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神经炎症是外周血液系统和中枢神经系统中免疫细胞活化和浸润、神经胶质细胞活化和炎性介质产生的过程[1]。脊髓中产生的炎性神经胶质介质调节突触传递，诱导和维持慢性疼痛，并提供神经炎症和慢性疼痛之间的联系[2]。炎症疼痛是一种常见的慢性疾病，以往研究提示，前动力蛋白（prokineticin，PK）系统参与组织损伤和神经损伤后的外周和中枢敏化，其在炎症疼痛中的作用已经被证实[3]。本文针对近年发表的有关PK系统参与炎症疼痛的研究文献，回顾性分析该镇痛靶点所发挥的镇痛机制。
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PK信号通路是近年来新发现的介导疼痛发生和维持的重要调节通路，包括两种结构上关联的小分子肽PK1和PK2，以及相应的G蛋白偶联受体PKR1和PKR2[4]，PKs及其受体广泛分布在许多人体组织中，例如卵巢、睾丸、肾上腺、胎盘、子宫、大脑、肠道、心脏、骨髓和外周血。虽然PKR1和PKR2在多种组织中共同表达，但PKR1主要表达于外周组织，包括生殖系统[5]的内分泌腺和器官、胃肠道、脾脏、胰腺、肺、心脏和血细胞[6]。PKR2主要在脊髓背角神经元和星形胶质细胞中表达，PKR1主要存在于星形胶质细胞和外周神经元的末端，主要分布于背角的表层（图1）。PK2对这两种受体的亲和力均略高于PK1，而PK1在DRG（背根神经节）和脊髓中不表达，更多地参与血管生成[7]，PK1是强有力的血管生成因子，被认为在内分泌腺、心血管、肾脏、肿瘤等血管新生中发挥重要作用。
图 1 PK2介导躯体疼痛的外周与中枢敏化机制示意图
PKs在神经系统、免疫系统、生殖系统、心血管系统等多部位发挥广泛的生理作用[8]，此外PK2可通过降低对化学和机械刺激的疼痛阈值，PKRs的拮抗剂可以用来缓解关节炎炎症和急慢性疼痛[9-10]。PKs通过激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上的PKRs，释放炎性细胞因子，触发和维持炎性疼痛（图1），调节免疫炎症反应，而在外周，PK2 /PKR2参与心脏和肾脏新生血管的形成，PKR1的缺失会引起心脏和肾脏的结构和功能变化[11-12]。因此，PKs系统在体内发挥着广泛的生理作用，也是众多疾病的潜在治疗靶点。
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PK系统在调节与伤害相关的伤害性事件方面起着关键作用，因为它可以调节炎症反应，并同时作用于中枢和外周神经系统。PKRs的激活可以引起痛觉感受，参与痛觉感受器对不同刺激的敏感性。PK系统（PKs和PKRs）是在免疫细胞中参与炎症发生和疼痛传递的重要环节，如PK2参与免疫调节，诱导骨髓细胞分化为单核细胞系和巨噬细胞系，并通过激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上的PKRs，释放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子，触发和维持炎性疼痛，调节免疫炎症反应[13]。
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PK2在炎症细胞中呈强上调，并在病理状态下维持炎症循环。在纳摩尔范围内，PKs结合并激活受体PKR1和PKR2，使PK2在粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞中表达，尤其在局部炎症后表达增加。此外，PK2在免疫细胞和神经胶质细胞中被强烈上调，并在炎症组织中，维持促炎循环。在中性粒细胞依赖性炎症和超痛觉过敏中起关键作用[14]。第一个关于PK的促痛作用的证据来自于对啮齿动物全身注射Bv8/PK2，激活其位于痛觉传入通路的PKRs受体而引起机械和热刺激痛觉过敏[15-16]。在完全弗氏佐剂(CFA)诱导的慢性炎症动物模型中，炎症与浸润炎症组织的粒细胞中PK2的过表达呈高度正相关，而PK2的上调则与炎症相关的痛觉过敏也有关，PKR1拮抗剂PC1能够有效消除CFA引起的痛觉过敏，PC1能明显抑制疼痛、水肿和外渗[17]。PK2在人和动物炎症组织中过表达，主要在浸润的中性粒细胞中作为主要的前感受介质之一，通过激活初级传入神经元上的PKRs受体（图1），增强伤害性信号向中枢神经系统传递。PK2反过来调节血管生成和血管通透性，激活巨噬细胞，并通过PKRs调节毛细血管内皮细胞和白细胞的免疫反应，使得炎症反应循环。
