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紫茶生长于非洲肯尼亚海拔1 500～2 000 m的地区，主要成分为多酚类物质。现代药理研究表明，天然植物中的多酚具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、抗菌[3]、抗衰老[4]等功效。课题组前期研究发现，紫茶提取物中多酚的纯度不高，直接影响相关制剂的开发。近年来，大孔吸附树脂的应用越来越广泛，尤其是在天然药物有效成分分离和纯化方面具有显著优势[5-8]。本实验以紫茶为研究对象，探索大孔吸附树脂对紫茶总多酚的纯化工艺，以期制备出纯度较高的紫茶总多酚，为其进一步开发利用提供理论依据。
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UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；AUX220型电子分析天平（精度：0.1 mg，日本岛津）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏金坛市友联仪器研究所）。KQ-500B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
肯尼亚紫茶（批号：20181030，火烈鸟茶叶有限公司）；没食子酸对照品（批号：110831-201605，中国食品药品检定研究院）；铁氰化钾（温州市化学用料厂）；ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；氯化铁、盐酸、乙醇等试剂（西陇科学股份有限公司），以上试剂均为分析纯，水为纯化水。5种大孔吸附树脂的物理参数详见表1。
表 1 5种型号大孔吸附树脂物理参数
型号 外观 极性 粒径（l/nm） 比表面积（m2/g） 平均孔径（l/μm） ADS-17 白色不透明球状颗粒 氢键 0.3～1.25 90～150 25～30 D101 白色半透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 480～520 25～28 D301 浅黄色半透明球状颗粒 中极性 0.3～1.25 550～600 48～58 AB-8 白色不透明球状颗粒 弱极性 0.3～1.25 480～520 130～140 X-5 白色不透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 500～600 290～300 -
精密称取干燥至恒重的没食子酸对照品28.4 mg，置于100 ml量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀制备成母液。精密吸取1 ml母液置10 ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，配制成浓度为28.4 μg/ml的对照品溶液，置于冰箱中2～8 ℃避光保存。
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称取紫茶粉末5.0 g，置于圆底烧瓶中，加入50%乙醇500 ml，加热回流提取30 min，放冷至室温，将药液滤过除去沉淀，滤液用50%乙醇补足减失的重量并稀释至500 ml。精密吸取1 ml稀释液，置于100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。
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分别精密吸取浓度为28.4 μg/ml的没食子酸对照品溶液0.2、0.3、0.5、0.8、1.0和1.2 ml于25 ml量瓶中，依次加入0.1 mol/L FeCl3溶液1.0 ml、1%K3[Fe（CN）6]溶液2.0 ml和0.1 mol/L HCl溶液0.5 ml，用纯化水稀释至刻度，摇匀，于室温下避光放置60 min。以相应试剂为空白，在775 nm处测定吸光度。以没食子酸质量浓度（X，μg/ml）为横坐标，以吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.769 9X+0.027 3（r=0.999 7），表明没食子酸浓度在0.227～1.363 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。方法学考察结果表明，专属性良好，平均回收率为100.28%，RSD为2.09%；精密度和重复性试验的RSD小于3%。显示本方法准确可靠。
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取5种不同型号的大孔吸附树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分溶胀，将浸泡后的树脂装柱，用95%乙醇以5 ml/min的体积流量冲洗，直至流出液澄清，之后用2倍体积的4%盐酸溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，再用2倍体积的5%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用纯化水以5 ml/min的体积流量冲洗至中性，最后用95%乙醇浸泡保存，临用时以5 ml/min体积流量的纯化水冲洗至中性。
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取预处理后的ADS-17、D101、D301、AB-8、X-5型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共5份，置于50 ml具塞磨口锥形瓶中。加入质量浓度为50 μg/ml（以多酚含量计）的紫茶总多酚提取液20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附24 h。吸附结束后，滤过，取续滤液按照“2.1”项下方法测定总多酚的含量，计算各树脂在30 ℃下对紫茶总多酚的吸附量和吸附率。然后，将上述吸附饱和的大孔树脂取出，用纯化水清洗后，分别加入70%乙醇20 ml，在30 ℃水浴的条件下振荡24 h，进行静态解吸，计算其解吸率，结果见表2。计算公式如下：
表 2 不同类型大孔树脂对紫茶总多酚的静态吸附率和解吸率
树脂型号 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 解吸量（μg/g） 解吸率（%） ADS-17 554.9 68.98 459.0 82.72 D101 621.6 77.74 341.4 54.93 D301 817.4 100.00 107.4 13.14 AB-8 701.8 82.20 598.2 86.73 X-5 727.8 89.90 600.8 81.13 吸附量=（C0−C1）V1/M
