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血红铆钉菇[Chroogomphus rutilus (Schaeff.) O.Ƙ. Mill.]，属担子菌亚门伞菌目铆钉菇科铆钉菇属[1]。菌体铆钉状且菌肉为酒红色，故名血红铆钉菇。分布于中国北方及西南多省，以及日本、欧洲及北美多国，主要生于松林中地上的杂草丛林之间，是一种与油松、樟子松、马尾松、赤松共生的外生菌根真菌，群生、散生或单生，营养价值极高，深受人们喜爱[2]。研究表明，血红铆钉菇富含蛋白质、多糖、黄酮、香豆素及甾醇[3-8]等多种活性物质，具有极高的食用和药用价值。随着人民生活水平的提高和科学技术的不断进步，糖化学及其活性研究正在经历着飞速的发展，越来越多的动物多糖、植物多糖、真菌多糖被开发利用。多糖作为食用菌重要的活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、免疫调节、神经保护、降血糖、降血脂[9-13]等诸多药理作用。目前，各类真菌多糖的免疫调节作用研究已广泛开展[14-23]。然而，迄今关于血红铆钉菇多糖开发的研究较少，对其免疫调节作用的研究报道亦少，本文探讨血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性、免疫调节因子释放、NF-κB信号通路激活等一系列的免疫调节作用，以期为血红铆钉菇进一步的开发利用提供依据。
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RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库，储藏于牡丹江医学院医药研究中心−80 ℃冰箱中，经复苏后，置于含10% FBS的DMEM培养基中培养。
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血红铆钉菇经25%乙醇沉淀后，通过DEAE-52纤维柱洗脱出多糖组分CRPS25-Ⅱ，实验室自制。
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κZ-II匀浆仪（Servicebio）；κZ-II酶标仪（Rayto）；D3024R台式高速冷冻型微量离心机、D1008E台式高速冷冻离心机（DRAGONLAB）；Stepone plus荧光定量PCR仪（ABI）；SW-CJ-1FD超净工作台（苏净安泰）；NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo）；G0203-150G化学发光仪（CLINX）；FBZ2001-up-p标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司）。
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RNA提取液(批号：G3013)、引物、RIPA裂解液(批号：G2002)、PMSF(100mM，批号：G2008)、磷酸化蛋白酶抑制剂(批号：G2007)、β-肌动蛋白(批号：GB12001)、GAPDH(批号：GB12002)、Histone H3(批号：GB11026)、HRP标记山羊抗兔(批号：GB23303)、HRP标记驴抗山羊(批号：GB23404)、HRP标记山羊抗小鼠(批号：GB23301)、HRP标记山羊抗大鼠(批号：GB23302)、转移缓冲液(批号：G2017)、电泳缓冲液(批号：G2018)、TBS缓冲液(批号：G0001-2L)均购自Servicebio公司；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，RAW264.7细胞以1×106个细胞/孔接种于96孔板中，随后，置于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h（边缘孔用无菌PBS填充），培养完成后去除原有培养基，加入浓度梯度分别为25、50、100、200、400 μg/ml的血红铆钉菇多糖溶液（各设置6个复孔）于恒温箱中培养12 h。弃去孔内原有培养液，每孔加入配制好的MTT溶液20 μl，连续培养4 h后，弃去原有MTT溶液。每孔加入150 μl DMSO，于恒温箱中孵育10 min后，用锡纸包裹避光，操作轻盈防震，使结晶物充分溶解。孵育完成后，置于490 nm处测定吸光度（A）值。计算细胞增殖活力：细胞增殖活力=[(试验组OD均值－对照组OD均值)/ 对照组OD均值]×100%。实验表明血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在25～400 μg/ml的范围内无明显的细胞毒性，见图1。
图 1 血红铆钉菇多糖对巨噬细胞毒性的影响
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，随后以每孔1×106个细胞接种于六孔培养板中，加入1 ml的DMEM完全培养基，并于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h。设置不同浓度梯度的血色铆钉菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白对照组，于恒温培养箱中孵育12 h。弃去原培养基，PBS清洗2次，加入1 ml的Trizol试剂（冰上操作）。12000 r/min离心10 min取上清。加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min。4 ℃下12000 r/min离心10 min。将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。−20 ℃放置15 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。吸除液体，加入75%乙醇1.5 ml洗涤沉淀。4 ℃下12 000 r/min离心5 min。将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min。加入15 μl无RNA酶的水溶解RNA。55 ℃孵育5 min。使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μl待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，开始吸光值检测。将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为100～500 ng/μl。
