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温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

彭慧丽 赵利娜 程艳芹 赵丽艳 封颖路 李明春

张淑秀, 袁伯川, 杜丽娜, 金义光. 多糖用于放射性核素清除的研究进展[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405060
引用本文: 彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
ZHANG Shuxiu, YUAN Bochuan, DU Lina, JIN Yiguang. Progress on elimination of radioactive nuclides by polysaccharides[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405060
Citation: PENG Huili, ZHAO Lina, CHENG Yanqin, ZHAO Liyan, FENG Yinglu, LI Mingchun. Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095

温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
详细信息
    作者简介:

    彭慧丽,硕士生,研究方向:中药制备工艺,Tel:15735013093,Email:15735013093@163.com

    通讯作者: 李明春,硕士,主任药师,硕士生导师,研究方向:药理学,Tel:(0532)51870518,Email:lmc401y@163.com
  • 中图分类号: 284.1

Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm

  • 摘要:   目的  优选温经活血巴布剂中挥发油的超临界CO2萃取工艺条件。  方法  在单因素考察萃取温度、分离斧I温度、萃取压力、萃取时间对萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素综合评分的基础上,正交设计优选萃取温度、萃取压力、萃取时间对所提挥发油综合评分的影响。  结果  单因素实验中,对所提挥发油综合评分影响较大的因素为萃取温度,萃取压力和萃取时间,正交实验结果表明萃取温度、萃取压力对挥发油综合评分有显著影响,优选的最佳工艺为:萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2.0 h。  结论  本实验优选的萃取工艺稳定可行,可用于该挥发油的提取制备。
  • 药品非无菌产品微生物限度检查中微生物计数法(后简称计数法)是药品检验的重要组成部分,是对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数[1]。计数法检验流程概括为:取供试品根据其理化和生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。倍比稀释,选取1~3个合适的稀释级(根据样品特性和污染情况)用平皿法、薄膜过滤法或MPN法做供试品检查。供试样品的制备过程中使样品充分溶解或分散,并有效降低或消除药品本身的抑菌性在检验过程中尤为重要,是得到准确的微生物计数检验结论的关键点。过去的研究主要集中在对计数法检验有影响的菌株选择和保存、培养基质量控制、操作环境控制及被检样品方法适用性研究,而对药品的前处理(即供试液的制备方法)尤其是中成药的前处理法研究甚少。据佘凡等报道[2-7],影响微生物限度检验误差因素分析中因前处理所产生误差在各因素中占比重较高。李超美等[8]曾组织同省9个药检所对同厂家、同批号中成药“香莲丸”做微生物限度验证,发现验证方法并不完全相同,以致验证结果不同,影响实验结果一致性评价。分析其主要原因是选择了不同的前处理方法,样品经前处理后是否完全溶解或分散,供试液中颗粒大小和沉降速度,取供试液时是振摇混匀还是取上清液、样品抑菌性是否被中和等因素直接影响微生物的回收率,致使各实验室有的采用常规法,有的采用培养基稀释法,有的采用薄膜过滤法才能使回收率达到药典规定的要求。

    鉴于中成药微生物限度计数法前处理工作对提高中成药的检验质量影响较大,本文就中成药前处理关键影响因素和优化方法进行了系统的分析和综述。

    《中国药典》2020版与欧美药典[1,9,10]在样品供试液制备时(前处理)都根据药品的理化特性和生物学特性将药品分类。一般口服制剂除肠溶、结肠溶和膜剂供试品外基本分为三类:水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。中成药配方复杂,成分多样,制法较西药特殊。如片剂中牛黄解毒片是由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草8味药组成,制法是:以上八味,雄黄水飞成极细粉;大黄粉碎成细粉;人工牛黄、冰片研细;其余黄芩等四味加水煎煮二次,合并滤液浓缩成稠膏或干燥成干浸膏,加入大黄、雄黄粉末,制粒,干燥,再加入人工牛黄、冰片粉末,混匀,压制成片[11]。丸剂中防风通圣丸由防风、大黄、芒硝、栀子、滑石、白术、白芍、当归等17味中药组方。制法是以上十七味,滑石粉碎成极细粉;其余防风等十六味粉碎成细粉,过筛,混匀,用水制丸,干燥,用滑石粉包衣, 打光,干燥,即得。或以上十七味,粉碎成细粉,过筛,混匀,用水制丸,干燥,即得[11]。从以上两个中成药的配方、制法可以看出中成药是药材提取物与原粉的混合,雄黄、石膏是矿物质,冰片是植物提取物结晶,都不溶于水,其他生药原粉也不能完全溶于水。所以较难将其简单分成水溶性、不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品。这是影响各实验室选择前处理方法制备样品最直接的因素。