吸附率=（C0−C1）/C0
解吸量= C2 V2/M
解吸率=C2 V2/[（C0−C1）V]
其中，C0、C1为吸附前和吸附后吸附液中多酚的质量浓度，C2为解吸附后多酚的质量浓度，V1和V2分别为吸附液和解吸液体积，M为大孔树脂的质量。
由表2结果可知，大孔树脂D301对紫茶总多酚具有较强的吸附效果，其吸附率达到100%，其余4种树脂的吸附率从高到低依次是X-5、AB-8、D101、ADS-17。由此可见，不同类型的树脂对紫茶总多酚的吸附性能各不相同。这可能是由于树脂的内部结构、分子极性以及多酚的溶解度等对树脂吸附多酚能力的影响。多酚由于分子中酚羟基的存在，其分子极性较低，因而在与极性较弱或者非极性的树脂进行吸附时效果更好。采用50%的乙醇进行解吸，可以看出5种树脂的解吸率差异较大，AB-8树脂的解吸效果最好，解吸率达86.73%，X-5树脂次之。综合紫茶总多酚提取液的静态吸附和解吸试验，AB-8型树脂和X-5型树脂对紫茶总多酚的吸附效果和解吸效果均较好，而AB-8型树脂价格相对低廉，从节省成本的角度考虑，优先采用AB-8型树脂对其进行纯化。
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取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约1 g，精密称定，共15份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，加入质量浓度为50 μg/ml的紫茶总多酚提取液20 ml，在25 ℃水浴的条件下振荡吸附12 h，每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的吸附率，绘制静态吸附动力学曲线。然后，采用静态解吸试验的方法处理已吸附结束的树脂，进行静态解吸动力学试验，同样每隔一段时间取出1个磨口锥形瓶，测定其总多酚的质量浓度，计算对应时间的解吸率，绘制静态解吸动力学曲线，结果见图1。
图 1 AB-8树脂静态吸附与解吸动力学曲线
由图1可知，在测定的时间点内，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附量随着时间的延长而逐渐增多，经过2.5 h以后，树脂对紫茶总多酚的吸附量趋于平衡，对应的吸附率为88.27%。在0～5 h内，树脂的解吸率呈上升趋势，并在4 h达到最大值84.86%，在随后的时间里，解吸率随着时间的延长变化不大。
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取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂1 g，精密称定，共7份，分别置于50 ml具塞磨口锥形瓶中，分别加入质量浓度为50 μg/ml并用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为2、3、4、5、6、7、8的紫茶总多酚提取液，在30 ℃水浴的条件下振荡吸附2.5 h，测定吸附液中紫茶总多酚的质量浓度，计算吸附率，结果见表3。
表 3 pH值对紫茶总多酚吸附率和解吸率的影响
pH值 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 2 702.4 89.79 3 712.4 90.79 4 700.3 87.77 5 706.3 89.07 6 652.5 85.71 7 641.7 83.19 8 558.4 71.54 由表3可知，吸附液pH值对紫茶总多酚的吸附率有较大影响。在pH值为2时，AB-8型大孔吸附树脂对此质量浓度下的紫茶总多酚吸附率达89.79%。因此，确定上样液的pH值为2。
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取预处理后的AB-8型树脂10 g，精密称定，室温下将质量浓度为250.0 μg/ml（调至pH为2）的紫茶总多酚提取液（供试品溶液用水稀释）以1.0 ml/min体积流量湿法加至树脂柱中，分段收集流出液，流出液每20 ml收集1份，测定吸光度，计算对应的总多酚含量，绘制泄露曲线。当流出液中总多酚的质量浓度达到上样液质量浓度的1/10，达到泄露点，认为此时为最佳上柱体积，结果见图2。在第2份流出液时，紫茶总多酚已经开始泄露，在第3份流出液中，总多酚的质量浓度为26.5 μg/ml，达到上样液质量浓度的1/10，因此选择上柱体积为60 ml，即3 BV。
图 2 紫茶总多酚在AB-8大孔树脂上的泄露曲线
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取预处理好的AB-8型树脂10 g，精密称定，装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，共5份，分别加入质量浓度为250、375、500、625、750、1 000 μg/ml的上样液（pH为2）各60 ml（3 BV），以1.0 ml/min的流速上柱，收集流出液，按“2. 1”项下方法测定总多酚含量，计算各质量浓度下的吸附率，确定最佳上样质量浓度。结果显示，各上样质量浓度下的吸附率分别为74.50%、77.56%、69.77%、60.59%、56.73%、43.61%。由此可见，上样液质量浓度对大孔吸附树脂吸附性能有显著影响，在考察范围内吸附率总体呈现出先上升后下降的趋势。当质量浓度小于375 μg/ml时，随着上样液质量浓度增加，动态吸附率呈现上升的趋势；分析原因可能是在此较低的浓度范围内，紫茶多酚有较大的机会与大孔树脂的内表面接触，进而加速扩散至树脂孔道内，形成吸附作用。而当质量浓度大于375 μg/ml时，随着质量浓度继续增加，位于孔道内的紫茶总多酚分子的扩散运动受到抑制，导致树脂对多酚的吸附能力降低。因此，选择上样液质量浓度为375 μg/ml。
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取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×20 cm的层析柱中，共4份，轻敲柱壁，使柱内树脂平衡，打开下端阀门，控制体积流量使柱内纯化水流出，在液面距树脂1 cm时，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2，上样量为3 BV）分别以1.0、2.0、3.0、4.0 ml/min的体积流量上柱，同时收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳上样体积流量。结果显示，吸附率分别为79.37%、79.78%、72.73%、64.73%，当上样体积流量为2.0 ml/min时，AB-8型大孔吸附树脂对紫茶总多酚的吸附率最大，故选择上样体积流量为2.0 ml/min。