PKR1和PKR2基因的缺失大大降低了炎症诱导的热敏感性和机械敏感性[18-19]，但是只有PKR1基因的缺失才会降低PK2的上调，这表明这两种受体虽然都介导疼痛的感受和传递，但只有PKR1参与了炎症过程中Bv8/PK2表达水平的增强。外周局部给予PKRs拮抗剂（PC1或PC7）后疼痛明显减轻，与Bv8/PK2对血管通透性的影响效果一致。在CFA诱导的大鼠或小鼠炎症模型中，在它们健康的爪子中很难检测到的PK2 mRNA，而在炎症皮肤中显著增加，且与浸润细胞(粒细胞和巨噬细胞)相关，并与疼痛和其他炎症在时间上相关。粒细胞释放PK2直接作用于痛觉受器，调节急性炎症性疼痛，进而发挥趋化作用，诱导促炎性巨噬细胞表型，并使Th1（T淋巴细胞1）/Th2（T淋巴细胞2）失衡向Th1倾斜[20-21]，抑制Th1介导的免疫反应发挥抗炎作用。
PK2通过激活初级传入神经元上的PKR1和PKR2参与调节痛觉感知（图1），PKRs根据细胞定位可能与G蛋白结合，并激活不同的细胞内信号通路。在单核细胞/巨噬细胞/小胶质细胞谱系中，以及在DRG及脊髓中，PKRs是Gq偶联受体，通过激活磷脂酶C-β (PLC)和形成IP3，促进细胞内Ca2+的动员，诱发蛋白激酶C (PKC) -ε易位到质膜，外周高度表达的PKRs能够对TRPV1（瞬时感受器电位香草素亚型1）和TRPA1 (瞬时感受器电位锚蛋白亚型1)的促进性激活有助于外周敏化[22]，尤其是PKR1定位于表达TRPV1和TRPA1的伤害性感觉纤维，在外周DRG水平这些共定位表达，为通过激活PKC-ε的痛觉敏化的协同作用提供了解剖学基础。在大鼠初级感觉神经元中，PK2还通过PKC信号通路增强了门控离子通道电流、抑制GABA激活电流、敏化嘌呤核苷酸P2受体(P2X)[23]。对PK2反应的DRG神经元中50%也表达参与疼痛处理的神经介质，如降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质，且在这些神经元暴露于PKs时释放这些神经肽，提示PKs不仅仅参与调节中枢疼痛机制[24]。
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脊髓PK2主要存在于小鼠脊髓星形胶质细胞中[25]，最大密度的PKRs位于背角[26]，这表明这些受体可能参与了伤害性信号的中枢传递。非神经元细胞如星形胶质细胞、小胶质细胞等都有PKR1表达，此外，PKR1受体在人和啮齿类单核/巨噬细胞上也比PKR2更为丰富。免疫组化定位显示，PKR1与进入背角和外皮层的伤害感受器末端有关，PKR2存在于沿着浅背角的神经元胞体中，也有可能是投射神经元。PK2诱导脊髓背角和活化的星形胶质细胞中PKRs的激活，有助于中枢敏化和维持慢性痛、神经性疼痛，而且PK2作用于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上的PKRs，还能诱导炎症因子和致痛因子的释放[27]。在慢些压迫性损伤(CCI)模型中发现，PK2在脊髓星形胶质细胞和初级感觉神经元中表达上调[26]。同时，PK2可抑制下丘脑、导水管周围灰质（PAG）脑区中脑啡肽 (ENK)阳性神经元的动作电位放电，表明PK2能够抑制这类细胞释放阿片样物质。通过配体和受体在神经元和星形胶质细胞中的不同分布，PK2既可以诱导星形胶质细胞激活，发挥星形胶质细胞分泌生长因子的功能，也可以促进脊髓神经元的兴奋性突触传递，增强中枢敏化。PK2小分子拮抗剂改善持续疼痛超敏反应的能力以及在“神经元-神经胶质”和“神经元-免疫细胞”相互作用中分子变化，表明了PK2信号在这种行为中的重要性（图1）。阻断PK受体的药物可能为治疗慢性疼痛状态提供一种新形式[28]。在啮齿动物中注射PK2可激活位于疼痛传递主要部位的PKRs受体诱导对机械和热刺激的痛觉过敏[15]。痛觉过敏的初始阶段是由对伤害感受器的局部作用引起的，痛觉过敏的第二阶段是由于中枢作用引起的[24]，表明PKs /PKRs在中枢与周围部位的作用存在差异。在敲除PK2基因的小鼠中进行研究表明，PKs在疼痛感知中具有直接作用，与正常野生型小鼠相比，基因敲除的小鼠对温度和化学刺激的伤害感受降低[18-19]。
