
黑蒜多糖 低剂量组	21.44±1.32	22.38±1.54		21.98±1.20	23.02±1.20
黑蒜多糖 中剂量组	21.06±1.13	22.16±0.77		21.59±1.10	22.38±1.08
黑蒜多糖 高剂量组	21.42±1.15	22.54±1.26		21.79±1.29	22.85±0.98

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3.3   黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响

从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。

表  2  黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响

组别	碳末推进距离 （l/cm）	小肠总长度 （l/cm）	墨汁推进率 （%）
空白组	28.86±3.25	34.87±1.60	82.90±9.97
模型组	9.60±0.73***	34.09±2.31	29.50±1.35***
阳性组	26.94±3.55###	34.15±1.60	79.00±9.92###
黑蒜多糖 低剂量组	12.58±1.15###	34.35±1.67	36.80±4.42#
黑蒜多糖 中剂量组	16.01±2.06###	34.48±3.18	46.30±4.19###
黑蒜多糖 高剂量组	19.95±1.60###	34.66±1.96	57.60±4.06###
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。

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3.4   黑蒜多糖对小鼠排便的影响

从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。

表  3  黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响

组别	首黑便时间 （t/min）	6 h排便数 （粒）	6 h排便湿重 （m/g）	6 h排便干重 （m/g）	含水量 （%）
空白组	111.50±8.98	16.50±3.51	0.46±0.10	0.22±0.04	52.16±2.53
模型组	241.50±19.54***	11.13±2.75**	0.19±0.02***	0.13±0.01***	32.58±2.35***
阳性组	121.50±110.81###	15.13±4.09#	0.41±0.12###	0.20±0.06##	50.06±1.83###
黑蒜多糖低剂量组	138.75±10.79###	13.75±2.71	0.32±0.08##	0.19±0.42#	42.34±2.27###
黑蒜多糖中剂量组	132.88±8.34###	14.63±3.66#	0.34±0.10##	0.19±0.05##	43.26±2.68###
黑蒜多糖高剂量组	130.88±9.09###	14.75±3.73#	0.34±0.12##	0.19±0.05##	44.25±6.72###
注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。

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4.   讨论

CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药^[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10^[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况^[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。

FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关^[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖^[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便^[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因^[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。