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雷公藤为卫矛科雷公藤属植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.的干燥根，是一种公认的同时具有较强药效和较强毒性的中药材，广泛用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、系统性红斑狼疮等疾病[1]。但其毒性较大，不良反应高发且严重，常使患者不能耐受[2]。雷公藤的主要有效成分为二萜类、三萜类和生物碱类，研究表明各种成分均具有不同程度的抗炎、抗肿瘤和免疫抑制等活性[3-4]，其中生物碱的毒性要小于二萜和三萜类成分，临床应用具有疗效好，不良反应较小的特点[5]。雷公藤次碱是雷公藤生物碱中含量较高的一种倍半萜类单体化合物。目前研究显示其具有良好的杀虫活性，其他药理活性和机理研究较少，特别是抗炎和免疫抑制活性方面。
本研究主要通过建立脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症模型，探讨雷公藤次碱对LPS诱导的炎性因子NO，IL-1β，TNF-α和IL-6释放的影响，用免疫印迹法考察雷公藤次碱对TRAF6、IRAK、NF-κB、IκBα、JNK、ERK、p38等关键蛋白表达或磷酸化的影响，探讨其可能的抗炎作用机制，为促进雷公藤次碱的应用研究提供基础。
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雷公藤次碱（纯度98%，上海纯优生物科技有限公司）；DMEM细胞培养基、胎牛血清（Life Technologies GIBCO）；Griess试剂、细胞计数盒-8 (CCK-8)（上海碧云天生物技术有限公司）；脂多糖（LPS， Sigma-Aldrich）；IL-1β、TNF-α和IL-6检测试剂盒（达科为生物技术有限公司）；核质提取试剂盒（Dojindo Laboratories）；TRAF6、IRAF、p-IRAF、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65、β-actin、HRP山羊抗兔抗体（Cell Signaling Technology）；RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。
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RAW264.7细胞在含10％的新生小牛血清及100 U/ml青霉素、链霉素的DMEM高糖培养液中进行培养，培养条件为5％CO2、37 ℃，隔天换液，每日观察细胞的生长状况。实验时取对数生长期RAW264.7细胞，胰酶消化，加入新鲜培养基反复吹打成细胞混悬液，细胞增殖实验、细胞因子分泌含量测定调整细胞浓度为1×105 cells/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，细胞蛋白表达测定调整细胞浓度到2.25×105 cells/ml，以每孔2 ml接种于6孔细胞培养板中，然后细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。在药物处理前2 h给予LPS溶液（使其终浓度为1 μg/ml）诱导RAW264.7细胞发生炎症反应建立模型。设空白组（不给予LPS和药物处理）、模型组（给予LPS处理）、药物组（给予LPS诱导后再给予相应浓度的药物进行处理），每组设6个复孔(n=6)。
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设空白组和药物组，药物组分别给予终浓度为200、100、50和25 μmol/L的雷公藤次碱药液进行处理。细胞分别培养24和48 h，实验结束4 h前加入10 μl CCK-8试剂，结束后以酶标仪于450 nm处检测吸光度（A）。
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设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h后取出，吸取细胞上清液，Griess试剂法检测上清中NO光密度值，ELISA试剂盒检测上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的光密度值。
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设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h后取出，用4 ℃预冷的PBS液洗涤各孔两次，然后，吸弃PBS液，每孔中加入200 μl 4 ℃预冷的RIPA提取细胞蛋白，在13000 r/min下离心20 min，弃去上清，得各样本。用Bradford法对蛋白定量；使用细胞核/质提取试剂盒制备用于检测p65/NF-κB的胞质和核提取物。每孔加入20 μg蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到PVDF膜上，用BSA封闭2 h。分别用相应一抗4 ℃孵育过夜，然后用与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶1000）孵育2 h。最后用 ECL超敏发光液显影，于凝胶成像仪中曝光，使用 LAS成像软件对条带进行定量分析