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取一PCR管，加入含10 μl RNA的溶液。加入0.5 μl Oligo (dT)18底物和0.5 μl随机六聚体引物。用无核糖核酸酶的去离子水补足至15 μl。于PCR仪上65 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却。依次加入4 μl×5反应缓冲液，1 μl RT酶混合物，用移液器抽吸混匀。于PCR仪上42 ℃保温60 min，结束后70 ℃保温5 min灭活反转录酶。
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①取0.2 ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2×荧光定量PCR试剂10 μl；2.5 μmol/L基因引物2 μl；反转录产物2 μl；双蒸水6 μl。
②PCR扩增：预变性95 ℃，10 min；循环（40次）95 ℃，15 s→60 ℃，60 s；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃
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使用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果表明，血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范围内对细胞炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达均有促进作用，其中在40 μg/ml时达到峰值，80～160 μg/ml呈逐渐减弱的趋势，见图2。
图 2 血红铆钉菇多糖对RAW264.7细胞炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达的影响
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收集对数期RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，随后以每孔1×106个细胞接种于六孔培养板中，加入1 ml的DMEM完全培养基，并于恒温培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养24 h。设置不同浓度梯度的血色铆钉菇多糖溶液1、20、40、80、160 μg/ml及空白对照组，于恒温培养箱中孵育12 h，用PBS冲洗细胞2～3次，最后一次清洗完成，倒掉PBS，用移液器尽量吸干残留液体；加入适当体积的RIPA裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）于培养板/培养瓶内3～5 min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触；用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5 ml离心管中；冰上裂解30 min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12000 r/min，4 ℃，离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液.
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将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，置于−20 ℃冰箱保存备用。
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清洗玻璃板；制胶与上样，放入制胶器，插入斜插板将玻璃板固定，检查底部是否对齐，避免漏胶；将分离胶灌到适当的高度，将纯水缓慢均匀加入到分离胶上层，直至加满。大约30 min后待分离胶凝固即可倒去分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；配制5%的浓缩胶，加入四甲基乙二胺后立即混合均匀，灌胶，开始电泳；电泳至溴酚蓝里最底部大约1 cm即可终止电泳，进行转膜。将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中，快速涮洗一次，然后加上脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30 min；按照抗体说明书，进行一抗稀释，配制好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配制好的一抗，4 ℃孵育摇床过夜；回收一抗，用TBST快速涮洗膜3次，然后加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5 min，洗3次；将二抗用TBST按照1∶5000的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育30 min；用TBST快速涮洗膜3次，然后再加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5 min，洗3次。
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在暗室中将ECL A液和ECL B液两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜，将聚偏二氟乙烯膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1～2 min后，去尽残液，盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。