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取预处理的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法上柱法装入1.5 cm ×40 cm的层析柱中，分别设置径高比（柱直径与树脂填充高度比值）为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15，将紫茶总多酚上样液（质量浓度为375 μg/ml，pH为2）分别以2.0 ml/min的体积流量上柱，对应的药液上样量分别为3、4.5、6、9 BV，收集下端流出液，测定吸光度，计算吸附率，确定最佳径高比。结果显示，吸附率分别为79.81%、78.37%、76.73%、68.54%。径高比1∶6和1∶9对吸附率影响不大。此后，在考察范围内，随着径高比值的降低，吸附率也呈现下降的趋势，可能是由于树脂层过高导致上样液穿透能力差所致。
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取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，共5份，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱（径高比为1∶6，下同），将质量浓度为375 μg/ml上样液（调节pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，分别用纯化水及25%、50%、75%、90%乙醇溶液各3 BV以1.0 ml/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定其吸光度，计算解吸率，确定最佳洗脱剂体积分数。结果：解吸率分别为17.52%、62.96%、91.04%、81.41%、84.67%，由此可见，50%乙醇对紫茶总多酚的解吸作用最强，故选择洗脱剂的体积分数为50%。
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取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml的上样液（pH为2）3 BV以2 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇以1.0 ml/min的流速进行洗脱，洗脱溶剂用量分别为1、2、3、4、5 BV，收集洗脱液，测定其吸光度，计算洗脱率，确定最佳洗脱剂用量。结果：解吸率分别为54.68%、83.37%、90.29%、91.48%、91.45%，表明当50%乙醇用量在1～3 BV时，随着用量的增加，对紫茶总多酚的解吸率呈上升的趋势，随后继续增加洗脱剂的用量，解吸率不再增加，表明此时树脂上吸附的总多酚已被充分洗脱，没有必要再增加洗脱剂的用量，故确定洗脱剂的用量为4 BV。
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取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm的层析柱中，将375 μg/ml上样液（pH为2）3 BV以2.0 ml/min的体积流量通过树脂柱，待吸附饱和后，用50%乙醇溶液4 BV分别以1.0、2.0、4.0、6.0 ml/min的体积流量进行洗脱，计算解吸率，确定最佳体积流量。结果：对应的解吸率分别为92.47%、93.76%、91.97%、85.18%，表明紫茶总多酚的洗脱率随着洗脱体积流量的加大先升高后减小，故选择最佳洗脱体积流量为2 ml/min。
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称取4份预处理后的大孔吸附树脂约10 g，精密称定，以湿法缓慢装入1.5 cm×20 cm层析柱中（径高比为1∶6），将紫茶提取物预先用石油醚（60～90 ℃）除去脂溶性色素，参考“2.1.2”项下方法加水稀释以制备浓度为375 μg/ml（pH为2）的紫茶总多酚溶液3 BV（总多酚质量为22.5 mg，质量分数40.2%，干膏56.0 mg），并以2 ml/min体积流量上样，待吸附饱和后，先用3 BV水去除杂质，然后用50%乙醇溶液4 BV以2 ml/min的体积流量洗脱，分别收集洗脱液，按照紫茶总多酚定量测定方法，计算总多酚洗脱量及洗脱率，再将洗脱液水浴蒸干，低温烘至恒重，计算干膏的量；精密称取干膏适量，测定总多酚的含量。结果见表4。
表 4 纯化工艺验证结果
编号 加入量
（m/mg）纯化前 洗脱量
（m/mg）洗脱率
（%）纯化后 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 平均质量分数（%） RSD（%） 1 22.5 56.0 40.2 20.8 92.4 29.4 70.7 69.8 1.27 2 21.0 93.3 30.6 68.6 3 20.9 92.8 30.0 69.7 4 20.6 91.6 29.4 70.1 由纯化工艺验证结果可见，经过4次验证试验，50%乙醇洗脱条件下总多酚的平均洗脱率为92.5%，紫茶总多酚干膏量由56.0 mg减少至平均29.9 mg，质量分数从40.2%升至平均69.8%，表明建立的纯化工艺对紫茶总多酚有较好的分离、纯化效果。
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大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，目前已广泛应用于中药的活性成分如黄酮、皂苷、生物碱及多酚等成分的分离与纯化。其中，目前采用大孔树脂对多酚类成分进行纯化的有天麻总多酚[9]、白簕叶总多酚[10]、过岗龙总多酚[11]、茶梗中茶多酚[12]等，这都提示了大孔树脂精制多酚类有效成分的可行性。影响大孔树脂的分离纯化有多方面的因素，在选择合适的大孔树脂时，应综合考虑各种影响因素，如树脂的极性、比表面积以及上样液的质量浓度、洗脱液浓度等，以获得最佳的分离效果。在利用大孔树脂纯化时，应尽量滤去上样液中的沉淀，这样既能提高总多酚的纯化率，也能提高树脂的使用寿命。本研究中的样品采用50%乙醇提取后用纯化水进行稀释，当样品溶于水中时，由于多酚类物质能被大孔树脂吸附，而色素及多糖等物质不能吸附而被洗脱掉。而在改为乙醇洗脱时，树脂的吸附效果减弱，被吸附的多酚能被乙醇洗脱。
本研究通过对5种不同型号的大孔吸附树脂的吸附和解吸进行考察，确定了AB-8型大孔吸附树脂纯化紫茶总多酚的最佳工艺条件，为该产品的进一步开发奠定了基础。
Optimization of total polyphenol purification from purple tea by macroporous resin