    《中国药典》2020版和欧洲药典的缓冲液pH值范围基本相同[1,10],为pH7.0、pH7.2、pH6.8、pH7.6,供试液制备时如需要,应调节pH值至6~8。中成药组方成分和制造工艺多样,决定产品的pH值范围较广,所需缓冲能力较大,缓冲范围涵盖pH值6~8的缓冲液。如麻仁丸配方为火麻仁、枳实(炒)、苦杏仁、大黄、炒白芍、姜厚朴。其制法为以上六味,除火麻仁、苦杏仁外,其余大黄等粉碎成细粉,再与火麻仁、苦杏仁掺研成细粉,过筛,混匀。粉末用炼蜜加适量的水制丸,干燥,制成水蜜丸;或加炼蜜制成小蜜丸或大蜜丸,即得[11]。这一制作过程没有对成品的酸碱度有特殊要求。又如一清胶囊的处方为黄连、大黄、黄芩。其制法是以上三味,分别加水煎煮两次,合并煎液,滤过,滤液分别减压浓缩,喷雾干燥,制得黄芩浸膏粉及大黄和黄连的混合浸膏粉。两种浸膏粉分别制颗粒,干燥,粉碎,加入淀粉、滑石粉和硬脂酸镁适量,混匀,装入胶囊,制粒,即得。整个过程没有测定酸碱度[11]。再如乙肝益气解郁颗粒配方为柴胡(醋炙)、白芍、枳壳、橘叶、黄芪、丹参、党参、茯苓、桂枝、瓜蒌、刺五加、黄连、法半夏、山楂、决明子、五味子。其制法是以上16味,白芍、茯苓、法半夏分别粉碎,过筛,依次取细粉混匀,备用;剩余的粗粉备用。五味子粉碎后用80%乙醇回流提取两次,合并提取液,回收乙醇,备用。其余柴胡(醋炙)等12味及白芍等三味的粗粉加水煎煮两次,合并煎液,静置 12小时,取上清液,与上述五味子提取液合并,浓缩,加入上述细粉及适量糖粉混匀,制成颗粒[11]。从以上丸剂、胶囊剂、颗粒剂的举例中可以看出中成药的pH范围会比较宽泛,将被检样品的前处理液加入胰酪大豆胨琼脂做菌落总数的培养,或许会改变培养基的酸碱度进而影响菌落的生长繁殖,从而影响菌落计数结果的准确性。根据细菌适应酸碱度不同可将微生物分成:中性微生物、嗜酸性微生物、耐酸性生物、嗜碱性微生物、耐碱性微生物等。培养基酸碱环境的改变,必然影响微生物的生长繁殖。另有研究表明,药品的分散度也会影响供试液的pH值,进而影响微生物的生长造成实验结果的差异[12]

    增加被检样品的分散度和溶解度有利于样品中的微生物更均匀的分布于处理液中。取样均匀性的提升有助于提高微生物的检出率。吐温80为非离子型表面活性剂,亲水性强,是优良的O/W型乳化剂,对植物油、矿物油、动物油脂等均有良好的乳化作用。根据《中国药典》2020版四部通则1105,供试液前处理添加吐温80浓度为0.1%,如水不溶性非油脂类分散力较差的供试品,可在稀释液中加入无菌0.1%的聚山梨酯80。油脂类供试品可加入无菌十四烷酸异丙酯,或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀[1]。表面活性剂浓度过高会使细菌细胞膜中的脂类溶解而造成菌体死亡[13-16]。因此合适浓度的表面活性剂的使用尤为重要。王康[17]等增加吐温 80比例制备中药提取物穿心莲内酯固体分散体发现其能有效地提高穿心莲内酯的溶出速率。高飞[18]等在化妆品检测使用含1 g/L卵磷脂和7 g/L的吐温80生理盐水做缓冲液,可中和化妆品中防腐剂对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。张华光[19]等在缓冲液中添加3%吐温80和0.3%卵磷脂中和抑菌性较强的药品。中成药原料来源广泛,有动植物矿物等,所以表面活性剂对于中成药在计数法前处理中的最适用量仍有待研究。