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实验数据的统计分析用(
$ \bar x \pm s $ )表示，采用单因素方差分析法进行统计学处理。应用Alpha软件处理Western Blot实验所得目标带的光密度值，并以各自的β-actin蛋白条带灰度值与目标条带灰度值的比值作为蛋白相对表达水平值。 -
图1显示了不同浓度雷公藤次碱对RAW264.7细胞的细胞毒性作用。给予雷公藤次碱（25~200 μmol/L）孵育24 h后，200 μmol/L雷公藤次碱可显著抑制RAW264.7细胞活性；孵育48 h后，50、100和200 μmol/L雷公藤次碱均可显著抑制RAW264.7细胞的活性。
图 1 雷公藤次碱对RAW264.7细胞活力的影响
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为了进一步研究雷公藤次碱体外抗炎活性，检测了雷公藤次碱对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响。结果显示（图2），给予LPS刺激后的RAW264.7细胞，NO、IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子释放水平急剧增加（P<0.01），给予不同浓度雷公藤次碱（100、50和25 μmol/L）处理后，上述因子分泌水平呈剂量依赖性显著降低（P<0.01）。由此提示，雷公藤次碱的抗炎作用可能与抑制细胞释放NO、IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子有关。
图 2 雷公藤次碱对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响
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LPS是引发炎症的早期关键因素，可诱发多种细胞内信号事件，LPS-TLR4/MyD88信号通路可调节促炎基因表达，并控制炎症相关细胞因子的表达，其中IRAK及TRAF6是MyD88依赖性途径中的关键信号传导的分子。TLR4受体受LPS诱导后，可导致IRAK磷酸化从而脱离MyD88与TRAF6的结合体，使得游离的TRAF6活化后续信号转导途径[6]。为了评估雷公藤次碱对LPS激活TLR4/MyD88信号通路的影响，蛋白印迹法考察了雷公藤次碱对IRAK磷酸化和TRAF6表达的影响。结果显示（图3），与空白组相比，LPS刺激的模型组IRAK磷酸化和TRAF6表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比，雷公藤次碱各剂量组可显著抑制IRAK磷酸化和降低TRAF6表达（P<0.01）。
图 3 雷公藤次碱对TRAF6表达和IRAK磷酸化的表达的影响
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NF-κB是MyD88信号通路中重要的转录因子[7]。我们考察了雷公藤次碱对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB活化的潜在影响。如图4所示，RAW264.7细胞LPS刺激后，细胞核内NF-κB p65水平增高而细胞质内NF-κB p65水平降低，说明NF-κB p65活化后由细胞质进入到细胞核内，而给予雷公藤次碱处理后，细胞质内NF-κB p65水平增高而细胞核内NF-κB p65水平降低，说明雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著地阻止了NF-κB p65从细胞质转运到细胞核。 NF-κB p65易位进入核内与TLR4途径中的IκBα磷酸化有关。因此，我们考察了雷公藤次碱对NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化的影响。结果表明，雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著抑制LPS诱导的IκBα磷酸化和降解。
图 4 雷公藤次碱对IκBα磷酸化和NF-κB核转位的影响
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MAPKs是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。为了进一步研究雷公藤次碱是否调节MAPKs，考察了其对LPS诱导的RAW264.7细胞中ERK、p38和JNK等MAPKs磷酸化的影响。如图5所示，LPS暴露可显著促进RAW264.7细胞中ERK、JNK和p38的磷酸化。给予雷公藤次碱可以显著抑制LPS诱导的ERK、p38和JNK的磷酸化，但并未影响ERK、p38和JNK的表达。上述结果表明，MAPKs的磷酸化可能参与了雷公藤次碱对RAW264.7细胞中LPS刺激炎症的抑制作用。
图 5 雷公藤次碱对p38, ERK和JNK MAPKs磷酸化的影响
