Effect and mechanism of dabrafenib combined with tremelimumab on melanoma

DAB（批号：HY-14660)、TREM（批号：HY-B0380）（美国MCE公司）；胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）；胰蛋白酶、青霉素-链霉素（上海索莱宝公司）；CCK-8、ROS、SOD和MDA检测试剂盒（上海碧云天生物科技公司）；乳酸脱氢酶（LDH）、ATP检测试剂盒（南京建成生物科技公司）；抗PCNA的抗体（武汉三鹰生物科技公司）；荧光过氧化物酶 FITC 标记的二抗（美国Thermo Fisher Scientific公司）；酶标仪（型号：Multiskan skyHigh，Thermo Fisherg公司）；倒置显微镜（型号：DMi1，Leica公司）；分光光度计（型号：Genesys 10S UV-Vis，Thermo Scientific公司）。

A375细胞（具有BRAF突变的黑色素瘤细胞系,上海富衡生物科技有限公司）；BALB/c Nude雄性裸鼠，4~5周龄[实验动物生产许可证号：SYXK（渝）2024-0001，重庆吉立辉生物科技有限公司]。

选择A375细胞作为研究对象，使用含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中。每隔2 d更换一次培养液，待细胞生长至 80%～90%时，使用0.25%胰蛋白酶进行传代。

采用CCK-8法测定DAB联合TREM对A375细胞生长活力的影响。取对数生长期的A375细胞，以1.0×10⁴个/孔接种至96孔板中。培养24 h后，分别加入DAB（1 μmol/L）、TREM（5 μg/ml）和DAB（1 μmol/L）+TREM（5 μg/ml），同时设置空白组和溶剂对照组（0.1% DMSO）。药物处理24 h后，将原培养基换成新鲜培养基，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续孵育1 h。孵育结束后，使用酶标仪在450 nm处测定各组的吸光度（A值），并计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验组平均A值–空白组平均A值）/（溶剂对照组平均A值–空白组平均A值）。

采用测定LDH活性法评估药物对A375细胞的细胞毒性作用。细胞分组及处理过程同1.4项，药物处理后，收集每孔的培养基，加入LDH反应液，孵育1 h后，使用酶标仪于490 nm处测定A值。根据A值计算细胞死亡率，使用溶剂对照组和最大释放组作为参考，最终得出不同药物处理组的细胞毒性情况。

将对数生长期的A375细胞（1.0×10⁵个/孔）接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至整个底部时，使用200 μl无菌移液枪枪头在板表面划出一条等宽的线，用PBS洗涤2次去除划痕区域的细胞碎片。分别加入DAB（1 μmol/L）、TREM（5 μg/ml）和DAB（1 μmol/L）+TREM（5 μg/ml），并设置溶剂对照组，继续培养24 h。在划痕后0、24 h于倒置显微镜下观察并拍摄划痕区域，使用Image J软件定量分析划痕宽度的变化，并计算划痕愈合率：划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度–24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

取对数生长期的A375细胞，以1.0×10⁴个/孔接种至96孔板中，培养24 h。分别加入DAB（1 μmol/L）、TREM（5 μg/ml）和DAB（1 μmol/L）+TREM（5 μg/ml）进行处理，并设置溶剂对照组。药物处理2 h后，加入DCFH-DA探针溶液（10 μmol/L），孵育30～60 min，使细胞摄取并与细胞内的ROS反应，生成具有荧光特性的DCF产物。用PBS溶液洗涤3次后，加入适量PBS，使用酶标仪在530 nm波长处测定每孔的荧光强度。

取对数生长期的A375细胞，以1.0×10⁵个/孔接种至6孔板中，培养24 h。分别加入DAB（1 μmol/L）、TREM（5 μmol/L）和DAB（1 μmol/L）+TREM（5 μg/ml）进行处理，并设置溶剂对照组。药物处理24 h后，使用细胞裂解液将细胞裂解。

收集各组处理后的A375细胞裂解液，并转移至96孔板中，加入适量的ATP检测试剂，反应完成后，通过酶标仪测定每孔的吸光度值，并计算各组样品中ATP水平。

分别取50 μl各组处理后的A375细胞裂解液到新的离心管中，加入适量的硫代巴比妥酸（TBA）试剂。将试剂和样本混合后，放入95℃的水浴中加热0.5 h，在此过程中，MDA与TBA反应生成红色的复合物。反应结束后，将样本从水浴中取出，冷却至室温，10 000 r/min 离心5 min，去除可能存在的沉淀。最后，使用分光光度计在532 nm处测定样本的吸光度，根据标准曲线计算样品中MDA水平。