    中成药种类多且成分复杂,难以归入药典列出的干扰物种类中。许多中成药对临床耐药细菌具有较好的抑制作用,临床上也常用抗菌中成药和抗生素联合应用以降低细菌的耐药性。深入研究中药抑菌作用和机制,大致可分为直接和间接抑制作用。直接抑制作用包括消除或逆转细菌耐药质粒、抑制细菌β-内酰胺酶活性和外排泵、改变细胞膜的通透性与消除生物膜等。间接抑制作用主要是:中药通过提高机体免疫力对抗耐药性细菌。据研究[20-22],许多中药有抑菌作用,如黄芩、黄连、连翘、五倍子、五味子、乌梅、金银花等57种,中成药包括黄连上清片、穿心莲内酯胶丸、妇必舒胶囊等。有些中药的抗菌作用机制不是单一的,而是能够在多个方面发挥作用,所以药典常见中和剂或灭活方法(详见表1)是否能满足、何种浓度能满足有抑菌成分中成药的计数法检验要求尚待研究。

    表  1  《中国药典》2020版常见的中和剂或灭活方法[1]
    干扰物可选用的中和剂或灭活方法
    戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠
    酚类、乙醇、醛类、吸附物稀释法
    醛类甘氨酸
    季铵化合物、对羟基苯甲酸、
    双胍类化合物
    卵磷脂
    季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸聚山梨酯
    水银巯基醋酸盐
    水银、汞化物、醛类硫代硫酸盐
    EDTA、唆喏酮类抗生素镁或钙离子
    磺胺类对氨基苯甲酸
    β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶
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    陶明[23-24]等发现影响抑菌干混悬剂微生物限度方法适用性的因素主要是样品原料的分散性和中和剂的有效单位。对药品进行微生物限度计数法前处理的目的是:在生物样本安全的前提下通过前处理使被检样品成为均匀的溶液或悬浊液,以保证取样的均匀性。这样吸取供试液时,既可保证液体分散均匀,又可避免只吸取上清液或沉淀物,还可防止被检样品溶散不均造成制备液pH不同而形成结果偏离[4,7,25]。优化中成药前处理的方法有利于最终选取合适的检验方法(常规、稀释、中和、薄膜过滤法)消除样品的抑菌性,取得科学、准确的实验结果。

    中成药大致分为口服和外用两种使用方式,口服剂型大多为片剂、胶囊、丸剂等。无论中成药成分多复杂,减小被检样品的粒度从而增加样品的溶解度和分散度都是较佳选择。最直接减小被检样品的粒度方法就是提高匀浆效率。《中国药典》2020版对前处理匀浆的转速没有特别规定,而《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》(GB4789.2-2020)中规定检测样品的匀浆转数常规为8 000~10 000 r/min,持续1~2 min[26-27]。有研究[28]分别用匀浆仪和研磨法对9种丸剂和3种片剂进行前处理,从各组实验所得的细菌数平均值来看,匀浆法测定的细菌数大于研磨法,并呈显著性差异,如槐角丸、益肝丸、通窍鼻炎片在研磨时菌落数为4.0×102、2.7×103、2.9×102CFU/g,经均质器细匀后菌落数为8.7×102、3.4×104、6.4×102CFU/g,说明样品均质的细腻均匀可提高细菌检出率。庞云娟等[29]报道,供试液制备过程中被检样品分散度和溶解度不足是造成实验结果偏离的原因之一。以上研究表明适当提高匀浆效率可增加样品的分散度和溶解度,进而提高细菌检出率以达到提升检验准确度的目的。均质器转速和时间可参考食品菌落总数检测标准。