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雷公藤次碱是雷公藤的代表性生物碱成分之一，但是自从被分离以来，其生物学活性除了杀虫外，其他方面了解甚少[8]。本研究显示，雷公藤次碱对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型显示出显著的抗炎活性。雷公藤次碱可减少LPS刺激引起的NO、IL-1β、TNF-α及IL-6等促炎因子的产生，并抑制LPS诱导的TLR4/MyD88通路中信号传导的分子IRAK磷酸化及TRAF6表达，从而影响MAPKs和NF-κB的激活，如图6所示。
图 6 雷公藤次碱抗炎调控机制
已有证据显示，LPS可引发多种细胞内信号事件，包括导致TLR4，NF-κB及p38，ERK和JNK等丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）途径激活[9-10]。研究发现，LPS诱导后RAW264.7细胞Toll样受体4（TLR4）的表达明显增高，说明LPS是或可引导TLR4的配体与TLR4结合，二者结合后可启动细胞内一系列信号级联反应，最终诱导目的基因的表达。TLRs亚型中除TLR3外，均需要髓样分化因子88（MyD88）来激活下游释放信号分子的通路，这种途径成为MyD88依赖性途径。静息状态下，MyD88与IRAK及TRAF6形成细胞信号转导复合物，受到诱导后导致IRAK磷酸化，IRAK磷酸化后TRAF6从信号转导复合物中解离出来，TRAF6的活化可引起两条不同的信号转导途径，一条为MAPK家族（包括p38、JNK），另一条为活化MP3K（mitogen activated protein kinase kinase kinase）家族成员NIK（NF-κB inducing kinase），后者的磷酸化激活IκB激酶，导致IκB的磷酸化而使NF-κB/IκB复合物解离，NF-κB由此活化转位进入细胞核[11]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可以抑制IRAK磷酸化和TRAF6的表达。
NF-κB是一种多效性的转录因子，参与调控炎症反应、免疫、肿瘤等相关的细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎症介质等的转录过程。IκB是其抑制蛋白，正常情况下二者结合而使NF-κB处于失活状态，IκBα是IκB的亚分子，受到LPS刺激，IκBα磷酸化增加，从而导致游离NF-κB p65释放并从细胞质转移至细胞核，与DNA上的相应位点结合，导致特定靶基因（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的转录表达[12-13]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可抑制IκBα磷酸化，并以浓度依赖的方式阻止NF-κB p65由细胞质进入细胞核，从而阻止炎症相关因子的转录表达。
此外，NF-κB的易位也受ERK、p38和JNK等丝裂素活化蛋白激酶途径调节，该途径可控制炎症反应过程中细胞因子的合成和释放。丝裂素活化蛋白激酶激活后，细胞质或细胞核中的转录因子又被激活，从而触发引起生物学反应的靶基因的表达，包括促炎性介质的表达。本研究显示，LPS诱导的RAW264.7细胞中，雷公藤次碱可显著抑制ERK、JNK和p38的磷酸化。
Wilforine inhibits LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 cells by regulating the TLR4/MyD88/TRAF6 signaling pathway
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摘要:
目的 探讨雷公藤次碱抗炎活性及其作用机制。 方法 用细胞计数盒-8 (CCK-8)法考察雷公藤次碱对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7 增殖活性的影响，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测雷公藤次碱对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞分泌细胞因子一氧化氮（NO）、白细胞介素-1β（IL-1β）、 肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的影响，用免疫印迹法考察雷公藤次碱对白介素受体相关激酶（IRAK）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）、核因子κB抑制因子α（IκBα）、核因子κB（NF-κB p65）、分裂原激活的蛋白激酶p38（p38）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）在LPS刺激的RAW264.7细胞中的表达及其磷酸化的影响。 结果 雷公藤次碱在25、50、100 μmol/L浓度下对RAW264.7细胞无显著毒性，并可显著抑制细胞因子NO、IL-1β、TNF-α和IL-6含量。免疫印迹法检测结果显示雷公藤次碱可显著抑制IRAK及TRAF6的表达；显著抑制ERK、P38和JNK的磷酸化；抑制IκBα的降解，降低NF-κB p65的核转运水平。 