收集各组处理后的A375细胞裂解液，并转移至96孔板中，加入适量的SOD底物溶液。反应完成后，使用酶标仪在450 nm处测定每孔的吸光度，计算各组样品中SOD水平。

收集对数生长期的A375细胞，用PBS重悬细胞，加入等量Matrigel基质胶，调整细胞密度（1.0×10⁷个/ml），混匀后置于冰上。将100 μl细胞悬液注射于裸鼠右侧腋窝皮下，1周后，在裸鼠皮下可见实体瘤形成。当肿瘤长至100 mm³（肿瘤体积=1/2×长径×短径²）时，将裸鼠随机分为DAB （30 mg/kg）组、TREM（10 μg/kg）组、DAB（30 mg/kg）+TREM（10 μg/kg）组和溶剂对照组（含5% DMSO及20% PEG₄₀₀的生理盐水），每组6只，每2 d尾静脉注射给药1次，共给药21 d。21 d后脱颈处死裸鼠，剥离肿瘤组织并称量肿瘤质量。

将剥离的肿瘤组织经4%多聚甲醛固定24 h后，进行石蜡包埋，切片厚度为4 μm。切片经二甲苯脱蜡 2 次，每次 5~10 min，依次经无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇及蒸馏水梯度水化。滴加 20 μg/ml无 DNA 酶污染的蛋白酶K，37℃孵育 20 min 进行抗原修复，PBS冲洗3次。对于TUNEL实验，使用TUNEL试剂盒按照说明书操作。具体步骤为：切片经过PBS洗涤后，加入TUNEL反应试剂，于37℃孵育60 min，加入核染色剂后继续孵育5 min。染色后，使用显微镜观察细胞凋亡信号的标记，TUNEL阳性细胞核呈棕黄色，非凋亡细胞核呈蓝色，并计算TUNEL阳性率：阳性率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%，以定量评估细胞凋亡。对于PCNA免疫组化，切片经过脱蜡、水合后，采用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，随后加入针对PCNA的特异性一抗，4℃孵育过夜。次日，加入二抗，室温下孵育1 h，最后使用DAB显色试剂盒显色，并用苏木素复染。切片脱水后封片，通过显微镜观察PCNA阳性细胞（细胞核出现棕黄色颗粒沉着）的分布与表达，并计算PCNA阳性率：阳性率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%，以定量评估细胞增殖。

数据统计和分析均采用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0 软件进行，数据以（$\bar x $±s）表示。采用Student’s t test 和单因素方差分析进行组间差异的比较，P<0.05说明差异具有统计学意义。

采用CCK8法检测单独给药及DAB联合TREM对A375细胞生长活力的影响。结果如图1A所示，与对照组相比，单独给药组及联合给药组的细胞存活率均显著降低，提示DAB和TREM对A375细胞均具有细胞增殖抑制作用；且与单药组相比，联合给药组的细胞存活率显著降低，分别为（75.76±0.79）%、（69.64±8.34）%和（55.88±3.01）%，提示这两种药物可能通过协同作用增强治疗效果。

为了进一步检测各组对A375细胞的毒性作用，采用测定生长介质中由受损细胞释放的LDH活性的方法。结果如图1B所示，与对照组相比，单独给药组及联合给药组的细胞毒性均显著提高，表明这两种单药对A375细胞具有一定的毒性作用；DAB联合TREM组的细胞毒性显著高于单独给药组，分别为（31.24±0.82）%、（35.93±4.43）%和（50.00±3.83）%，提示联合给药对A375细胞的毒性效果更为显著。

为了评估各组对A375细胞迁移能力及细胞愈合抑制作用，进行了细胞划痕实验。结果如图2A所示，0 h时所有组的A375细胞表面均可观察到明显的划痕，且细胞状态差异不大。经过24 h处理后，对照组的细胞成功愈合了大部分划痕，愈合速度较快。相比之下，DAB、TREM和DAB联合TREM组的细胞愈合速度较慢，其中，联合给药组的愈合速度最慢，表现出明显的愈合抑制作用。通过量化划痕愈合率，如图2B所示，与对照组相比，单独给药组未显示显著性差异，愈合率分别为（41.95±4.76）%、（32.35±2.22）%和（32.28±5.40）%；联合给药组的愈合率为（16.25±2.68）%，与其他组相比显著降低，提示联合给药在细胞迁移和愈合过程中产生了较强的抑制作用。