    磷酸盐缓冲溶液可以通过H2PO4和HPO42-在不同的pH下形成缓冲体系。当H2PO4和HPO42-的浓度比为1∶1时,此时溶液的pH值为6.86,也被称为磷酸盐缓冲液的电中性点。在电中性点的pH值下,磷酸盐缓冲溶液的缓冲能力最弱。随着pH值的升高,H2PO4的浓度逐渐降低,溶液的缓冲能力逐渐增强。当pH升到7.21时,H2PO4和HPO42-的浓度比为1∶2,此时溶液的缓冲能力最强,称为磷酸盐缓冲溶液的最大缓冲范围。随着pH值的继续上升,HPO42-的浓度逐渐升高,H2PO4的浓度逐渐降低,溶液的缓冲能力逐渐减弱。磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围在pH值5.8~8.0之间,这个范围是根据H2PO4和HPO42-的浓度比和pH值的关系所确定的,并且在pH值7.21左右具有最大的缓冲能力[30],所以pH7.2的磷酸盐缓冲溶液最适合中成药的前处理。

    许多中成药含抑菌成分,通过添加表面活性剂吐温80,可提高非水溶性成份在稀释剂中溶解度和分散度。研究[31,32]表明,添加表面活性剂效果优于调节pH值,因当药品含有抑菌性成分时,降低pH值会增加药品的抑菌性。为方便分析中成药的抑菌性,我们将中成药分为以下几类:①清热解毒类中成药常含有板蓝根、黄芩、金银花等有较强抑菌能力;②止咳平喘类的中成药若含有麻黄、川贝母、薄荷脑等成分的药物的抑菌性也比较强;③胃肠道类中成药如含有广藿香、紫苏叶等成分的药物也有较强的抑菌作用;④抗感冒类药大多含有较高金银花、甘草、柴胡等中药抑菌性较强;⑤妇科内服类中成药比外用药抑菌性弱;⑥镇痛抗炎抗风外用中成药如含有黄柏对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有抑制作用[33]。欧洲药典11.0对有抑菌作用药品选用的缓冲液其中含3%聚山梨脂80和0.3%蛋黄卵磷脂[10],既能增加被测样品的分散度和溶解度,又能中和药品本身的抑菌成分同时又可增加样品中细菌的检出率。[19]

    既满足方法适应性菌株的回收率要求又提高样品溶解度和悬浊液的稳定性,是优化前处理过程的关键。稀释液在前处理的过程中起着重要的作用,一方面需要最大程度提供各类菌株的生存条件,另一方面要易于药品的溶解和分散。《中国药典》2015年版药品微生物限度检查方法实例中保济丸在微生物限度计数检验选用了两种稀释液,先用胰酪大豆液体培养基将被检样品制成1∶100的供试液,再取上清液薄膜过滤,并用含0.1%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜[34]。前者可提高菌株回收率,后者可增加溶解和分散。另外有研究[35]表明,参考《中国药典》使用标准菌株进行化妆品微生物指标检验的供试液制备,研究不同的前处理方法的适用性结果显示:使用含中和剂的大豆酪蛋白葡萄糖卵磷酯吐温80(SCDLP)液体培养基、改良卵磷脂肉汤、戴伊恩格利中和肉汤(D/E中和肉汤)制备供试液,加菌计数回收试验结果及控制菌(耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌)阳性检出率,均优于按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)用生理盐水制备供试液,其中采用 D/E 中和肉汤进行样品制备,对样品中防腐剂的中和效果最好。

    《中国药典》2020年版要求生产厂家进行一厂、一品、一规的微生物限度标准制订和验证实验,验证报告要完整、可靠。作为药品检验机构由于检验周期所限,实际抽检工作中不可能像生产厂家去一一验证。因此,分析研究中成药这一大类非无菌药品计数法检验的特点,优化检验过程,特别是样品前处理是检验中成药的重要环节。中成药成分多为动植物和矿物,使计数法前处理时难以简单用溶解度分类,往往同一种药品各实验室选择不同检验方法,导致检验结果差异加大。且中药炮制工艺多样使中成药的酸碱度范围宽泛,如果药品前处理时稀释液的缓冲能力不强,会影响后续培养基的酸碱度,进而影响检验结果的准确性。有些中成药本身具有抑菌性,若不中和或去除会造成假阴性结果。