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摘要:
目的 筛选适合分离和纯化紫茶总多酚的大孔吸附树脂，确立其纯化工艺参数，以期制备出高纯度的紫茶总多酚，为其进一步开发奠定基础。 方法 采用静态吸附-洗脱试验筛选纯化紫茶总多酚的大孔吸附树脂，在单因素实验基础上，以吸附率等为指标，考察上样液质量浓度、上样液pH值、径高比、上样体积、上样体积流量、洗脱液乙醇体积分数、洗脱液体积以及洗脱体积流量对纯化工艺的影响，并确定最佳纯化工艺参数。 结果 AB-8型大孔吸附树脂纯化紫茶总多酚的最佳工艺参数为上样液质量浓度为375 μg/ml，上样体积流量2 ml/min，上样体积3 BV，上样液pH为2，径高比为1∶6，洗脱时先用3 BV水去除杂质，再用50%乙醇4 BV洗脱，洗脱体积流量2 ml/min。 结论 AB-8型大孔吸附树脂可纯化紫茶总多酚，在最佳纯化工艺参数下，紫茶总多酚的质量分数从40.20% 升至平均69.8%，干膏量由56.0 mg减少至29.9 mg，建立的工艺稳定、可行，可作为紫茶总多酚的纯化工艺条件。 Abstract:Objective To screen the macroporous adsorption resin suitable for the separation and purification of total polyphenols from purple tea and establish the purification process parameters to prepare high-purity total polyphenols from purple tea. Methods The static adsorption-elution test was used to screen macroporous adsorption resin for the purification of total polyphenols from purple tea. Based on the single factor test, the comprehensive score of adsorption rate was used as the index to investigate the effects of different factors on the purification process and identify the optimal parameters for the purification process. Those factors included sample concentration, the pH value of the sample solution, the ratio of column diameter to height, sample size, ethanol percentage in the eluent, eluent volume and elution flow rate. Results The best process parameters for purification of total polyphenols from purple tea by AB-8 macroporous adsorption resin were as following. The sample concentration was 375 μg/ml with flow rate 2 ml/min. The sample volume was 3 BV. The sample solution pH was 2. The ratio of colume diameter to height was 1∶6. The impurities were removed first by water 3 BV. 50% ethanol 4 BV was used for elution with flow rate 2 ml/min. Conclusion AB-8 macroporous resin was selected for the purification of polyphenols from purple tea under the optimized technological conditions. The mass fraction of total polyphenols increased from 40.2% to an average of 69.8%. The solid content decreased from 56.0 mg to 29.9 mg. The established purification process has good stability and feasibility. It can be used as a purification process for total polyphenols from purple tea. -
Key words:
- purple tea /
- total polyphenols /
- macroporous adsorption resin /
- purification process
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海绵是具有代表性的海洋生物，其共附生微生物也是近年来研究的热点。在海洋高盐、高压、低温、寡营养的生存环境下，海绵共附生微生物能够产生结构新颖、生物活性良好的次级代谢产物。其中海绵共附生真菌是海绵化学多样性的重要来源[1]。
曲霉属 (Aspergillus sp)真菌分布广泛而且研究丰富。海洋曲霉属真菌的次级代谢产物主要包括聚酮类[2]、生物碱类[3]、肽类[4]、萜类[5]等化合物，具有抗肿瘤[6]、抗菌[7]、抗病毒[4]等生物活性。本课题的土曲霉(Aspergillus terreus)是从我国南海西沙永兴岛海域的棕色扁海绵Phakellia fusca中分离得到的，属于散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Tri-chocomaceaez)的一种真菌，在海洋动植物和陆地植物中均有分布。该菌的次级代谢产物具有多样性，包括生物碱类化合物[8]、丁烯酸内酯类化合物[9]、萜类化合物[10]、环肽类化合物[11]等。本文采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱等多种分离方法从土曲霉Aspergillus terreus中共分离得到8个单体化合物。通过理化常数测定、波谱数据分析等方法确定了化合物的结构。化合物1～8的结构见图1。
1. 材料和方法
1.1 样品