损伤部位异常增加的IL-6、IL-1β反过来促进PK2的释放，进一步促进外周免疫细胞的过度激活，加速外周敏化的形成和维持。在DRG和脊髓中，PKR通过Gq激活后增加细胞内钙和诱发蛋白激酶C (PKC) -ε易位到质膜，PK2能够敏化表达TRPV1和TRPA1的痛觉感受器，从外周组织、DRG和脊髓等部位发挥多途径的抑制PK系统的激活而发挥镇痛效应。
综上所述，PKs在疼痛的发生和维持中发挥了重要作用，其在调节与伤害相关的伤害性事件方面起着关键作用，在未来的研究中，有望以PKs信号通路为靶点研究出新的治疗药物。
Prokineticin 2 mediates peripheral and central sensitization of somatic pain
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摘要: 前动力蛋白2(prokineticin 2，PK2) 是新近发现的一种趋化因子，通过与受体PKR1和PKR2结合，参与机体多种生理功能。PK信号通路是近年来新发现的组织损伤和神经损伤后疼痛发生和维持的重要调节通路，其在调节伤害性事件方面起着关键作用，是众多疾病的潜在治疗靶点。PKRs的激活可以引起痛觉感受，参与痛觉感受器对不同刺激的敏感性。PK系统（PKs和PKRs）是在免疫细胞中参与炎症发生和疼痛传递的重要环节。PK2通过激活初级传入神经元上的PKR1和PKR2参与调节痛觉感知，在大鼠初级感觉神经元中，PK2还通过PKC信号通路增强门控离子通道电流，抑制γ-氨基丁酸(GABA)激活电流，敏化嘌呤核苷酸P2受体(P2X)。本文围绕PK2在躯体疼痛中的研究进展进行述评，以期在未来的研究中，有望找到以PK信号通路为靶点的炎性疼痛治疗的新药。Abstract: Prokineticin 2 (PK2) is a newly discovered chemokine, which participates in various physiological functions of the body by binding to receptors PKR1 and PKR2. PK signaling pathway is a newly discovered important regulatory pathway for the occurrence and maintenance of pain after tissue injury and nerve injury in recent years. It plays a key role in regulating injury-related nociceptive events and is a potential therapeutic target for many diseases. The activation of PKRs can induce pain sensation and participate in the sensitivity of pain receptors to different stimuli. The PK system (PKs and PKRs) is an important link involved in inflammation and pain transmission in immune cells. PK2 is involved in the regulation of pain perception by activating PKR1 and PKR2 on primary sensory neurons. In rat primary sensory neurons, PK2 also enhances gated ion channel current through the PKC signaling pathway, inhibits GABA-activated currents, and sensitizes purine nucleotide P2 receptor (P2X). This paper reviews the research progress of PK2 in physical pain. We hope to find new drugs for the treatment of inflammatory pain that target the PKs signaling pathway in future studies.
