下载:
下载:
-
替考拉宁（teicoplanin）是一种糖肽类抗生素，常用于治疗包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在内的G+菌引起的感染[1]。它包括5个主要成分（TA 2-1、TA 2-2、TA 2-3、TA 2-4和TA 2-5）、1个水解成分（TA 3-1）和4个次要成分（RS-1～RS-4）[2]。其中,TA 2-2组分是活性最强的化合物，占各组分相对含量的40%以上[3-4]，临床上常常通过测定TA 2-2的含量来监测替考拉宁的浓度[5-6]。目前，替考拉宁治疗药物监测主要以测定总浓度为主，但监测结果存在较大的个体差异。主要因为替考拉宁蛋白结合率较高（90 %～95%），在血液循环中主要与白蛋白（Alb）结合并处于动态平衡，未结合的游离部分在体内发挥药效[7]。健康状态下，人体白蛋白为正常水平（35～52 g/L），不同患者药物的血浆蛋白结合率变化不大；但在低蛋白血症（Alb<25 g/L）[8-10]、危重症、酸血症、肾衰竭、肝硬化、吸烟、多种药物合用等特殊情况下，患者常伴有白蛋白水平下降，当Alb<30 g/L时，白蛋白就会对替考拉宁游离浓度产生显著影响从而影响疗效[7, 10]。同时，游离药物水平升高导致肾脏排泄增加，肾毒性风险增加[11-12]。所以，针对上述白蛋白水平较低的患者，单纯用总浓度去评价替考拉宁的疗效和安全性是片面的，若同时测定替考拉宁游离浓度，将更加利于临床精准调整给药方案，以获得满意的治疗效果，减少或避免不良反应的发生。本研究旨在建立一种简便、快速、灵敏、准确的离心超滤结合超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）用来测定替考拉宁游离浓度，为临床实现替考拉宁游离血药浓度监测提供依据。
-
QTRAP 5500型三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪（美国AB-SCIEX有限公司）；30AD型超高效液相色谱仪（日本岛津有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Vortex-5型涡旋混合机（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；超纯水仪系统（默克密理博上海有限公司）；Centrifree® 超过滤装置（截留分子量>30 000的物质）（默克密理博上海有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴器（上海精密试验设备有限公司）。
-
替考拉宁对照品（中国食品药品检定研究院）；甲酸、醋酸铵（色谱纯，Dikma科技有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）。
-
色谱柱：EndeavorsilTM C18柱 (50 mm×2.1 mm，1.8 µm)；流动相A：0.02 mol/L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈，梯度洗脱信息见表1；柱温：35 ℃；进样量：5 µl。
表 1 梯度洗脱信息
时间（t/min） 流速（ml/min） A（%） B（%） 0.0 0.2 85 15 11.0 0.2 74 26 13.0 0.2 74 26 15.0 0.2 85 15 20.0 0.2 停止 停止 -
喷雾针电压（ISV）：5 500 V；碰撞气（CAD）：medium；气帘气（CUR）：20 psi；入口电压（EP）：10 V；去簇电压（DP）：78 V；碰撞能量（CE）：20.74 V；碰撞池出口电压（CXP）：13 V；离子源气体1（GS1）：55 psi；离子源气体2（GS2）：60 psi；离子源温度（TEM）：550 ℃。检测模式：电喷雾离子化（ESI），选择性离子检测（SIM），正离子。多离子反应监测模式（MRM）离子对：替考拉宁TA2-2 m/z 940.7→316.2。扫描时间：200 ms。
-
精密称取替考拉宁对照品2.0 mg置于100 ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，得到浓度为20.0 μg/ml的储备液。分别取不同体积的替考拉宁储备液，用超纯水稀释成浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.0、16.0 μg/ml的标准曲线工作液，以及0.50、3.00、12.0 μg/ml的质控工作液。
-
取1 ml血浆样品置于Centrifree®超滤装置（截留分子量>30 000的物质）中，在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在37 ℃，1 500×g下离心30 min，取样品超滤液直接进样。
-
分别取“1.4”项下各浓度标准曲线工作液以及质控工作液100 μl，加入100 μl空白血浆超滤液，稀释成浓度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml的标准曲线血浆超滤液样品，以及浓度为0.25、1.50、6.00 μg/ml的质控点血浆超滤液样品。