菌株来源于棕色扁海绵Phakellia fusca，由上海交通大学海洋药物研究中心鉴定为Aspergillus terreus，菌株保存在上海交通大学医学院附属仁济医院药学部海洋药物研究中心（菌株编号152805）。
1.2 仪器与试剂
Agilent 600核磁共振波谱仪（美国 Agilent 公司）；Waters高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）；快速制备色谱仪（法国Interchim公司）；OSB-2100旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）；振荡培养箱（上海知楚）。薄层硅胶、200~300目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（瑞典GE Healthcare公司）；色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；其他分析纯有机试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（剑桥同位素实验室）。
1.3 发酵与萃取
取Aspergillus terreus单菌落接种到装有100 ml PDB培养液的250 ml三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养3 d，以该发酵液10%的接种量接到装有500 ml的真菌2号培养液（甘露醇20 g，麦芽糖20 g，CaCO3 15 g，葡萄糖10 g，谷氨酸钠10 g，酵母提取物3 g，玉米浆1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，海盐30 g，蒸馏水1 L）的1 L三角瓶中，28 ℃，220 r/min震荡培养10 d，获得菌株的发酵物。收集发酵液24 L，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩后得到乙酸乙酯相浸膏9.3 g。
1.4 提取分离
乙酸乙酯相浸膏首先经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（体积比为1∶1）作为溶剂进行洗脱，得到组分Fr.1～Fr.4。组分Fr.2经硅胶柱色谱（石油醚：丙酮 = 100∶1～0∶100）分离得到组分Fr.2-1～Fr.2-9。组分Fr.2-5经反相中压柱色谱分离得到8个亚组分，其中Fr.2-5d经重结晶得到化合物3 (2.5 mg)。组分Fr.2-6经LH-20凝胶柱色谱和反相半制备HPLC（38%乙腈-水）分离得到化合物1 (3.5 mg, tR = 21.0 min)。化合物2 (3.5 mg, tR = 13.0 min)由组分Fr.2-7经反相半制备HPLC，以33%乙腈-水为流动相等梯度洗脱得到。组分Fr.2-8以乙腈-水 (体积比10∶90～100∶0)为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（20%乙腈-水）分离得到化合物4 (2.0 mg, tR=30.0 min)、 化合物5 (4.0 mg, tR=28.0 min)和化合物6 (9.0 mg, tR=14.0 min)。Fr.3经过硅胶柱色谱分离得到7个组分，其中Fr.3-3经反相半制备HPLC进一步纯化得到化合物7 (1.7 mg, tR=12.0 min)。组分Fr.3-4以20%～100%的乙腈-水为流动相，经反相中压柱色谱和反相半制备HPLC（15%乙腈-水）分离得到化合物8 (18.0 mg, tR = 8.0 min)。
2. 结构鉴定
化合物1为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为黄色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 466.15。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 12.23 (1H, s)为氨基质子信号；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.82 (1H, dd, J=8.5, 0.8 Hz, H-3), 7.89 (1H, dd, J=7.9, 1.3 Hz, H-6), 7.60 (1H, td, J=8.5, 1.3 Hz, H-4), 7.22 (1H, m, H-5)，芳香质子信号δH 9.21 (1H, brs, H-9), 8.70 (1H, d, J=4.5 Hz, H-1′), 8.25 (1H, dt, J=8.0, 2.2 Hz, H-3′), 7.36 (1H, dd, J=8.0, 4.5 Hz, H-2′)，提示3-取代吡啶环的存在；1个芳香质子信号δH 7.27 (1H, s, H-10′)；4个甲氧基质子信号δH 3.97 (3H, s, 4″-OCH3), 3.91 (3H, s, 3″-OCH3), 3.90 (3H, s, 5″-OCH3), 3.82 (3H, s, 7″-OCH3)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示24个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.2, 167.2, 164.0为羰基碳信号；17个芳香碳信号；δC 61.3, 61.3, 56.5, 52.7为4个甲氧基碳信号。碳信号归属为：δC 168.2 (C-7)、167.2 (C-7′′)、164.0 (C-7′)、152.6 (C-4′)、151.5 (C-5′′)、149.3 (C-2′)、148.8 (C-3′′)、146.9 (C-4′′)、140.4 (C-2)、135.2 (C-6′)、133.6 (C-4)、130.3 (C-1′)、127.9 (C-6)、125.8 (C-2′′)、123.8 (C-5)、123.6 (C-5′)、121.8 (C-3)、120.4 (C-1′′)、119.0 (C-1)、108.8 (C-6′′)、61.3 (3″-OCH3)、61.3 (4″-OCH3)、56.5 (5″-OCH3)、52.7 (7″-OCH3)。该化合物核磁数据与参考文献[11]对照基本一致，确定化合物为methyl-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido) benzoate。