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Key words:
- prokineticin 2 /
- somatalgia /
- PKR1 /
- PKR2 /
- peripheral sensitization /
- central sensitization
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溃疡性结肠炎（ulceractive colitis, UC）属于炎症性肠病的一种，有着较高的发病率，其特征为损伤性炎症，近年来有关其病因及发病机制的研究受到广泛关注，但至今仍不明确[1]。对于溃疡性结肠炎的治疗目前多采用手术、抗感染、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，但上述治疗手段均为对症治疗，且药物长期使用的不良反应很容易造成疾病复发[2]。因此，探究溃疡性结肠炎的发病机制，将为今后治疗药物的研发提供理论基础。
Metrnl（Meteorin-like）是近年来新发现的神经营养因子，也叫Cometin, Subfatin或是IL-39[3-4]。 Jorgensen等[4]在2012年将Metrnl描述为类似于Meteorin（Metrn）的神经营养因子。Metrnl基因开放阅读框包含4个外显子，由936个碱基对编码311个氨基酸。Metrnl蛋白包含45个N端信号肽序列，切除信号肽后的266个氨基酸构成分子量约为30 000的成熟蛋白分子，整个蛋白分子没有穿膜区域，是一种分泌蛋白。到目前为止，关于Metrnl功能的研究较少，我们前期针对该蛋白相关研究确认Metrnl为一种新的细胞因子，阐明了Metrnl通过PPARγ信号通路介导胰岛素的增敏作用的重要机制[5]。 Jorgensen等[4]报道了Metrnl在神经突触生长和成神经细胞迁移中的神经营养活性。Watanabe等[6]报道，Metrnl是潜伏过程（Latent process，LP）基因，可用于细胞分化和神经突触延伸。脂肪组织Metrnl能促进脂肪细胞分化、改善代谢、抑制炎症从而调节脂肪功能，对抗肥胖引起的胰岛素抵抗[7]。通过检测Metrnl在各种组织中的表达，我们发现Metrnl在人和小鼠胃肠组织中，特别是在肠上皮细胞中都高度表达，并发现肠上皮Metrnl敲除后可以通过抑制肠上皮细胞的自噬而加重溃疡性结肠炎，提示 Metrnl是溃疡性结肠炎的治疗靶点[8]。
肠道微环境形成了良好的微生物群栖息地，肠道微生物群被认为是人体的重要器官，越来越多的研究将这种微生物环境与胃肠道疾病联系起来。肠道菌群在溃疡性结肠炎中起着重要作用，如在无菌状态下，无法制备出某些小鼠结肠炎模型（如IL-10缺陷型小鼠等）[9-10]。也有研究报道，在治疗溃疡性结肠炎患者时，联合使用抗生素也显示出了较好疗效[11]。此外，与健康人群相比，溃疡性结肠炎患者的肠道菌群组成也发生了显著变化[12]。但由于人类肠道菌群的复杂性和多样性，目前尚未清楚某些特定菌属与溃疡性结肠炎发病机制的关系。
因此，本研究聚焦溃疡性结肠炎，从肠道微生态角度出发，探究肠上皮Metrnl对于溃疡性结肠炎的作用以及对肠道菌群调节机制的影响。
1. 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
雄性C57小鼠（8周龄，20只，16~20 g），上海西普尔-必凯实验动物有限公司（生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016）。Villin-cre小鼠[B6.Cg-Tg(Vil1in-cre)1000Gum/J，021504]，2只，16~20 g，美国JAX公司（北京澄天生物科技有限公司代理），生产许可证号：SYXK（京）2018-0016），用于产生肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠（Metrnl(-/-)）。所有小鼠饲养于相对洁净环境下，使用独立通风系统（individual ventilated cages, IVC）动物房，温度恒定（22~26 ℃），室内明暗交替12 h（08:00至20:00照明），相对湿度为40%~70%，笼内维持正压20~25 Pa，每小时换气60~70次。所有实验动物的使用，都经过海军军医大学动物管理机构的同意和认证，符合实验动物饲养及相关管理规定。