结论 雷公藤次碱具有体外抗炎活性，其作用机制可能介导TLR4/MyD88/TRAF6信号通路。 Abstract:Objective To investigate the anti-inflammatory effect and mechanism of wilforine. Methods Anti-inflammatory activity of wilforine was investigated in LPS-induced RAW264.7 cells. The cytokines production of RAW264.7 cells was analyzed by ELISA assay and the cell viability was assessed by CCK-8 method. The expression of TRAF6, the phosphorylation of IRAK, p38, ERK and JNK, the degradation of inhibitory κBα (IκBα) and the nuclear translocation of NF-κB p65 were further investigated by western blot. Results Triptolide had no significant toxicity to RAW264.7 cells at concentrations of 25, 50 and 100 μmol/L. and could significantly inhibit the contents of cytokines NO, IL-1β, TNF-α and IL-6. Wilforine significantly decreased the expression of TRAF6 and phosphorylation of IRAK, and inhibited the phosphorylation of ERK, p38, and JNK and degradation of IκBα, and reduced the level of nuclear translocation of NF-κB p65. Conclusion The anti-inflammatory activity of wilforine of LPS-induced RAW264.7 cells is probably via TLR4/MyD88/TRAF6 signaling pathway. -
Key words:
- Tripterygium wilfordii /
- wilforine /
- anti-inflammation /
- TLR4 /
- MyD88 /
- NF-κB
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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一种重要的代谢产物，其参与许多生化过程，如能量代谢、基因表达调控、DNA修复等[1, 2]。人体皮肤、血液、肝脏、肌肉和大脑中的NAD+浓度会随着年龄的增长而降低，因此，增强NAD+可能在缓解相关的细胞功能和整体健康受损方面发挥关键作用[3]。烟酰胺单核苷酸（NMN）是NAD+生物合成的前体。体内外研究表明，补充NMN可以提高NAD+水平[4]。NMN可以缓解各种心脑血管疾病的发展，包括中风[5]、心力衰竭[6]和心肌缺血等[7]。此外，NMN还与改善线粒体功能和潜在的抗衰老益处有关[8]。几项临床试验探索了NMN补充剂的有效性和安全性（标识号：NCT04228640[9]，NCT04823260[10]，UMIN000036321[11]）[8]，证明了其对心血管保护的潜力。然而，NMN的研究仍然缺乏大规模可靠的人体试验数据，特别是关于其治疗高血压等特定疾病的疗效问题。虽然早期研究显示了一些有希望的结果，但需要更广泛的基础研究和临床试验来证实其在不同患者群体中的疗效和安全性。
高血压是一系列健康问题的重要危险因素，包括心脏、肾脏疾病以及中风等脑血管疾病[12]，影响着全世界数百万人[13]。高血压的危险在于，随着时间的推移会导致靶器官损伤，发生如动脉粥样硬化、肾功能衰竭、心力衰竭和中风等疾病。高血压的发生与衰老和肥胖等因素有关，而这两者都源自于NAD+缺乏。因此，NAD+已成为高血压的潜在治疗靶点。
目前关于NMN对高血压的影响研究相对有限。只有一项临床前实验表明NMN可以降低血管紧张素II（Ang II）诱导的高血压小鼠的血压[14]。另有一项临床研究表明，补充NMN可以降低高血压患者的血压（标识号：NCT04903210[14]）。然而，目前的证据不足以将NMN开发为抗高血压药物，特别是其缺乏较为全面的临床前药效评价。因此需要更严格的研究来确定NMN是否能作为高血压治疗药物。自发性高血压大鼠（SHR）是一种遗传性高血压模型动物，常用于评估抗高血压药物[15-17]。双肾双夹（2K2C）大鼠是一种实验性易卒中肾血管性高血压模型动物，这些大鼠在术后2周内100%发生高血压[15, 16]，也常用于评估抗高血压药物。本次研究中，我们采用单次胃瘘给药和长期药物饲料喂养方式给予受试大鼠NMN治疗，观察NMN对原发性和继发性高血压大鼠模型的血压和器官损伤的影响。此外，我们还观察了终身给药NMN对2K2C大鼠模型死亡率和寿命的影响[15]。