化合物2为黄色粉末(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 457.14。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，δH 12.19 (1H, s, 3-NH), 11.10 (1H, s, 1′′-NH), 8.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, 1′-NH)为氨基质子信号；1个芳香质子单峰信号δH 9.29 (1H, s, H-7)；一组邻位二取代的苯环质子信号δH 8.44 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7′′), 7.92 (1H, dd, J = 7.9, 1.5 Hz, H-4′′), 7.63 (1H, td, J = 7.9, 1.5 Hz, H-6′′), 7.20 (1H, td, J = 7.6, 1.5 Hz, H-5′′)；2个相邻的连接杂原子的次甲基质子信号δH 4.55 (1H, dd, J = 8.1, 2.9 Hz, H-2′), 4.41 (1H, m, H-4′)；3个甲基质子信号δH 3.70 (3H, s, H-9′′), 3.52 (3H, s, H-9), 1.19 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-5′)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示20个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 168.8, 167.3, 162.7, 159.5, 150.1为羰基碳信号；10个芳香碳信号；δC 65.9, 59.8为2个连杂原子的次甲基碳信号；δC 52.4, 28.6, 20.5为3个甲基碳信号，结合氢谱信号，确定有一个甲氧基和一个氮甲基。碳信号归属为：δC 168.8 (C-3′)、167.3 (C-8″)、162.7 (C-10)、159.5 (C-4)、151.2 (C-8a)、150.1 (C-2)、146.3 (C-7)、139.3 (C-2′′)、138.2 (C-6)、134.2 (C-6′′)、130.7 (C-4′′)、127.2 (C-4a)、123.4 (C-5′′)、120.7 (C-7′′)、117.1 (C-3′′)、65.9 (C-4′)、59.8 (C-2′)、52.4 (C-9″)、28.6 (C-9)、20.5 (C-5′)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +98 (c 0.1, MeOH)。该核磁数据与参考文献[12]对照基本一致，确定该化合物为terrelumamide A。化合物3为白色结晶(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 323.13。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)中，δH 7.2-7.5 (10H, m, H-3′-H-7′, H-3′′-H-7′′)为10个芳香质子信号，提示存在2个单取代苯基；2个亚甲基质子信号δH 4.20 (2H, brs, H-1′′), 3.94 (2H, brs, H-1′)；1个甲氧基质子信号δH 3.92 (3H, s, 2-OCH3)。13C-NMR (150 MHz, CDCl3)共显示19个碳信号，结合DEPT谱推断δC 158.2为羰基碳信号；12个芳香碳信号；δC 34.0, 30.4为2个亚甲基碳信号，提示结构中存在两个苄基基团；δC 61.8为甲基碳信号；δC 144.2, 140.6, 129.4为3个烯碳信号。碳信号归属为：δC 158.2 (C-5), 144.2 (C-6), 140.6 (C-2), 136.5 (C-2′′), 135.6 (C-1′), 129.6 (C-3′, 7′), 129.4 (C-3, 3′′, 7′′), 128.6 (C-4′, 6′), 127.8 (C-4′′, 6′′), 126.9 (C-5′, 5′′), 61.8 (2-OCH3), 34.0 (C-1′′), 30.4 (C-1′)。该化合物核磁数据与参考文献[13]对照基本一致，确定化合物为emeheterone。
化合物4为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.07 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.89 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1个亚甲基质子信号δH 1.58 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.2, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基脂肪碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个缩醛碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.4为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳谱信号归属为：δC 157.9 (C-4)、155.0 (C-2)、143.5 (C-6)、132.7 (C-3)、115.8 (C-8)、95.0 (C-5)、70.5 (C-9)、40.4 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的ECD曲线显示在217 nm处有负的Cotton 效应(Δε −5.86)，其核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定该化合物为(8R, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物5为黄色结晶(甲醇)，硫酸/香草醛显色为紫色，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 240.12。1H NMR (600 MHz, CD3OD)中，给出1个芳香质子信号δH 6.13 (1H, d, J = 0.7 Hz, H-5)；3个次甲基氢信号δH 6.06 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-8), 3.90 (1H, dt, J = 10.5, 3.0 Hz, H-9), 1.90 (1H, m, H-11)；1组亚甲基质子信号δH 1.56 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 4.6 Hz, H-10), 1.36 (1H, ddd, J = 12.3, 10.5, 3.0 Hz, H-10)；3个甲基质子信号δH 2.28 (3H, s, H-7), 0.99 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-13), 0.95 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-12)。