所有动物实验均按照美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南进行，并得到海军军医大学动物伦理委员会的批准。IVC系统购自上海鸣励实验室科技发展有限公司。TRIzol试剂（15596026），美国Invitrogen公司；葡聚糖硫酸钠盐（dextran sodium sulfate，DSS），MFCD00081551，分子量36 000~50 000，美国MP公司，引物，生工生物工程有限公司；包埋机（JB- L5，德国徕卡有限公司）；切片机（RM2126，德国徕卡有限公司）；RT-PCR仪器（ABI 7500系统，美国赛默飞公司）；粪便DNA提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，Qiagen, Hilden, 德国）；紫外微量分光光度计（NanoDrop 2000，Thermo Scientific, 美国）；DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNA GelExtraction Kit，Axygen Biosciences, 美国）；微型荧光计（QuantiFluor-ST，Promega, 美国）；测序仪（Illumina MiSeq，Illumina, 美国）。
1.2 肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除小鼠的制备
首先按照本课题组已报道的方法[5]制备Metrnlloxp/loxp小鼠。根据报道的Metrnl(-/-)小鼠的繁殖策略[13]，即将Metrnlloxp/loxp小鼠与购买的Villin-Cre小鼠进行交配，产下后代小鼠基因型为Metrnlloxp/wtVillin-Cre。将Metrnlloxp/wtVillin-Cre小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠交配，产生下一代Metrnlloxp/loxpVillin-Cre小鼠。继续与Metrnlloxp/loxp交配，产下的后代，经基因型鉴定分别为Metrnlloxp/loxpVillin-Cre（Metrnl(-/-)）和Metrnlloxp/loxp（Metrnl(+/+)）。
1.3 RT-PCR定量肠道组织Metrnl mRNA表达
按照本课题组已报道的方法[3]，使用TRIzol试剂从肠道组织中提取总RNA，并使用ABI 7500系统进行RT-PCR。最终的20 μl反应混合物包括10 μl SYBR Green，2 μl cDNA模板和1 μl引物。通过重复反应确定平均阈值循环（Ct），将靶基因表达标准化为GAPDH，并使用ΔΔCT方法获得定量测量结果。Metrnl上游引物（F）CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT，下游引物（R）GGACAACAAAGTCACTGGTACAG；GAPDH上游引物（F）GTATGACTCCACTCACGGCAAA，下游引物（R）GGTCTCGCTCCTGGAAGATG。
1.4 DSS诱导肠炎模型制备
雄性C57小鼠（8周龄）于实验室适应2周后，按照本课题组已报道的方法进行模型制备[7]，将DSS溶于水中，分别至终浓度为3%和1%，让小鼠自由饮用。
小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分，按照我们之前已报道的的评分标准进行评分[8]，对体重下降程度、大便性状、血便情况共3部分分别进行评分，然后进行加和，计算总分数。具体评分标准如下（表1）。
表 1 小鼠溃疡性结肠炎疾病程度评分表疾病评分 体重下降 (%) 大便性状 大便潜血 0 <1 正常 阴性 1 ≥1-5 - + 2 ≥5-10 软 ++ 3 ≥10-15 - +++ 4 ≥15 腹泻 ++++ 注：“-” 无此性状；“+” 潜血程度。 1.5 结肠长度检测及HE染色
小鼠处死后，取整个结肠部位，测量长度进行比较。然后将结肠下段部位组织用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切至4 μm的切片，按照之前的实验方法[14]，进行HE染色，染色后在光学显微镜下观察炎症细胞浸润情况，组织损伤情况并拍照记录。
1.6 肠道菌群测定