-
取空白血浆超滤液，直接进样，得到色谱图A；空白血浆超滤液加替考拉宁对照品溶液配制成一定浓度（1.00 μg/ml），混合均匀后进样，得色谱图B；取使用替考拉宁的患者血浆，按“1.5”项下处理，进样后得色谱图C，考察方法的专属性。根据色谱图1中A、B、C，可以看出血浆中内源性物质没有干扰替考拉宁的检测，同时TA 2-2与TA 2-3完全分开，TA 2-2保留时间为11.57 min，可以准确定量TA 2-2。
图 1 替考拉宁色谱图
-
分别取“1.6”项下各浓度标准曲线血浆超滤液样品5 μl直接进样分析，以替考拉宁游离浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得线性回归方程为Y=51 708.90X+1 397.10（r=0.999，n=8），结果表明，替考拉宁游离浓度在0.10～8.00 μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系，定量下限为0.10 μg/ml。
-
按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品各6份，直接进样分析，计算批内精密度。按照相同的方法重复测定3次，计算批间精密度。结果见表2。如表2所示，在低、中、高浓度水平，样品的批内和批间RSD (%)均不超过7.00%，实测值与理论值相对误差在−5.00%～7.00%之间，精密度与准确度均符合生物样品测定要求。
表 2 批内和批间精密度与准确度(n=6，
$ \bar x$ ±s)理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）准确度
（%）精密度（%） 批内 批间 0.25 0.25±0.02 1.56 6.91 6.77 1.50 1.43±0.05 −4.52 2.53 3.83 6.00 5.95±0.20 −0.88 2.99 3.44 -
按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品各6份，直接进样分析，按线性回归方程计算实测浓度，以实测浓度与理论浓度的比值计算方法回收率。表3结果显示，低、中、高浓度水平的回收率在93.8%～101%范围内，总回收率为97.9%，同时RSD (%)也符合生物样品分析要求。
表 3 替考拉宁的方法回收率(n=6，
$ \bar x$ ±s)浓度水平
（μg/ml）回收率
（%）RSD
(%)总回收率
（%）总RSD
(%)0.25 101±7.00 6.91 97.9 5.50 1.50 93.8±2.37 2.53 6.00 98.5±2.96 3.01 -
取来源不同的6个空白血浆样品，按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，每个来源都分别配制成低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品（每个浓度3份），直接进样分析，得峰面积A1。此外，用超纯水配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的替考拉宁对照品溶液（每个浓度3份），直接进样分析，得峰面积A2。计算相应样品中替考拉宁的A1/A2值，即为基质因子（MF），考察基质效应。表4结果显示，低、中、高浓度水平所有样品的平均基质因子为0.97，接近1.00，且RSD (%)为2.12%，符合生物样品分析要求，说明基质效应不会影响分析方法的准确性。
表 4 替考拉宁在血浆超滤液中的基质效应(n=3，
$ \bar x$ ±s)浓度水平（μg/ml） 基质因子 0.25 1.50 6.00 基质A 0.96±0.02 0.96±0.01 0.98±0.02 基质B 0.95±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01 基质C 1.00±0.01 0.97±0.01 0.99±0.01 基质D 0.97±0.02 1.00±0.01 0.98±0.01 基质E 0.99±0.03 0.98±0.02 0.99±0.03 基质F 0.97±0.02 0.95±0.01 0.98±0.01 各浓度水平均值 0.97 0.97 0.98 各浓度水平RSD (%) 2.58 2.21 1.30 总均值 0.97 总RSD (%) 2.12 -
配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复样品，放置在室温10 h后与当日配制的标准曲线同批测定，考察替考拉宁血浆超滤液样品在室温下的稳定性。结果见表5，室温放置10 h后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−4.00%～2.17%，RSD(%)不超过6.00%，在生物样品分析要求范围内，表明样品在室温下放置10 h后稳定性较好。
表 5 不同储存条件下替考拉宁样品的稳定性(n=6，