1. 材料与方法
1.1 实验动物
Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（160~180 g）购于上海必凯科翼生物科技有限公司。2K2C大鼠由SD大鼠双侧肾动脉嵌套0.2 mm内径的U型银夹制作而成。雄性SHR（250~290 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
所有大鼠均饲养于独立通气笼盒（IVC）系统中，饲养温度为24±2°C，相对湿度为40%~60%，照明时间为8:00~20:00，自由饮食和饮水（特定情况除外）。本实验研究严格遵守实验动物福利等伦理原则。
1.2 实验试剂和仪器
NMN（批号2021046B）由尚科生物医药（上海）有限公司提供，氯沙坦钾（Losartan）（批号LOSB-4-06210326）由浙江美诺华药业股份有限公司提供，戊巴比妥钠购于德国Merck公司，注射用青霉素钠购于山东鲁抗医药股份有限公司，肝素钠（批号H3v60）购于上海博光生物科技有限公司，EVG弹力纤维染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。
U型银夹（0.2 mm内径）、血压与心率分析系统（型号MPA-HBBS）购于上海奥尔科特生物科技有限公司，聚乙烯导管购于法国Biotrol公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组和治疗方案
NMN单次给药治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（蒸馏水）和NMN给药组（200 mg/kg），并通过胃瘘导管给药。
NMN长期给药（4周）治疗研究：包括SHR和2K2C大鼠两种模型，在各自模型实验中，大鼠均被随机分配为对照组（普通饲料）和NMN给药组[药物饲料，等效NMN剂量200 mg/（kg·d）]。
生存时间观察研究：采用2K2C大鼠模型，实验包括假手术组（正常SD大鼠，普通饲料）和2K2C造模组，2K2C造模组大鼠再被随机分为模型组（普通饲料）、氯沙坦给药组[药物饲料，等效剂量20 mg/（kg·d）]和NMN给药组[药物饲料，等效剂量200 mg/（kg·d）]。
1.3.2 2K2C大鼠模型制备
2K2C模型是通过在正常SD大鼠的两个肾动脉上放置0.2 mm尺寸的银夹后造成的高血压模型，参考本教研室文献及方案[16,17]。简言之，SD大鼠用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹部切口，轻轻翻转肾脏，游离出肾动脉后放上内径为0.2 mm的U形银夹。在另一侧肾脏重复相同步骤。小心复位肾脏和周围组织。假手术的大鼠进行相同的操作至游离血管步骤，但不放置U形银夹。以上步骤完成后，滴加青霉素，缝合。然后将大鼠放在电热毯上，苏醒后送回IVC系统笼。
1.3.3 胃瘘给药操作方法
用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，腹部区域脱毛并消毒，自剑突下沿腹部中间切口2 cm，使用无菌棉签将胃轻轻拉出，于近幽门段并且避开血管作荷包预缝合，预留区域内戳出小孔，迅速将胃瘘导管缠有胶布端插入胃内，拉紧预缝合线固定导管，经背部皮下牵引至颈后穿出并固定。随后，将胃瘘导管以大鼠马甲方式固定于背部防止动物清醒后抓咬。手术完成后，动物于电热毯上保温至复苏。
1.3.4 清醒自由活动测量血压
参考本教研室文献及方案[15, 16]，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，左侧腹股沟区域脱毛并消毒，并沿股动脉方向切开皮肤，暴露股动脉。游离出一段股动脉，插入特制的PE测压导管，导管前端依次穿行过股动脉、髂总动脉并最后进入腹主动脉，此时测得血压为腹主动脉血压，导管的另一端沿皮下穿行至颈部背侧皮肤后穿出，用自制马甲固定，缝合伤口。术后，大鼠饲养于测量系统笼里适应环境，自由饮食和饮水。24 h后，测压导管连接压力传感器，经MPA-HBBS数据分析系统处理后将压力信号转化为血压波形显示在电脑屏幕上。同时以0.3 ml/h的速率连续输注25 U/ml肝素钠，以防止测压过程中凝血。
NMN单次给药实验中，大鼠股动脉插管手术后次日上午9:00开启测量系统，连续记录血压和心率信号。12:00，通过胃管给予相应的药物（NMN或蒸馏水）。连续记录24 h血压和心率变化（取给药前1 h的数据作为基础血压和心率）。NMN长期给药实验中，NMN给药组和对照组的大鼠同样使用上述方法进行血压和心率测量，并连续记录2 h。
1.3.5 器官大体形态学和病理形态学分析
在完成血压和心率测量后，大鼠再次麻醉并迅速打开胸腔，用4 ℃预冷的生理盐水对大鼠进行心脏灌注。取出脑、肝脏、心脏、肾脏和主动脉（从左锁骨下动脉分支到横膈膜段），测量器官重量，以及主动脉长度、左心室壁厚度、肾皮质和髓质厚度。随后，将脑、心脏、主动脉、和肾脏用4%多聚甲醛固定，并进行病理形态学分析，包括EVG、苏木素-伊红（HE）和Masson染色[18]。
1.3.6 统计学分析
所有实验数据均以“均值±标准误（mean±SEM）”表示。使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析。使用非配对Student-t检验进行组间比较，生存曲线使用Log-rank检验分析。以P<0.05为具有统计学差异。