    以上因素直接影响中成药计数法的检出率和准确度,寻找一种分散度和溶解度好,缓冲力强且能中和药品抑菌性,又对受损细菌有修复力的缓冲液显得尤为迫切。本文从影响中成药计数法检验因素入手,层层分析寻找解决方案。综合中国药典和美国药典以及相关文献内容归纳出解决的途径:首先在稀释液中加入适宜的非离子表面活性剂吐温80和卵磷脂(3%吐温80和0.3%卵磷脂)等中和剂,可以起到增加药品分散度和溶解度并中和部分抑菌性的作用;其次通过增加适宜浓度的磷酸盐缓冲离子对(Na2HPO4和KH2PO4),使缓冲液达到最大缓冲能力,用以降低中成药因偏酸或偏碱对培养基的影响;再则增加缓冲液中生长因子和维生素以利于受损细菌的快速恢复。最后选择合适的匀浆速度和时间,在适宜剪切力的作用下使缓冲液和被检样品充分混和均匀。

    随着课题研究进一步深入,最终可创新出一款可加强分散度和溶解度、提高取样均匀性、降低中成药抑菌性、加强缓冲能力、加强短时间修复受损细菌能力的改良缓冲液。以提高中成药计数法检验结果的准确性、重复性及工作效率,解决中成药计数法检验中遇到的诸多问题。为监测中成药计数法这类非无菌制剂的安全性和有效性提供现实的应用价值。

  • 图  1  温经活血巴布剂挥发油混合对照品、供试品、阴性供试品HPLC图

    A. 混合对照品;B温经活血巴布剂挥发油供试品;C.缺独活、羌活的阴性供试品;1.蛇床子素;2.异欧前胡素

    图  2  单因素试验结果

    A.萃取温度;B.分离斧Ⅰ温度;C.萃取压力;D.萃取时间

    表  1  正交试验设计及结果

    试验号因素萃取得率
    (%)
    蛇床子素含量
    (mg/g)
    异欧前胡素含量
    (mg/g)
    综合评分*
    (Y)
    ABCD
    111112.5520.3410.5069.95
    212222.9822.1910.9076.79
    313334.4320.85 9.3985.70
    421233.5523.8611.4585.05
    522313.7525.9911.7789.94
    623123.8027.3812.7894.28
    731323.0023.7711.0078.95
    832133.3824.8111.1783.90
    933213.7527.4010.7889.15
    K1232.44233.95248.13249.04
    K2269.27250.63250.99250.02
    K3252269.13254.59254.65
    R 36.83 35.18 6.46 5.61
    注:*综合评分(Y)计算公式见“2.3”项;因素A:萃取温度;因素B:萃取压力;因素C:萃取时间;因素D:空白
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    表  2  正交因素试验水平表

    水平因素
    A.萃取温度(T/ ℃)B.萃取压力(P/MPa)C.萃取时间(t/h)
    150202.0
    255253.0
    360304.0
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    表  3  方差分析结果

    方差来源方差平方和自由度均方FP
    A226.3662113.18337.819<0.05
    B206.4562103.22834.493<0.05
    C 6.9862 3.496 1.167>0.05
    D(误差) 5.9852 2.993
    F0.05(2,2)=19.0
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    表  4  3批中药材萃取得率和主要含量工艺验证试验结果

    批号萃取得率
    (%)
    蛇床子素含量(mg/g)异欧前胡素含量(mg/g)
    202107243.7027.8112.84
    202108013.8127.5012.73
    202108103.7926.9112.52
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-09-18
  • 修回日期:  2022-01-05
  • 网络出版日期:  2023-08-18
  • 刊出日期:  2023-08-25

温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
    作者简介:

    彭慧丽,硕士生,研究方向:中药制备工艺,Tel:15735013093,Email:15735013093@163.com

    通讯作者: 李明春,硕士,主任药师,硕士生导师,研究方向:药理学,Tel:(0532)51870518,Email:lmc401y@163.com
  • 中图分类号: 284.1

摘要:   目的  优选温经活血巴布剂中挥发油的超临界CO2萃取工艺条件。  方法  在单因素考察萃取温度、分离斧I温度、萃取压力、萃取时间对萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素综合评分的基础上,正交设计优选萃取温度、萃取压力、萃取时间对所提挥发油综合评分的影响。  结果  单因素实验中,对所提挥发油综合评分影响较大的因素为萃取温度,萃取压力和萃取时间,正交实验结果表明萃取温度、萃取压力对挥发油综合评分有显著影响,优选的最佳工艺为:萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2.0 h。  结论  本实验优选的萃取工艺稳定可行,可用于该挥发油的提取制备。