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胶片扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，使用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。结果表明，血红铆钉菇多糖CRPS25-Ⅱ在1～160 μg/ml范围内对细胞p-P65蛋白的表达有促进作用，其中在40 μg/ml时达到峰值，80～160 μg/ml呈逐渐减弱的趋势，见图3。
图 3 血红铆钉菇多糖对RAW264.7细胞p-P65蛋白表达量的影响
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本文对血红铆钉菇多糖进行了研究，在实验室通过水提醇沉的方法制备出血红铆钉菇多糖，通过DEAE纤维素-52柱层析精制得到CRPS25-Ⅱ，而后将CRPS25-Ⅱ溶液按1～800 μg/ml浓度分别加入细胞悬液中，按照6、12、24 h进行培养，考察多糖浓度和孵育时间对巨噬细胞RAW264.7的影响，最终发现1～400 μg/ml浓度范围孵育12 h细胞生长状态良好，适于实验研究。
人体的免疫系统调控着机体健康的平衡与稳定，巨噬细胞是人体天然免疫防线的重要一员，参与机体的非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）。巨噬细胞可以呈递抗原、分泌细胞因子等生物活性物质，从而调控机体微环境，达到抗炎、抗肿瘤的作用，细胞因子通过调节细胞分化、生长和凋亡控制整个机体的动态平衡。
本实验是以小鼠腹腔巨噬细胞为靶细胞，研究CRPS25-Ⅱ体外的免疫调节活性，探讨CRPS25-Ⅱ在体内发挥免疫调节活性的作用机制。通过MTT法检测了CRPS25-Ⅱ对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性，数据表明多糖浓度在25～400 μg/ml范围内CRPS25-Ⅱ不具有细胞毒性，说明该药物应用于临床的安全性较高，具备深入研究的意义。通过RT-PCR法证实CRPS25-Ⅱ可显著促进腹腔巨噬细胞释放IL-6和TNF-α等细胞因子，通过增强细胞因子的活性，达到抗炎、抗肿瘤的目的。研究表明多糖浓度在1～160 μg/ml的范围内，CRPS25-Ⅱ对IL-6和TNF-α释放具有显著促进作用，其中1～40 μg/ml浓度范围呈上升趋势，40～160 μg/ml范围内随着CRPS25-Ⅱ的浓度的增加对IL-6和TNF-α释放的促进作用逐渐减弱。Western blot试验显示，CRPS25-Ⅱ作用于RAW264.7细胞12 h后，1～160 μg/ml浓度范围内血红铆钉菇多糖均可显著诱导RAW264.7细胞中p-P65蛋白的表达，从而激活NF-κB信号通路，达到免疫调节的作用。其中1～40 μg/ml浓度范围对p-P65蛋白分泌的促进作用呈上升趋势，40～160 μg/ml范围内随着CRPS25-Ⅱ的浓度的增加p-P65蛋白的促进作用逐渐减弱。
综上所述，血红铆钉菇多糖具有显著的免疫调节活性，作为一种新型的免疫调节剂，具有较为广阔的开发前景，后续工作可进行更加系统深入的研究。
Immunoregulatory effect of polysaccharides derived from chroogomphus rutilus on macrophage cell line RAW264.7
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摘要:
目的 研究血红铆钉菇多糖对RAW264.7小鼠单核巨噬细胞的免疫调节作用。 方法 将小鼠的巨噬细胞进行复苏培养，制备细胞悬液，设置空白对照组以及不同质量浓度的血红铆钉菇多糖（CRPS25-Ⅱ）组（1、20、40、80和160 μg/ml）。采用MTT法测定血红铆钉多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性；采用RT-PCR法检测血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌免疫调节因子IL-6和TNF-α的影响；采用Western-blot法检测血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的NF-κB信号通路中p-P65蛋白表达的影响。 结果 实验证明血红铆钉菇多糖在1～160 μg/ml的范围内没有明显的细胞毒性，CRPS25-Ⅱ质量浓度在1～160 μg/ml可提高细胞因子的分泌量，从而促进细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA表达；CRPS25-Ⅱ可促进p-P65蛋白的磷酸化，激活NF-κB信号通路从而促进细胞的免疫调节作用，1～160 μg/ml浓度范围内均可促进p-P65蛋白的增加，1～40 μg/ml呈上升趋势，40～160 μg/ml促进作用逐渐减弱。 结论 血红铆钉菇多糖对小鼠巨噬细胞无毒性，且可以促进炎症因子IL-6和TNF-α的分泌以及激活NF-κB信号通路，从而起到免疫调节作用。 Abstract:Objective To study the immunomodulatory effect of polysaccharides (CRPS25-Ⅱ) derived from Chroogomphus rutilus on mouse mononuclear macrophages, RAW264.7 cells. Methods RAW264.7 cells were resuspended and cultured, cell suspension was prepared. The blank control group and CRPS25-Ⅱ groups with different mass concentrations (1, 20, 40, 80 and 160 μg/ml) were set up. MTT assay was used to determine the cytotoxicity of CRPS25-Ⅱ on RAW264.7 cells. RT-PCR was used to detect the effects of CRPS25-Ⅱ on the secretion of immune regulatory factors IL-6 and TNF-α from RAW264.7 cells. Western