使用16S核糖体RNA基因测序技术检测肠道菌群。为了进行样品收集和DNA提取，从实验小鼠中收集粪便样品，并在取样后3h内将其冷冻在−80°C下。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行DNA提取。使用NanoDrop 2000测量细菌DNA的浓度。然后，将16S核糖体RNA基因测序用于检测细菌DNA。基因的V3-V4区域使用FastPfu聚合酶通过条形码索引引物（338F和806R）进行PCR扩增。然后通过AxyPrep DNA GelExtraction Kit，凝胶提取纯化扩增子，并使用QuantiFluor-ST进行定量。将纯化的扩增子以等摩尔浓度合并，并使用Illumina MiSeq仪器进行末端配对测序。
1.7 微生物宏基因组学分析
16S rRNA测序数据由Quantitative Insights Into Microbial Ecology平台（V.1.9.1）处理，并进行了MegaBLAST搜索，将生物分类单位的读数（OTU）与国家生物技术信息中心16S rRNA数据库中的参考序列比对。按照文献报道的方法[15]进行宏基因组学分析，从16S rRNA序列推算肠道微生物组的基因组，并且对每个样品的基因含量进行了预测。
1.8 统计分析
本实验结果数据以（
$\bar x $ ±s）表示，使用SPSS18.0软件进行统计分析。多组以上比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组与正常对照组比较采用Dunnett t检验法，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 Metrnl(-/-)小鼠未表现结肠炎症状
我们构建了肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除（Metrnl(-/-)）小鼠，并检测了Metrnl mRNA在大肠和小肠组织中的表达。结果表明，Metrnl(-/-)小鼠中Metrnl mRNA的表达在结肠和小肠组织中极低（图1A）。 HE结肠切片显示Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间均无组织损伤和炎症细胞浸润（图1B）。以上结果表明，肠上皮细胞特异性Metrnl基因敲除后不会诱发溃疡性结肠炎。
2.2 溃疡性结肠炎模型制备条件的选择
在建立DSS诱发的溃疡性结肠炎模型之前，为了选择最佳的观察时间和DSS给药浓度，我们分别选择3％DSS和1％DSS进行造模，并观察了不同DSS浓度下C57小鼠的存活时间。结果显示，在3％DSS组的第6天，出现了小鼠死亡；直至给药10 d，全部小鼠死亡（图2A）。在1％DSS组中，未观察到小鼠死亡。与对照组相比，3％DSS组的小鼠体重在第5天时显著性降低（P<0.05），而1％DSS组的体重并无显著改变（图2B）。同样，与对照组相比，3％DSS组小鼠DAI增加（P<0.05），结肠长度显著性缩短（P<0.05），而1％DSS组在疾病活动指数、结肠长度方面均无明显变化（图2C-D）。 组织形态学方面，3％DSS组表现出结肠炎表型，具有明显的组织损伤，而对照组并无明显变化（图2E）。因此，我们选择3％DSS和5 d的给药时间作为后续实验条件。
2.3 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响
给予Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠3％DSS后，两组小鼠均表现出溃疡性结肠炎症状，其特征为持续的体重减轻、疾病活动指数增加、血性腹泻、结肠长度缩短以及结肠炎症（图3）。在此过程中，在给药后第5天时，与Metrnl(+/+)小鼠体重减轻（−8.27± 1.32）%相比，Metrnl(-/-)小鼠的体重减轻（−14.92±1.05）%，具有统计学差异（P<0.05，图3A）；与Metrnl(+/+)小鼠的疾病活动指数（6.00±1.63）相比，Metrnl(-/-)小鼠显著增加至（9.67±1.38）（P<0.05，图3B）；与Metrnl(+/+)小鼠结肠长度（7.08±0.89 cm）相比，Metrnl(-/-)小鼠结肠更短（5.77±0.58 cm）（P<0.05）（图3D）；为了排除上述差异不是由小鼠摄入不同量的3%DSS引起的，我们还检测了两组小鼠的饮水量。结果显示两组小鼠饮水量之间并无显着差异（图3C）。