$ \bar x$ ±s)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD (%) 准确度（%） 室温10 h 0.25 0.24±0.01 5.52 −4.00 1.50 1.48±0.03 2.16 −1.33 6.00 6.13±0.12 2.09 2.17 −20 ℃ 15 d 0.25 0.22±0.01 4.76 −12.00 1.50 1.46±0.02 1.98 −2.67 6.00 5.79±0.13 2.23 −3.50 冻融3次 0.25 0.22±0.01 6.43 −12.00 1.50 1.44±0.05 3.67 −4.00 6.00 5.68±0.18 3.15 −5.33 -
配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复的样品，在−20 ℃放置15 d后与测定当日配制的标准曲线同批进样分析，考察替考拉宁血浆样品−20 ℃下的稳定性。结果见表5，−20 ℃下储存15 d后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−12.0%～−2.67%，RSD在5.00%以内，符合生物样品分析要求，表明样品在−20 ℃保存15 d后稳定性达标。
-
配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复的样品，放置在−20 ℃的冰箱内超过24 h，取出放置在室温条件下完全溶解后，再放置在−20 ℃的冰箱内，反复冻融3次，在第3次融化后与测定当日配制的标准曲线同批进样分析，以考察血浆样品3次冻融循环稳定性。结果见表5，反复冻融3次后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−12.0%～−4.00%，RSD在6.50%以内，符合生物样品分析要求，表明样品冻融后稳定性仍较好。
-
近年来，血浆药物游离浓度的监测逐渐受到广泛关注。对于临床上提倡进行治疗药物监测，而蛋白结合率又高于80%的药物，建议监测药物游离浓度用以指导用药的剂量调整。对于高蛋白结合率的药物来说，白蛋白水平的改变可能会导致其药动学参数变异性增加[12]。因此，对于低蛋白血症（Alb<25 g/L）[8-10]、危重症、酸血症、肾衰竭、肝硬化、吸烟、多种药物合用等这类常伴有白蛋白水平降低的患者来说，替考拉宁的蛋白结合率具有一定的变异性[7, 13]，即使获得相同的替考拉宁总浓度，体内真正发挥药效的游离替考拉宁浓度也可能不同。此时，应准确测定替考拉宁游离浓度来调整用药剂量，以防浓度低达不到治疗目标，或用药过量导致不良反应的发生。为实现对替考拉宁游离浓度的监测，本研究首次建立了超滤离心结合UPLC-MS/MS的方法。该方法与传统的高效液相色谱法相比，优点在于检测速度快，检测限较低，灵敏度较高，质谱检测可以排除患者所用的其他药物对替考拉宁的干扰，准确度较高。替考拉宁在水中易溶，在乙腈、甲醇中几乎不溶。因此，用超纯水作为储备液溶剂可使对照品完全溶解。替考拉宁成分复杂，为实现对各组分的有效分离，本研究选用Dikma公司的EndeavorsilTM C18柱，是通用型UPLC反相柱，具有独特的选择性和超高的分离性能，适合于高效、超快速分离分析，且峰形对称性好。在流动相选择的前期探索中，发现乙腈较甲醇可以更好地提高质谱响应，所以，选用乙腈作为有机相。水相则选择在0.02 mol/L醋酸铵溶液中加入0.1%甲酸，增加离子化效率，进一步改善峰形，使各组分完全分离。此外，采用电喷雾电离源(ESI)电离方式，发现替考拉宁在正离子模式下具有较高的离子化效率，且重现性良好。药物游离浓度的测定具有一定的难度，难点在于如何快速且有效地分离游离型药物，对血浆样品的处理有较高的要求。目前，测定药物游离浓度常见的样品处理方法主要有平衡透析法、超滤离心法[14]。其中最常用的是超滤离心法，该法不需稀释，不会改变生理pH值、离子组成，主要是利用离心力使游离药物通过半透膜，迅速而有效地从血液及其他生物样本中分离游离药物[15]。现国内外常用的超滤离心装置主要有Centrifree®和Amicon Ultra两种型号。本研究选用Centrifree®超滤装置进行分离。Roberts等在替考拉宁游离浓度测定的研究中，使用Amicon Ultra超滤装置分离蛋白[10]。但是，在实验前期探索中，我们发现Amicon Ultra装置所得血浆超滤液中加入乙腈后仍有沉淀析出，蛋白截留不完全；而Centrifree®装置产品说明书提示Centrifree®装置可以截留99.9%的蛋白，且使用该装置所得血浆超滤液中加入等量乙腈后未见明显沉淀析出。虽然两者所用滤膜均是再生纤维素膜，但是相比Amicon Ultra的凹槽设计、Centrifree®系列的平面设计，优点在于滤面更大，死体积更小，更有利于微溶质的滤过，是专用于从血液等生物样本中分离蛋白结合微溶质的，用于游离型药物的分离更为合理[15]。其次，为保证游离药物可以和蛋白有效分离，应选择合适的滤膜孔径。由于替考拉宁主要与白蛋白结合，而白蛋白的分子量约为66 000，本研究选用截留分子量为30 000的滤膜用以截留与白蛋白结合的药物，获得游离型替考拉宁。此外，确定合适的样品处理条件也是至关重要的。首先，收集的血浆样品为保持稳定性，需要低温保存，但温度较低可能会影响药物与蛋白的结合，导致药物游离浓度偏低，为保证测定结果的准确性，样品需在37 ℃平衡30 min后再进行超滤离心[10]。