English Abstract

张淑秀, 袁伯川, 杜丽娜, 金义光. 多糖用于放射性核素清除的研究进展[J]. 药学实践与服务. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405060
引用本文: 彭慧丽, 赵利娜, 程艳芹, 赵丽艳, 封颖路, 李明春. 温经活血巴布剂中挥发油的提取工艺[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
ZHANG Shuxiu, YUAN Bochuan, DU Lina, JIN Yiguang. Progress on elimination of radioactive nuclides by polysaccharides[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405060
Citation: PENG Huili, ZHAO Lina, CHENG Yanqin, ZHAO Liyan, FENG Yinglu, LI Mingchun. Extraction Technology of Volatile Oil from Wenjing Huoxue Cataplasm[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(8): 492-495, 508. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202109095
  • 温经活血汤作为海军第九七一医院的院内处方,由川芎、红花、独活、羌活、秦艽、甘草等十四味中药材组成,可用于因“瘀、湿、寒”引起的各部位疼痛,如风湿性关节炎等,具有“温经散寒、活血消肿、祛风胜湿、通痹止痛”的功效。温经活血巴布剂是在温经活血汤基础上改良的新型制剂,该剂型在保持其原有药效作用的基础上,改善了汤剂在储存过程中易腐败的特点[1]。处方中川芎、红花、独活、羌活含有的挥发性成分是温经活血巴布剂发挥其药效作用的重要组成部分,其中独活、羌活的重要药效成分蛇床子素、异欧前胡素因其不溶于水的物理特性,故在全方水提时难以提出[2-5]。为更好地提取药材中的药效成分,本实验拟采用超临界CO2萃取技术[6-8],在单因素试验的基础上,正交设计优选川芎、红花、独活、羌活的挥发油提取工艺。

    • 安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),FA1604型电子分析天平(上海衡平仪器仪表厂),DHG-9023型电热恒温鼓风干燥箱(上海申贤恒温设备厂),KH-100B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司),HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司),HA221-40-11 超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司)。

    • 川芎(批号:200701)、红花(批号:200801)、羌活(批号:200201)、独活(批号:200301)均购自青岛天成中药饮片有限公司,经山东中医药大学张华教授鉴定川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根茎、红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花、羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang的干燥根茎和根、独活为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim, f. biserrata Shan et Yuan的干燥根,均符合《中华人民共和国药典》(2020年版)中的相关规定,为正品药材;蛇床子素对照品(批号:823A027)、异欧前胡素对照品(批号:A1229A025)均购自北京索莱宝科技有限公司,纯度均>98%;高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯(天津四友有限公司);其余试剂均为分析纯。

    • 按处方比例称取一定量的川芎、红花、羌活、独活药材,放入萃取釜中按设置好的温度和压力加热加压提取至结束后,从解析釜Ⅰ出料口接收黄色膏状提取物,计算所得萃取得率(萃取得率=所得提取物的质量/药材质量×100%)。

    • 精密称定蛇床子素、异欧前胡素适量分别置于25 ml容量瓶中,加甲醇定容后配制成210.40 μg/ml的蛇床子素、163.20 μg/ml的异欧前胡素对照品母液。精密量取蛇床子素对照品母液5 ml、异欧前胡素对照品母液3 ml于10 ml容量瓶中,用甲醇定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,得混合对照品溶液。

    • 精密称定超临界提取挥发油150 mg于25 ml容量瓶中,加甲醇超声处理后定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液,得供试品溶液。

    • 按处方比例称取缺羌活、独活的药材,按“2.1”项下工艺操作,同“2.2.2”项下进行样品处理,得阴性供试品溶液。

    • 色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),进样量:10 μl,流速:1.0 ml/min,柱温:20 ℃,检测波长:321 nm。流动相与洗脱条件:A相为乙腈,B相为水。梯度洗脱为:0~8 min,30%→62%A;8~22 min,62%A。

    • 分别精密吸取混合对照品溶液,挥发油供试品溶液,缺羌活、独活的阴性供试品溶液按“2.2.4”项下条件进样测定,记录色谱图。测得成分蛇床子素、异欧前胡素色谱峰达到了较为理想的分离效果,分离度均>1.5,理论板数均≥5 000,且阴性供试品对测定无干扰,混合对照品、供试品及阴性供试品色谱图见图1