图 3 Metrnl敲除后对DSS诱导的溃疡性结肠炎的影响A. 体重；B.疾病评分；C.水摄入量；D.结肠长度；E.结肠组织HE染色P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。2.4 Metrnl缺乏对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的菌群平衡的影响
我们通过高通量16S rRNA基因测序，检测了Metrnl对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中肠道菌群的影响。应用Chao1 丰度估计量（chao1 richness estimator），香农多样性指数（shannon diversity index），辛普森多样性指数（simpson diversity index）三种指标评价各组小鼠中菌群的Alpha多样性（图4A-C）。结果显示，在未进行DSS造模之前，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠的Alpha多样性并无显著差异；而进行3%DSS造模后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠出现了差异，其中Metrnl(-/-)小鼠多样性显著下降（图4A-C）。主成分分析显示，在给予3%DSS造模后的Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠之间微生物的组成显著不同（图4D）。检测小鼠粪便微生物组成，结果显示，在“门”这一层面，给予3%DSS后拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）在Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间存在显著的不同（图4E）。在Metrnl(-/-)小鼠中，Bacteroidetes和Proteobacteria显著降低，而Firmicutes显著升高。在“纲”这一层面，发现给予DSS后，Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）具有显著差异。值得注意的是，拟杆菌纲（Bacteroidia）属于拟杆菌门（Bacteroidetes）；梭菌纲（Clostridia）属于厚壁菌门（Firmicutes）（图4F）。为了进一步探究影响给予DSS后造成Metrnl(-/-)和Metrnl(+/+)小鼠间状态的原因，我们又在“目”层面进行了检测，结果显示（图4G），拟杆菌目（Bacteroidales），属于杆菌纲（Bacteroidia）；梭菌目（Clostridiales），属于梭菌纲（Clostridia）发生了显著改变。
图 4 肠上皮Metrnl 敲除对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群动态平衡的影响A. Chao1丰度估计量；B.香农多样性指数；C.辛普森多样性指数；D.主成分分析；E.门水平上的丰度；F.纲水平上的丰度；G.目水平上的丰度P<0.05，与DSS-Metrnl(+/+)组比较。3. 讨论
本研究用DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型并从对肠道微生物影响的角度出发，探究肠上皮Metrnl特异性敲除对于肠道菌群调节的影响以及对溃疡性结肠炎的作用。发现Metrnl在溃疡性结肠炎小鼠模型中具有保护的功能，该效应可能是Metrnl通过对肠道菌群的调节所致。 近期有一篇关于Metrnl改善克罗恩氏病（CD）的报道，该研究表明肠系膜脂肪组织与肠道存在交互作用，发现小鼠在给予Metrnl后，可通过激活STAT5/PPARγ信号通路，从而达到促进脂肪细胞分化来减轻肠系膜脂肪组织病变的作用[16]。该研究表明Metrnl确实可以影响炎症性肠病的发生发展。除此以外，我们进一步证实了，肠上皮特异性Metrnl敲除后可以加重DSS诱导的溃疡性结肠炎，并且该作用是通过抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路，下调了肠上皮细胞自噬水平产生的[7]。