13C NMR (150 MHz, CD3OD)共显示12个碳信号，结合DEPT谱推断δC 155.0为羰基碳信号；4个芳香碳信号；δC 115.8, 70.5, 25.2为3个次甲基碳信号，结合对应的氢信号提示结构中存在1个次甲二氧基碳信号和一个连氧次甲基碳信号；δC 40.5为亚甲基碳信号；δC 24.0, 21.8, 18.8为3个甲基碳信号。碳信号归属为：δC 157.8 (C-4)、155.0 (C-2)、143.4 (C-6)、132.8 (C-3)、115.8 (C-8)、95.1 (C-5)、70.5 (C-9)、40.5 (C-10)、25.2 (C-11)、24.0 (C-12)、21.8 (C-13)、18.8 (C-7)。该化合物的核磁数据与化合物4对比基本一致，ECD曲线显示在217 nm处有正的Cotton 效应(Δε +25.34)，提示为化合物4的差向异构体。将此化合物的核磁和ECD数据与参考文献[14]对照基本一致，最终确定化合物为(8S, 9S)-dihydroisoflavipucine。
化合物6为黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛溶液无明显显色，ESIMS给出的分子离子峰[M+H]＋m/z 245.12。1H NMR (600 MHz, CDCl3)中，给出1组单取代的苯环芳香质子信号δH 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-5′), 7.26 (1H, t, J = 7.5 Hz, H-4′), 7.20 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-6′)；2个次甲基氢信号δH 4.25 (1H, dd, J=10.5, 2.9 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.65-3.50 (2H, m, H-3); 3.65-3.50 (1H, m, H-10), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.5 Hz, H-10); 2.30 (1H, m, H-5), 1.88 (1H,m, H-5); 1.98 (2H, m, H-4)。13C NMR (150 MHz, CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.6, 165.3为酰胺羰基碳信号；6个芳香碳信号；δC 59.3, 56.4为2个连氮次甲基碳信号；δC 45.6, 37.0, 28.5, 22.7为4个亚甲基碳信号，提示结构中存在苯丙氨酸和脯氨酸片段。碳信号归属为：δC 169.6 (C-7)、165.3 (C-1)、136.1 (C-1′)、129.4 (C-2′)、129.4 (C-6′)、129.3 (C-3′)、129.3 (C-5′)、127.7 (C-4′)、59.3 (C-6)、56.4 (C-9)、45.6 (C-3)、37.0 (C-10)、28.5 (C-5)、22.7 (C-4)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -47 (c 0.1, MeOH)，将核磁数据与参考文献[15]对照基本一致，最终确定化合物为cyclo(S-Pro-S-Phe)。化合物7为浅黄色粉末(甲醇)，硫酸/香草醛显色不明显，ESIMS给出的分子离子峰[M＋H]＋m/z 284.13。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中给出2个氨基质子信号δH 10.83 (1H, s, H-1′), 7.71 (1H, s, H-8)；1组邻二取代的苯环芳香质子信号δH 7.54 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 7.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8′), 7.03 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7′), 6.94 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-6′)；1个芳香质子单峰信号δH 7.16 (1H, s, H-2′)；2个次甲基氢信号δH 4.28 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-9), 4.04 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-6)；4组亚甲基质子信号δH 3.36 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, m, H-10), 3.21(1H, m, H-3), 3.05 (1H, m, H-10), 1.95 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-4), 1.59 (1H, m, H-4), 1.36 (1H, m, H-5)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示16个碳信号，结合DEPT谱推断δC 169.0, 165.5为酰胺羰基碳信号；8个芳香碳信号；δC 58.4, 55.2为2个连氮次甲基碳信号；δC 44.6, 27.7, 25.8, 21.8为4个亚甲基碳信号。碳信号归属为：δC 169.0 (C-7)、165.5 (C-1)、136.0 (C-9′)、127.3 (C-4′)、124.4 (C-2′)、120.8 (C-7′)、118.6 (C-5′)、118.2 (C-6′)、111.2 (C-8′)、109.3 (C-3′)、58.4 (C-6)、55.2 (C-9)、44.6 (C-3)、27.7 (C-5)、25.8 (C-10)、21.8 (C-4)。将核磁数据与化合物6对比，化合物7中吲哚基取代了化合物6中的苯基。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ -90 (c 0.1, MeOH)，将该核磁数据与参考文献[16]对照基本一致，最终确定化合物为brevianamide F。化合物8为棕黄色油状(甲醇)，ESIMS给出的分子离子峰[M＋Na]＋m/z 177.06。