其次，离心力与离心时间也是影响超滤效果的重要因素[16]。离心力（1 000～2 000）×g可以达到最佳滤过率，离心时间在15～30 min时超滤液量与离心时间成正比[16]，再结合文献[10]报道，本研究最终选用离心力1 500×g，离心时间30 min。同时，为保证样品测定尽可能不受基质的影响，本研究所有样品均采用空白血浆超滤液作为基质进行配制。有文献[17]也指出，游离药物分析最适宜的基质为空白血浆超滤液。方法建立后按照《中国药典》（2015年版）附录《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行验证，验证结果均符合该指导原则的要求。综上，本研究建立了离心超滤结合UPLC-MS/MS检测替考拉宁游离浓度的方法，该方法简便、快速、灵敏、准确，可以为临床开展替考拉宁游离浓度监测提供依据。
Assay of unbound teicoplanin in human plasma by centrifugal ultrafiltration combined with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
-
摘要:
目的 建立离心超滤结合超高效液相色谱串联质谱法用以测定替考拉宁血浆游离浓度。 方法 利用Centrifree®超过滤装置去除血浆中的白蛋白，超滤液直接进样测定替考拉宁游离浓度。色谱柱为EndeadvorsilTM C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.02 mol/L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）与乙腈，梯度洗脱，在电喷雾离子化（ESI）正离子模式下进行检测。 结果 替考拉宁血浆游离浓度为0.10～8.00 μg/ml，线性范围良好（r=0.999）。批内、批间精密度不超过7.00%，方法回收率为97.9%，基质效应因子为0.97。 结论 该研究建立的方法简便、快速、灵敏、准确，可为临床开展替考拉宁血浆游离浓度监测提供依据。 -
关键词:
- 替考拉宁 /
- 游离浓度 /
- 离心超滤 /
- 超高效液相色谱串联质谱法
Abstract:Objective To establish an assay method for unbound teicoplanin in plasma by centrifugal ultrafiltration combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Methods Protein was removed from plasma by a Centrifree® ultrafiltration device. The ultrafiltrate was injected to determine the unbound concentration of teicoplanin. EndeadvorsilTM C18 column (1.8 μm, 50 mm×2.1 mm) was used with gradient elution of acetonitrile and 0.02 mol/L ammonium acetate solution (containing 0.1% formic acid). The detection was performed on a triple-quadrupole tandem mass spectrometer by multiple reaction monitoring (MRM)mode via electro spray ionization (ESI). Results The calibration curve of unbound teicoplanin in plasma was linear over the range of 0.10 to 8.00 μg/ml (r=0.999). The intra-assay precision and the inter-assay precision of samples didn't exceed 7.00%. The average relative recovery ratio was 97.9%, and the matrix effect factor was 0.97. The samples had good stability after being stored at room temperature for 10 h or at −20 ℃ for 15 days, and freeze-thawed 3 times (RSDs were all within 6.50%). Conclusion This method is convenient, fast, sensitive and accurate. It provided a basis for clinical development of teicoplanin unbound concentration monitoring. -