肠道微环境形成了合适的微生物群栖息地，已证明会影响多种消化系统疾病的发生[17]。肠道菌群稳态的紊乱已被广泛认为与炎症性肠病的发病机制和进展密切相关[8]。肠道菌群主要有三种功能，分别是代谢作用，保护作用和营养作用[18-19]。正常人肠道中在“门”这一层面，主要有四类微生物群，包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形杆菌门（Proteobacteria）[20-21]。
溃疡性结肠炎的主要特征是有益细菌的减少。拟杆菌门（Bacteroidetes）是革兰阴性厌氧细菌，构成了哺乳动物胃肠道中主要微生物群[22]。目前认为，拟杆菌门可以通过免疫调节和维持体内平衡而对宿主发挥有益作用。据报道，拟杆菌门可以通过分泌多糖A（polysaccharide A, PSA）来增强抗炎因子IL-10的mRNA表达[23-24]。本研究结果显示出类似趋势，在给予3%DSS进行溃疡性结肠炎造模后，Metrnl(-/-)小鼠症状更加严重，与Metrnl(+/+)小鼠相比，其拟杆菌门的成分显著下降。然而，拟杆菌门在溃疡性结肠炎中并不完全有益。有报道显示，拟杆菌门可以侵入肠道组织并引起个别患者的肠道损伤[25]。因此针对该类菌属的作用还有待进一步验证。除此以外，由于SCFA具有增强肠壁屏障和免疫系统的作用，从而有助于抵抗病原体，因此产生SCFA的菌群目前认为对人体是有益的，例如Faecalibacterium prausnitzii，Roseburia或Eubacterium[26-28]。放线菌门（Actinobacteria）中的双歧杆菌属（Bifidobacterium）也是有益菌群[29-30]。然而，在该属中发现了有争议的结果，因为有研究报道显示，与对照组相比，溃疡性结肠炎患者的Bifidobacterium增加了[31- 32]，其原因可能是疾病程度的造成的。因此，需要进一步的研究来阐明该有益菌群在溃疡性结肠炎中的作用。
相反的，目前很多研究显示菌群在溃疡性结肠炎中显著增加，如变形杆菌门（Proteobacteria）下的黏附侵入性大肠杆菌属（adherent-invasive Escherichia coli）和巴斯德杆菌属（Pasteurellaceae），厚壁菌门（Firmicutes）下的韦荣氏球菌属（Veillonellaceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus gnavus），梭杆菌属（Fusobacterium）。我们的研究结果也显示出类似趋势，在给予DSS后，与Metrnl(+/+)小鼠相比，Metrnl(-/-)小鼠的厚壁菌的成分显著上升。除此以外，以下菌属也被认为具有潜在致病性，如大肠杆菌属（Escherichia），沙门菌属（Salmonella），耶尔森菌属（Yersinia），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），幽门螺杆菌属（Helicobacter），弧菌属（Vibrio）[31, 33-36]。目前报道较多的是黏附侵入性大肠杆菌，此种细菌能够黏附并穿过肠道黏液屏障，侵入肠道上皮层，促进TNFα分泌和炎症的发生[37-38]。本研究表明，肠上皮特异性Metrnl敲除后，在3%DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中，导致肠道菌群动态平衡的进一步紊乱，表明恢复菌群动态平衡对于治疗溃疡性结肠炎至关重要。
需要注意的是，大量研究表明，目前并没有明确具体的哪一种微生物群对人体是有益的，因为每个人的菌群特征都不同。一般而言，只有相对平衡的微生物群，才能最佳地维持人体的代谢和免疫功能以及预防疾病的发展。在健康的肠道中，病原菌和共生菌群可以共存而不会出现问题。但是，这种平衡的任何紊乱都会导致营养不良，从而改变微生物与宿主之间的相互作用[39]。尽管目前普遍认为溃疡性结肠炎中肠环境平衡的破坏是显著发生的，但是造成肠道平衡紊乱的生物学机制的仍然未知，并且不清楚这种紊乱究竟是造成溃疡性结肠炎的原因还是结果。
本研究仍存在不足。首先，肠道微生态对溃疡性结肠炎的保护作用的详细机制仍未探究清楚，特别是肠道中存在的主要4类微生物群（拟杆菌，厚壁菌，放线菌，变形杆菌）对溃疡性结肠炎的作用还有待证实。其次，肠上皮特异性Metrnl敲除后通过调节肠道菌群的组成，从而加重3%DSS诱导的溃疡性结肠炎的作用证据仍不十分充分，需要今后在进一步的研究中加以阐明。
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