2. 结果
2.1 单次NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
SHR是一种原发性高血压大鼠模型，单次给予200 mg/kg NMN后，2 h内，NMN给药组和溶剂对照组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率没有显著差异（图1：A-D）。对NMN给药后2 h和24 h内的区间血压进行测量分析，两组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均值也没有显著差异（图1：E-H）。
图 1 单次NMN治疗对SHR的血压、心率及靶器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的动态测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮质与髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图高血压还可导致心室肥大、主动脉增厚、肾脏皮质萎缩等靶器官损伤。进一步比较两组大鼠的器官损伤程度，与溶剂对照组相比，NMN给药组的脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的器官相对重量没有显著变化（图1：I）。同时，两组在主动脉重量与长度比、左心室壁厚度和肾皮质与髓质厚度比方面也没有显著差异（图1：J-L）。
对脑血管进行EVG染色，两组大鼠的弹力纤维均清晰、完整，没有发生显著的病理损伤；对心脏进行Masson染色，也没有发现NMN可以改善血管周围的胶原纤维分布；对主动脉和肾脏进行HE染色，同样没有发现NMN减轻主动脉厚度或改善肾小球萎缩等病变（图1：M）。这些结果表明，在SHR模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面没有治疗作用。
2.2 长期NMN治疗未降低SHR的血压和器官损伤程度
高血压是一种慢性疾病，进一步在SHR模型上长期给予NMN药物饲料喂养4周，等效剂量为200 mg/（kg·d），以评估其对血压和器官损伤的影响。与对照组相比，长期NMN药物饲料治疗组的大鼠体重没有显著变化，但第4周时，NMN给药组大鼠的进食量显著增加（图2：A-B）。NMN药物饲料喂养4周后，对照组和NMN给药组的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率均没有显著差异（图2：C-F）。
比较两组大鼠的器官损伤程度，与NMN单次给药治疗的结果相似，NMN药物饲料治疗4周依然没有显著的靶器官保护作用（图2：G-K）。这些结果表明，在SHR模型中，NMN长期给药也没有降低血压或器官保护作用。
2.3 单次NMN治疗未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
2K2C大鼠模型是继发性高血压的实验室模型，通过2K2C手术造模后，大鼠血压明显升高[16]，进一步研究了在2K2C大鼠模型中单次给药200 mg/kg NMN的治疗效果。与SHR模型中观察到的结果一致，与对照组相比，单次给药NMN后2 h或24 h内对血压和心率没有影响（图3：A-H）。2K2C大鼠单次服用NMN后，脑、心脏、肾脏和主动脉等组织的形态学评估和病理染色也没有显示出任何器官保护作用（图3：I-M）。这些结果表明，在2K2C模型中，单次给药NMN对血压或器官保护方面也没有显著影响。
图 3 单次NMN治疗对2K2C大鼠的血压、心率和器官损伤的影响（n=5）A-D. 单次给药后2 h内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率的实时测量值；E-H. 单次给药前和给药后2、24 h区间内的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率平均值；I. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；J. 主动脉重量与长度比；K. 左心室壁厚度；L. 肾皮髓质厚度比；M. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图2.4 长期NMN未降低2K2C大鼠的血压和器官损伤程度
在2K2C模型中长期给予NMN 200 mg/（kg·d），与对照组相比，长期NMN治疗组的体重没有显著变化，尽管第4周的进食量明显减少（图4：A-B）。连续给予NMN 4周后，测量两组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压或心率，没有观察到显著差异（图4：C-F）。形态学评估，包括脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；主动脉重量与长度比；左心室壁厚度、和肾皮质与髓质厚度比；结合EVG、Masson和HE染色，两组之间没有显著差异（图4：G-K）。这些结果表明，在2K2C模型中，长期给药NMN对血压或器官保护也没有显著影响。