超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
-
表 1 梯度洗脱信息
时间（t/min） 流速（ml/min） A（%） B（%） 0.0 0.2 85 15 11.0 0.2 74 26 13.0 0.2 74 26 15.0 0.2 85 15 20.0 0.2 停止 停止 
下载: 导出CSV
表 2 批内和批间精密度与准确度(n=6，
$ \bar x$ ±s)理论浓度
（μg/ml）实测浓度
（μg/ml）准确度
（%）精密度（%） 批内 批间 0.25 0.25±0.02 1.56 6.91 6.77 1.50 1.43±0.05 −4.52 2.53 3.83 6.00 5.95±0.20 −0.88 2.99 3.44
下载: 导出CSV
表 3 替考拉宁的方法回收率(n=6，
$ \bar x$ ±s)浓度水平
（μg/ml）回收率
（%）RSD
(%)总回收率
（%）总RSD
(%)0.25 101±7.00 6.91 97.9 5.50 1.50 93.8±2.37 2.53 6.00 98.5±2.96 3.01
下载: 导出CSV
表 4 替考拉宁在血浆超滤液中的基质效应(n=3，
$ \bar x$ ±s)浓度水平（μg/ml） 基质因子 0.25 1.50 6.00 基质A 0.96±0.02 0.96±0.01 0.98±0.02 基质B 0.95±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01 基质C 1.00±0.01 0.97±0.01 0.99±0.01 基质D 0.97±0.02 1.00±0.01 0.98±0.01 基质E 0.99±0.03 0.98±0.02 0.99±0.03 基质F 0.97±0.02 0.95±0.01 0.98±0.01 各浓度水平均值 0.97 0.97 0.98 各浓度水平RSD (%) 2.58 2.21 1.30 总均值 0.97 总RSD (%) 2.12
下载: 导出CSV
表 5 不同储存条件下替考拉宁样品的稳定性(n=6，
$ \bar x$ ±s)储存条件 理论浓度（μg/ml） 实测浓度（μg/ml） RSD (%) 准确度（%） 室温10 h 0.25 0.24±0.01 5.52 −4.00 1.50 1.48±0.03 2.16 −1.33 6.00 6.13±0.12 2.09 2.17 −20 ℃ 15 d 0.25 0.22±0.01 4.76 −12.00 1.50 1.46±0.02 1.98 −2.67 6.00 5.79±0.13 2.23 −3.50 冻融3次 0.25 0.22±0.01 6.43 −12.00 1.50 1.44±0.05 3.67 −4.00 6.00 5.68±0.18 3.15 −5.33
下载: 导出CSV
-
[1] 郑波, 李家泰. 糖肽类抗生素替考拉宁的研究进展[J]. 中国临床药理学杂志, 1999:64-68. [2] 王雅连, 魏理, 黄珊珊, 等. HPLC-UV法测定人血浆中替考拉宁的浓度[J]. 今日药学, 2018, 28(7):450-452. doi: 10.12048/j.issn.1674-229X.2018.07.005 [3] BERNAREGGI A, BORGHI A, BORGONOVI M, et al. Teicoplanin metabolism in humans[J]. Antimicrob Agents Chemother,1992,36(8):1744-1749. doi: 10.1128/AAC.36.8.1744 [4] MALABARBA A, STRAZZOLINI P, DEPAOLI A, et al. Teicoplanin, antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. VI. Chemical degradation: physico-chemical and biological properties of acid hydrolysis products[J]. J Antibiot,1984,37(9):988-999. doi: 10.7164/antibiotics.37.988 [5] 于晓佳, 刘丽宏, 张征, 等. 高效液相色谱法测定替考拉宁的血药浓度[C]. 上海: 中国药理学会第三届全国治疗药物监测学术年会, 2013. [6] MCCANN S J. Assay of teicoplanin in serum: comparison of high-performance liquid chromatography and fluorescence polarization immunoassay[J]. J Antimicrob Chemother,2002,50(1):107-110. doi: 10.1093/jac/dkf067 [7] YANO R, NAKAMURA T, TSUKAMOTO H, et al. Variability in teicoplanin protein binding and its prediction