      图  1  温经活血巴布剂挥发油混合对照品、供试品、阴性供试品HPLC图

    • 取混合对照品溶液,分别吸取2、5、10、20、30、40 μl注入液相色谱仪,记录峰面积。以对照品溶液的进样量为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线。得蛇床子素回归方程为Y=28.273X−1.521,r=1.000(n=6);异欧前胡素回归方程为Y=21.251X+21.496, r=1.000(n=6)。结果表明,蛇床子素在21.04~420.80 μg范围内线性良好,异欧前胡素在12.24~195.84 μg范围内线性良好。

    • 精密量取对照品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件重复进样6次,记录各成分色谱峰面积。结果表明蛇床子素、异欧前胡素的峰面积RSD分别为0.98%和0.64%,结果表明仪器精密度良好。

    • 取同一供试品溶液,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.4”项下色谱条件进样测定,记录各成分峰面积,蛇床子素和异欧前胡素的RSD分别为1.50%和1.36%,结果表明所提挥发油在室温条件下24 h内稳定。

    • 同样的条件下制备供试品溶液6份,按“2.2.4”项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算含量,结果蛇床子素和异欧前胡素的平均含量分别为17.34 mg/g和8.09 mg/g,RSD分别为1.85%和1.57%,结果表明该方法重复性良好。

    • 取已知含量的挥发油供试品6份,分别精密称定50 mg于10 ml容量瓶中,按药材成分含有量1∶1的比例,分别精密加入蛇床子素、异欧前胡素对照品按“2.2.2”项下制备供试品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件进行含量测定,测定两种成分的平均加样回收率为100.01%和99.65%,RSD分别为1.10%和1.13%,表明该方法稳定可行。

    • 取各操作下的供试品溶液,按“2.2.4”项下色谱条件分别进样,记录峰面积,按外标一点法进行所测指标的含量测定,测定结果如表1所示。

      表 1  正交试验设计及结果

      试验号因素萃取得率
      (%)
      蛇床子素含量
      (mg/g)
      异欧前胡素含量
      (mg/g)
      综合评分*
      (Y)
      ABCD
      111112.5520.3410.5069.95
      212222.9822.1910.9076.79
      313334.4320.85 9.3985.70
      421233.5523.8611.4585.05
      522313.7525.9911.7789.94
      623123.8027.3812.7894.28
      731323.0023.7711.0078.95
      832133.3824.8111.1783.90
      933213.7527.4010.7889.15
      K1232.44233.95248.13249.04
      K2269.27250.63250.99250.02
      K3252269.13254.59254.65
      R 36.83 35.18 6.46 5.61
      注:*综合评分(Y)计算公式见“2.3”项;因素A:萃取温度;因素B:萃取压力;因素C:萃取时间;因素D:空白
    • 影响超临界提取挥发油的主要因素有萃取温度、分离斧Ⅰ温度、萃取压力和萃取时间等,按照“2.1”项下实验方法,以萃取得率、蛇床子素含量和异欧前胡素含量的综合评分为考察指标综合评价[6-7],各指标权重系数分别为:0.40、0.30、0.30,综合评分公式:Y(得分)=(本组萃取得率/最高组萃取得率×0.40+本组蛇床子素含量/最高组蛇床子素含量×0.30+本组异欧前胡素含量/最高组异欧前胡素含量×0.30)×100,考察萃取温度(40、45、50、55、60 ℃)、分离斧Ⅰ温度(40、45、50、55、60 ℃)、萃取压力(20、25、30、35、40 MPa)、萃取时间(1、2、3、4、5 h)对所提挥发油的影响。采用控制变量的方法,当改变其中一个因素时,其余因素为萃取温度40 ℃、分离斧Ⅰ温度40 ℃、萃取压力20 MPa、萃取时间1.0 h,确定各因素的大致范围,实验结果如图2所示。

      图  2  单因素试验结果

      图2可得,在萃取温度,分离斧Ⅰ温度、萃取压力、萃取时间4个影响因素中,萃取温度、萃取压力、萃取时间3个因素对挥发油综合评分影响较大,而分离斧Ⅰ温度影响较小,故确定后续操作在分离斧Ⅰ温度为50 ℃的基础上,萃取温度选取50、55、60 ℃ 3个水平,萃取压力选20、25、30 MPa 3个水平,萃取时间选取2、3、4 h 3个水平进行正交试验。