图 4 长期NMN治疗对2K2C大鼠的血压和心率的影响（n=5）A.体重；B. 进食量；C-F. 长期给药4周后的收缩压、舒张压、平均动脉压和心率；G. 脑、肝、肾、心脏、心室、左心室和主动脉的相对器官重量；H. 主动脉重量与长度比；I. 左心室壁厚度；J. 肾皮髓质厚度比；K. 脑血管EVG染色、心脏Masson染色、主动脉和肾脏HE染色的代表图*P<0.05，NMN给药组与对照组比较。2.5 长期NMN治疗未延长2K2C大鼠的存活时间
NMN在多种病理生理过程中起着重要作用[10]。进一步考察终身服用NMN是否可以延长2K2C高血压大鼠的存活时间。治疗期间，各组大鼠的体重或进食量没有显著差异（图5：A-B）。与假手术组相比，2K2C模型大鼠的存活时间显著减少，经氯沙坦治疗后，2K2C大鼠的存活时间显著延长。而NMN治疗的2K2C大鼠生存曲线与模型组没有显著差异（图5C）。以上结果表明，在2K2C模型中，NMN没有延长高血压大鼠存活时间的作用。
图 5 长期NMN治疗对2K2C大鼠存活时间的影响（n=25~27）A. 体重；B. 进食量；C. 生存曲线***P<0.001，与假手术组比较；###P<0.001，与模型组比较；▲▲P<0.01，NMN给药组与氯沙坦给药组比较，C图中均使用Log-rank检验方法。3. 讨论
本研究使用两种成熟的高血压大鼠模型：SHR和2K2C大鼠模型，探讨了NMN对高血压的可能影响。研究结果表明，在上述模型中，单次或长期NMN治疗均未显示出显著的抗高血压和保护器官损伤作用，也没有延长生存时间的作用。
高血压对健康存在重大威胁，会导致严重的并发症，如心脏疾病、中风和慢性肾病等。抗高血压治疗在高血压的管理中至关重要。氯沙坦是一种经典的抗高血压药物，能够特异性拮抗血管紧张素II的AT1型受体，并在2K2C和易卒中自发性高血压大鼠（SHR-SP）模型中被证明存在降低血压，减轻器官损伤，延长存活时间的作用[15, 19]。因此，我们选择氯沙坦作为阳性对照药物，它显著延长了高血压大鼠的存活时间。相比之下，NMN并没有延长高血压大鼠的存活时间。此外，在2K2C大鼠和SHR模型中，无论是单次治疗还是长期治疗，NMN对高血压和器官损伤都没有影响。
在最近的一项研究中，在AngⅡ诱导的高血压小鼠模型中证明了NMN有抗高血压和器官保护作用[14]。有几个因素可能导致我们的发现与该团队的发现之间存在差异，如动物模型、给药方案、NMN给药时间和血压测量方法的变化，特别是所用模型之间的差异，SHR和2K2C大鼠模型更广泛地用于评估抗高血压药物的效果。我们使用了与该团队近似的药物剂量进行单次和长期给药来评估NMN药效，但该团队只研究了长期给药。此外，实验动物的血压测量方法可能是观察到结果差异的重要原因。在本研究中，我们采用更为准确的清醒自由活动大鼠血压测定方法，而该团队采用了非侵入性尾套法。总的来说，我们直接评估了NMN对SHR和2K2C大鼠经典高血压模型中高血压和器官损伤的影响，发现NMN对高血压大鼠的血压和器官损伤没有治疗作用。
同时，氯沙坦的降血压作用已多次被我们证实，例如，在2K2C模型上，长期给药氯沙坦4周，收缩压降低约40 mmHg[15]，并且氯沙坦的降压作用被国内外广泛证明。因此研究NMN治疗对血压的影响实验中，不设氯沙坦阳性药对照组。而前期我们未证明过氯沙坦对大鼠寿命的影响，因此选择氯沙坦作为阳性对照药物，发现它显著延长了高血压大鼠的存活时间。
关于文中NMN剂量的选择，目前，NMN在各种人群中通常用作营养保健品，剂量范围为50~150 mg/d[20]。小鼠常用NMN剂量为300 mg/kg，对应大鼠剂量约为200 mg/kg，对应人（70 kg）剂量为33 mg/kg；临床试验剂量最大一般设为900 mg/d[21]，因此，上述剂量已是较大剂量，若再尝试加大剂量没有实际应用价值，故未设计再高剂量组。
综上，本研究评估了单次和长期NMN治疗对SHR和2K2C大鼠模型中高血压和器官损伤的影响。结果表明，NMN对高血压大鼠的血压、器官损伤和寿命均没有影响，这些发现为NMN的未来临床研究提供了有价值的见解和参考。
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图 2 雷公藤次碱对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响
A. NO光密度值；B. IL-1β光密度值；C. TNF-α光密度值；D. IL-6光密度值*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与空白组比较
图 3 雷公藤次碱对TRAF6表达和IRAK磷酸化的表达的影响
A. TRAF6磷酸化；B. IRAK磷酸化*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与空白组比较
图 4 雷公藤次碱对IκBα磷酸化和NF-κB核转位的影响
A. 细胞质NF-κB p65含量；B. 细胞核NF-κB p65含量；C. IκBα磷酸化*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与空白组比较
图 5 雷公藤次碱对p38, ERK和JNK MAPKs磷酸化的影响
A. JNK磷酸化；B. p38磷酸化；C. ERK磷酸化*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与空白组比较