blot was used to detect the effects of CRPS25-Ⅱ on the expression of p-P65 protein in NF-κB pathway of RAW264.7 cells. Results The results showed that CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) had no obvious cytotoxicity. CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) increased the secretion of cytokines, and thus promoted the mRNA expression of IL-6 and TNF-α. CRPS25-Ⅱ increased the phosphorylation of p-P65 protein and activated the NF-κB signaling pathway, and thus promoted the immune regulation of cells. CRPS25-Ⅱ (1−160 μg/ml) could increase the p-P65 protein, and the promoting effects of CRPS25-Ⅱshowed an upward trend in the concentration range of 1−40 μg/ml and gradually weakened in the concentration range of 40−160 μg/ml. Conclusion Polysaccharides derived from chroogomphus rutilus had no cytotoxicity to mouse macrophages, and could promote the secretion of inflammatory factors IL-6 and TNF-α and activate the NF-κB signaling pathway, thus playing an immunomodulatory role. -
Key words:
- CRPS25-Ⅱ /
- RAW264.7 cells /
- immune regulation
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白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根，首载于《神农本草经》。白蔹是最早用于疮痈、烫伤[1]治疗的药物，具有解毒、生肌的功效。资料显示，白蔹在皮肤创伤治疗中的使用频率较高。随着白蔹药理研究的不断深入，发现白蔹还具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫调节及促进溃疡快速愈合等作用。
在2015版《中国药典》中，白蔹的质量标准只有定性分析而无定量分析。白蔹成分检测中发现其含大黄素等蒽醌类活性成分[7]，且白蔹中大黄素的定量测定方法文献资料[8-9]较少。本实验采用反相高效液相色谱法，建立白蔹药材中大黄素含量测定方法，为白蔹的质量控制标准提供方法和依据。
1. 试药与仪器
1.1 试药
大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201512，经面积归一化法计算含量为99.1%）；甲醇（烟台远东精细有限公司，批号：160706）为色谱纯，水为超纯水，磷酸（莱阳市双双化工有限公司，批号：2010246）为分析纯，硫酸（淄博市淄川区张庄化学试剂厂，批号：950626）为分析纯。白蔹饮片（安国市弘发中药材饮片有限公司，批号：131001），经淄博市中医院药品供应科主任魏星教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹Ampelopsis japonica(Thunb.) Makino的干燥块根。
1.2 仪器
Lab Alliance PC 3000 高效液相色谱仪（美国科学系统公司），紫外检测器（北京普析通用仪器有限责任公司）；LD310-2R电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；FA/JA系列电子天平（上海上平仪器有限公司）；RE-201D型恒温水浴锅、RE-201D型旋转蒸发器（郑州博科仪器设备有限公司）；766-3型远红外快速干燥箱（江苏省南通县金余电器配件厂）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
Apollo-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇−0.2%磷酸溶液（85:15），流速1.0 ml/min，检测波长220 nm，进样量20 μl。在此条件下，大黄素与相邻色谱峰分离度良好，无干扰，理论塔板数为2 000。对照品与供试品色谱图见图1。
2.2 溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的制备
取大黄素对照品（含量为99.1%）约10 mg，精密称定，置于1 000 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为9.91 μg /ml 的大黄素对照品储备液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备
取过5目筛的白蔹药材粉末，置烘箱内（70±2）℃，2 h烘干。精密称量30 g，用10倍量质量分数20%的硫酸在50 ℃条件下回流水解2 h。过滤，取滤渣。滤渣用纯化水洗至中性（pH=7），烘干。称其质量，记录。再以8倍量体积的95%乙醇在82 ℃条件下回流提取2次，每次1 h，过滤，合并乙醇提取液，减压蒸馏，浓缩至无醇味，加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中，即得供试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