1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)中，给出3个烯氢信号δH 6.72 (1H, m, H-7), 6.37 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-6), 6.00 (1H, s, H-2)，其中一对为反式烯氢；2个羟基信号δH 5.80 (1H, s, 5-OH), 5.68 (1H, s, 4-OH)；2个连氧次甲基质子信号δH 4.50 (1H, m, H-4), 3.89 (1H, m, H-5)；1个甲基质子信号δH 1.88 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-8)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6)共显示8个碳信号，结合DEPT谱，推断δC 203.7为酮羰基碳信号；4个双键碳信号；δC 80.8, 76.4为2个连氧次甲基碳信号；δC 19.1为甲基碳信号。碳信号归属为：δC 203.7 (C-1)、168.5 (C-3)、139.4 (C-7)、125.5 (C-6)、124.8 (C-2)、80.8 (C-5)、76.4 (C-4)、19.1 (C-8)。该化合物的比旋光值为
$[\alpha]_{\rm{D}}^{20} $ +78 (c 0.1, MeOH)，将该化合物核磁数据与参考文献[17]对照基本一致，确定化合物为terrein。3. 活性测试
对分离得到的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测试。采用PBS缓冲液为反应体系，利用α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷（PNPG）为特异性底物，以阿卡波糖作为阳性药，分别设立空白对照组、α-葡萄糖苷酶空白组和PNPG空白组，评价化合物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果表明，化合物3具有较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L。其他化合物没有明显的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。另外，还对化合物的抗氧化活性进行测试。采用DPPH的方法，以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸作为阳性药对分离得到的化合物进行了体外抗氧化活性测试。结果显示这些化合物抗氧化活性不明显。
4. 讨论
本研究从棕色扁海绵共附生真菌土曲霉中分离得到了8个化合物，其中化合物3、4、5、7为首次从该菌中分离得到，丰富了土曲霉次级代谢产物的多样性，为进一步探索该属真菌的化学成分和生源途径提供了理论依据。
根据文献报道，化合物2可以提高胰岛素的敏感性[13]，化合物4和5测试了多个肿瘤细胞系，均显示细胞毒活性不明显[15]，化合物6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄体微球菌、白色念珠菌和隐球菌等具有很好的抗菌活性[16]，化合物7对PaCa-2胰腺细胞的抗癌活性和抗菌活性都不明显[17]，化合物8能够抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP-CR的血管生成素分泌，能够抑制人脐静脉内皮细胞的血管形成[18]。为了更好的探究该真菌代谢产物的活性，对分离得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性测试。其中化合物3显示了较强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值为14.28 µmol/L，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的机制有待于进一步研究。
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表 1 5种型号大孔吸附树脂物理参数
型号 外观 极性 粒径（l/nm） 比表面积（m2/g） 平均孔径（l/μm） ADS-17 白色不透明球状颗粒 氢键 0.3～1.25 90～150 25～30 D101 白色半透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 480～520 25～28 D301 浅黄色半透明球状颗粒 中极性 0.3～1.25 550～600 48～58 AB-8 白色不透明球状颗粒 弱极性 0.3～1.25 480～520 130～140 X-5 白色不透明球状颗粒 非极性 0.3～1.25 500～600 290～300 
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表 2 不同类型大孔树脂对紫茶总多酚的静态吸附率和解吸率
树脂型号 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 解吸量（μg/g） 解吸率（%） ADS-17 554.9 68.98 459.0 82.72 D101 621.6 77.74 341.4 54.93 D301 817.4 100.00 107.4 13.14 AB-8 701.8 82.20 598.2 86.73 X-5 727.8 89.90 600.8 81.13
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表 3 pH值对紫茶总多酚吸附率和解吸率的影响
pH值 吸附量（μg/g） 吸附率（%） 2 702.4 89.79 3 712.4 90.79 4 700.3 87.77 5 706.3 89.07 6 652.5 85.71 7 641.7 83.19 8 558.4 71.54
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表 4 纯化工艺验证结果
编号 加入量
（m/mg）纯化前 洗脱量
（m/mg）洗脱率
（%）纯化后 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 干膏量（m/mg） 质量分数（%） 平均质量分数（%） RSD（%） 1 22.5 56.0 40.2 20.8 92.4 29.4 70.7 69.8 1.27 2 21.0 93.3 30.6 68.6 3 20.9 92.8 30.0 69.7 4 20.6 91.6 29.4 70.1
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