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[1] 白雪, 付瑞嘉, 乐世俊, 等. 雷公藤治疗类风湿性关节炎研究进展[J]. 中草药, 2020, 51(1):265-275. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2020.01.034 [2] 姚骥如, 孙莹, 罗顺葵, 等. 雷公藤多苷的临床应用进展[J]. 中国新药与临床杂志, 2010, 29(3):179-182. [3] 胡攀勇, 李振麟, 濮社班, 等. 雷公藤研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2013, 32(2):1-3,7. doi: 10.3969/j.issn.1006-9690.2013.02.001 [4] ZHANG Y Q, XU W, LI H, et al. Therapeutic effects of total alkaloids of Tripterygium wilfordii Hook f. on collagen-induced arthritis in rats[J]. J Ethnopharmacol,2013,145(3):699-705. doi: 10.1016/j.jep.2012.11.018 [5] 刘莉, 闫君, 舒积成, 等. 雷公藤生物碱类成分及其药理活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2019, 31(12):2170-2181. doi: 10.16333/j.1001-6880.2019.12.022 [6] LI T, LI F, LIU X Y, et al. Synergistic anti-inflammatory effects of quercetin and catechin via inhibiting activation of TLR4-MyD88-mediated NF-κB and MAPK signaling pathways[J]. Phytother Res,2019,33(3):756-767. doi: 10.1002/ptr.6268 [7] 鲍璐璐, 崔立红. TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的研究进展[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2019, 28(5):568-572. doi: 10.3969/j.issn.1006-5709.2019.05.019 [8] 师宝君, 姬志勤, 张继文, 等. 昆明山海棠的杀虫活性及有效成分[J]. 昆虫学报, 2007, 50(8):795-800. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.2007.08.007 [9] LAI J L, LIU Y H, LIU C, et al. Indirubin inhibits LPS-induced inflammation via TLR4 abrogation mediated by the NF-kB and MAPK signaling pathways[J]. Inflammation,2017,40(1):1-12. doi: 10.1007/s10753-016-0447-7 [10] LIU F, SUN G Q, GAO H Y, et al. Angelicin regulates LPS-induced inflammation via inhibiting MAPK/NF-κB pathways[J]. J Surg Res,2013,185(1):300-309. doi: 10.1016/j.jss.2013.05.083 [11] 单佳铃, 程虹毓, 文乐, 等. TLR/MyD 88/NF-κB信号通路参与不同疾病作用机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(4):451-455. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2019.04.002 [12] 崔嵩, 刘学锋, 吴斌. NF-кB在肿瘤中的研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2009, 17(1): 134-137. 范慧婕, 谭章斌, 赵晓山, 等. 四逆散通过MAPKs/NF-κB途径保护脂多糖致Raw264.7的细胞炎症[J]. 暨南大学学报(自然科学与医学版), 2019, 40(1): 10-18. [13] KAMINSKA B. MAPK signalling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy: from molecular mechanisms to therapeutic benefits[J]. Biochim Biophys Acta,2005,1754(1-2):253-262. doi: 10.1016/j.bbapap.2005.08.017 -
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