    • 对单因素试验结果进行分析,确定以萃取温度、萃取压力、萃取时间为考察因素,采用 L9(34)正交试验法,优选最佳提取工艺条件。具体因素水平表见表2。试验设计及结果见表1,方差分析结果见表3,统计分析使用SPSS 22.0软件。

      表 2  正交因素试验水平表

      水平因素
      A.萃取温度(T/ ℃)B.萃取压力(P/MPa)C.萃取时间(t/h)
      150202.0
      255253.0
      360304.0

      表 3  方差分析结果

      方差来源方差平方和自由度均方FP
      A226.3662113.18337.819<0.05
      B206.4562103.22834.493<0.05
      C 6.9862 3.496 1.167>0.05
      D(误差) 5.9852 2.993
      F0.05(2,2)=19.0

      由极差分析可以得出影响所提药材综合评分的因素大小为A>B>C,即萃取温度>萃取压力>萃取时间,各因素水平的强弱顺序为:A2>A3>A1,B3>B2>B1,C3>C2>C1。同时方差分析结果表明因素A萃取温度和因素B萃取压力对于超临界所提挥发油的综合评分有显著性影响, 因素C萃取时间的3个水平相差不大,无显著影响。结合极差分析和方差分析结果,在综合考虑实际操作的前提下,为获得好的提取效果,确定因素A选择水平2,因素B选择水平3,因素C选择水平1,即本试验最佳提取工艺组合为A2B3C1,萃取温度为55 ℃,萃取压力为30 MPa,萃取时间为2 h。

    • 按比例称取3份同一批号的处方量药材,按照正交试验优选条件进行萃取,测定所得挥发油的萃取得率和每1.00 g萃取物中所含蛇床子素、异欧前胡素的含量,实验结果如表4所示。计算其相应结果得平均萃取得率为3.77%,RSD为1.56%,蛇床子素平均含量为27.41 mg/g,RSD为1.66%,异欧前胡素平均含量为12.69 mg/g,RSD为1.28%,表明正交试验所得萃取工艺条件稳定可行。

      表 4  3批中药材萃取得率和主要含量工艺验证试验结果

      批号萃取得率
      (%)
      蛇床子素含量(mg/g)异欧前胡素含量(mg/g)
      202107243.7027.8112.84
      202108013.8127.5012.73
      202108103.7926.9112.52
    • 本实验对甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%磷酸水作为流动相进行比较,结果显示乙腈洗脱能力较甲醇更好,出峰时间早且分离好,乙腈-水与乙腈-0.1%磷酸水相比得出的图无明显区别,表明调节洗脱液酸碱性对分离物质无太大影响,故流动相选择乙腈-水。波长选择为321 nm是因为在该波长处蛇床子素、异欧前胡素均有较好吸收。

    •   本次实验中选择蛇床子素、异欧前胡素为液相检测指标,其中蛇床子素具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗血小板凝聚等作用,是独活发挥其祛风除湿、通痹止痛功效的主要药效成分[11-12]。羌活具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌细胞增殖、抗血栓等作用,而异欧前胡素作为羌活的重要活性成分,故将其作为本次实验的考察指标[5]。同时未考察红花中活性成分是因为红花主要活性成分为羟基红花黄色素A,虽然其同样具有活血化瘀的药理作用,但其溶解性为水溶性,不在挥发油成分中。川芎的主要药效成分——阿魏酸,虽具有抗氧化、抑菌消炎、抗血栓的作用,但在经液相检测过程中发现挥发油中虽含阿魏酸,但其提取量过低且在阿魏酸出峰位置有其他物质干扰,经调节流动相比例和切换检测波长等方法未将其去除,故未将其列入检测指标范围内。

    • 常用的挥发油提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法等。水蒸气蒸馏法是指将药材用水浸泡后,采用直接加热蒸馏或通入水蒸气蒸馏,使挥发油与水共同蒸馏出来后收集馏液,冷却后分离油层的方法。超临界CO2萃取法是指应用CO2超临界流体提取植物的挥发油,该方法较水蒸气蒸馏法可以有效防止挥发油中易热解成分的破坏且可以提高产品质量和提高收率。

参考文献 (12)

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