分别精密量取“2.2.1”项下制备的大黄素对照品溶液各125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成6种不同浓度的对照品溶液。依次精密吸取对照品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y = 53 962X − 966. 46，r = 0.999 7；结果表明大黄素在0.124～3.968 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验
精密量取对照品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。大黄素峰面积RSD为1.7%。仪器精密度良好，符合要求。
2.3.3 重复性试验
精密称取同一批号样品6份，按“2.2.2”项下方法平行制备样品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别进样，测定大黄素的峰面积，RSD为1.2%（n= 6），结果表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
按“2.1”项下色谱条件，分别精密量取在室温（10~30 ℃）下放置0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供试品溶液各20 μl进样测定，记录大黄素的峰面积，6次进样结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为1.5%。
2.3.5 加样回收率试验
取同一批次（批号：20170704）已知含量的白蔹药材样品9份，分别按相当于样品溶液中大黄素含量的80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.3.1”项下制备的对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。计算回收率，结果见表1。
表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果样品含有量（m/mg） 加样量（m/mg） 测得量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD
（%）0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 2.3.6 样品测定
取不同批次白蔹药材样品，分别按“2.3.2”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定峰面积，连续进样3次，以外标法计算含量，测定结果见表2。
表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)批号 含量（μg/g） RSD（%） 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50 3. 讨论
3.1 色谱条件的选择
3.1.1 检测波长的选择
笔者所查文献[8-10]中，测量大黄素所用波长有254、290 nm等。通过实验发现，不同的波长影响其重现性及灵敏度。通过对大黄素标准品甲醇溶液全波段（200～400 nm）紫外扫描可见:其在220、254、260、272、278 nm处均具有特征吸收。通过综合比较上述波长处大黄素峰的峰形及峰面积，220 nm处波长的峰形较好、干扰少、峰面积较大，故选定220 nm作为白蔹药材中大黄素的测定波长。
3.1.2 流动相的选择
大黄素的化学名为1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，具有一定的极性和酸性。所查文献中，大黄素含量测定的流动相体系有多种。在实验过程中发现，流动相对色谱峰的保留时间及分离度有较大影响。故本实验在选择流动相时，考察了不同比例的甲醇-水，乙腈-水，甲醇:0.1%磷酸溶液[8-10]，甲醇:0.5%磷酸溶液[11]，甲醇:0.2%磷酸溶液，甲醇:0.02%磷酸溶液，甲醇:1% 冰醋酸[12]等不同溶剂系统，结果表明，相同条件下，甲醇:0.2%磷酸溶液（85:15）为流动相时，可以达到基线分离，出峰时间较短，峰形较好。
3.1.3 流速与进样量的选择
在流动相及波长选定的条件下，考察了不同流速（0.5~2.0 ml/min）对出峰时间的影响，当流速小于1.0 ml/min时，保留时间延长，使流动相的用量增加，会造成试剂的浪费；当流速大于1.0 ml/min时，保留时间缩短，但大黄素的峰会与杂质峰产生重叠，影响分离度及重现性。本实验选择1.0 ml/min作为流速。
在样品浓度一定的条件下，考察了不同进样体积（10～30 μl）的影响。实验结果表明，进样体积小于20 μl时，重现性及灵敏度均下降；大于20 μl时，杂质峰明显。当进样量为20 μl时，峰的对称性得到保证。因此，本实验选择20 μl为进样量。
3.2 样品提取方法的选择
已有文献[8]对白蔹中大黄素的提取方法采用甲醇提取及三氯甲烷萃取法。通过实验发现这种方法稳定性差、步骤烦琐，且所用试剂毒性较大。本实验在上述提取方法的基础上，参照大黄药材中大黄素的提取方法[10]，通过4因素（粒度、溶剂剂量、溶剂浓度、提取时间）3水平的正交设计确定了白蔹中大黄素的提取方法。结果表明，采用过5目筛的白蔹粉末，先用20%的硫酸在50 ℃条件下回流酸水解2 h，滤渣用纯化水洗至中性。再用8倍量体积的95%乙醇，水浴回流2 h能够达到较好的提取效果。白蔹中含大黄素等游离蒽醌，还含有结合型蒽醌[13-14]。先进行酸水解，使结合型蒽醌水解，结果大黄素的含量有所提高。白蔹具有的抗菌性与其中的大黄素[15-16]有关，大黄素是白蔹的活性成分。本提取方法克服了以往相关文献报道方法的不足，分离度好、重现性好、结果准确，因此大黄素作为白蔹药材中指标成分有一定可行性，为完善白蔹药材的质量控制标准提供了方法和依据。新药临床试验的质量是药品上市后安全、有效的保障[17]，所以临床试验过程中的质量控制尤为重要。包括相似性评价（外观检测和观感评估测试）、安全性评价（常规安全性检测）、适用性评价（薄层鉴别、HPLC、指标成分测定和药理实验）和最终制剂的质量标准。临床试验过程中的质量控制所要评价的范围更广、要求更为严格，是为了确保临床数据的真实、准确、完整和可靠，为下一步临床应用提供依据，对提高医疗水平具有重大意义。
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