using serum albumin concentrations[J]. Ther Drug Monit,2007,29(4):399-403. doi: 10.1097/FTD.0b013e3180690755 [8] BRINK A J, RICHARDS G A, LAUTENBACH E E G, et al. Albumin concentration significantly impacts on free teicoplanin plasma concentrations in non-critically ill patients with chronic bone Sepsis[J]. Int J Antimicrob Agents,2015,45(6):647-651. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2015.01.015 [9] ULLDEMOLINS M, ROBERTS J A, RELLO J, et al. The effects of hypoalbuminaemia on optimizing antibacterial dosing in critically ill patients[J]. Clin Pharmacokinet,2011,50(2):99-110. doi: 10.2165/11539220-000000000-00000 [10] ROBERTS J A, STOVE V, DE WAELE J J, et al. Variability in protein binding of teicoplanin and achievement of therapeutic drug monitoring targets in critically ill patients: Lessons from the DALI Study[J]. Int J Antimicrob Agents,2014,43(5):423-430. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2014.01.023 [11] BYRNE C J, PARTON T, MCWHINNEY B, et al. Population pharmacokinetics of total and unbound teicoplanin concentrations and dosing simulations in patients with haematological malignancy[J]. J Antimicrob Chemother,2018,73(4):995-1003. doi: 10.1093/jac/dkx473 [12] INVESTIGATORS T S S. Impact of albumin compared to saline on organ function and mortality of patients with severe Sepsis[J]. Intensive Care Med,2011,37(1):86-96. doi: 10.1007/s00134-010-2039-6 [13] ROBERTS J A, PEA F, LIPMAN J. The clinical relevance of plasma protein binding changes[J]. Clin Pharmacokinet,2013,52(1):1-8. doi: 10.1007/s40262-012-0018-5 [14] 徐丙发, 李秀. 特殊患者替考拉宁药物浓度监测的临床应用进展[J]. 中国医院药学杂志, 2017, 37(15):1536-1539. [15] 陈茂林, 周世文. 超滤法结合高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑蛋白结合率[J]. 中国医院药学杂志, 2017, 37(8):727-731. [16] 陈冰, 蔡卫民. 游离药物浓度监测及其应用研究进展[J]. 中国临床药理学杂志, 2008, 24(3):255-259. doi: 10.3969/j.issn.1001-6821.2008.03.016 [17] DE MORAES N V, LAURETTI G R, NAPOLITANO M N, et al. Enantioselective analysis of unbound tramadol, O-desmethyltramadol and N-desmethyltramadol in plasma by ultrafiltration and LC–MS/MS: Application to clinical pharmacokinetics[J]. J Chromatogr B,2012,880:140-147. doi: 10.1016/j.jchromb.2011.11.033 -
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 4547
- HTML全文浏览量: 2010
- PDF下载量: 42
- 被引次数: 0