结果如图3A所示，与对照组相比，单独给药组的ROS水平有所增加，但差异不显著；而DAB联合TREM组的ROS水平较对照组及单独给药组显著增高，提示联合用药可能通过促进肿瘤细胞内ROS的积累及氧化应激反应而增强抗肿瘤作用。

如图3B所示，与对照组相比，单独给药组及联合给药组的ATP水平均显著降低，且联合用药组的ATP水平显著低于单独给药组。结果表明，DAB联合TREM可能通过抑制细胞的能量代谢而增强抗肿瘤作用。

MDA含量测定可评价脂质过氧化水平，SOD活性测定反映细胞抗氧化能力。如图4所示，在MDA和SOD水平测定中，单独给药组及联合给药组的MDA和SOD水平较对照组均显著降低；且联合给药组的MDA和SOD水平显著低于单独给药组，提示DAB联合TREM可能通过增强氧化应激反应，降低细胞抗氧化能力，从而增强抗肿瘤效果。

通过在裸鼠皮下注射A375黑色素瘤细胞建立了皮下移植瘤模型。结果如图5所示，与对照组相比，单独给药组及DAB联合TREM组均显著抑制了肿瘤生长，肿瘤质量分别为（0.62±0.12） g、（0.47±0.07） g、（0.43±0.06） g和（0.29±0.09） g；且联合给药组的肿瘤质量较单独给药组显著降低，证实DAB联合TREM能有效抑制体内黑色素瘤的生长，具有更强的抗肿瘤效果。

采用TUNEL凋亡染色法评价各组肿瘤组织细胞凋亡情况。结果如图6A和6B所示，与对照组相比，单独给药组的TUNEL阳性率有所提高，分别为（17.11±7.83）%、（25.94±2.59）%和（26.72±5.17）%，但差异并不显著；联合给药组的阳性率为（40.91±2.34）%，显著高于其他组，表明DAB与TREM联合应用时显著提高肿瘤细胞的凋亡率。

通过检测肿瘤组织内PCNA蛋白的表达，评价各组肿瘤组织细胞增殖情况。结果如图6A和6B所示，与对照组相比，单独给药组及联合给药组的PCNA阳性率均降低，分别为（83.091±11.00）%、（63.31±1.31）%、（68.00±3.25）%和（47.05±8.48）%。其中，联合给药组的PCNA阳性率降低最显著，提示DAB联合TREM显著抑制细胞增殖。综上，DAB联合TREM可能通过增强细胞凋亡及抑制细胞增殖而发挥更强的抗肿瘤效果。

黑色素瘤作为一种侵袭性极强的皮肤恶性肿瘤，严重威胁人类健康。目前单一治疗手段（如达拉非尼、曲美布单抗）存在疗效有限、易耐药等问题，而联合治疗可通过多靶点干预，成为黑色素瘤治疗研究的热点。

氧化应激与能量代谢在黑色素瘤发生、发展、转移及耐药过程中发挥关键作用。氧化应激是细胞内ROS产生与抗氧化防御失衡的状态。调节氧化应激的治疗策略主要有：①促氧化治疗：通过进一步升高肿瘤细胞内 ROS 水平，突破其耐受阈值，诱导细胞死亡。②抑制抗氧化防御：削弱黑色素瘤细胞的抗氧化能力，使其对氧化损伤更敏感。正常细胞主要依赖线粒体氧化磷酸化高效生成 ATP，满足生理需求。而黑色素瘤细胞则呈现出显著的ATP代谢重编程。调节能量代谢疗法的核心，在于精准干预黑色素瘤细胞异常的能量代谢模式，切断其“能量供应”，从而抑制肿瘤生长与扩散。调节能量代谢的治疗策略主要有靶向糖酵解途径、干预线粒体代谢和调控氨基酸与脂质代谢等途径。近年来，研究发现联合治疗可通过协同调节这两大生理过程，提高黑色素瘤治疗效果。

本研究表明，DAB联合TREM显著抑制黑色素瘤细胞活力与细胞迁移能力，并增强细胞毒性作用；显著提高ROS水平，降低MDA、SOD和ATP水平；有效抑制荷瘤裸鼠体内肿瘤生长，提高肿瘤组织细胞凋亡率且抑制细胞增殖，证实联合用药可能通过增强氧化应激、抑制能量代谢和促进细胞凋亡的作用机制提高黑色素瘤治疗效果。这些发现表明，DAB联合TREM能够克服单一药物的局限性，为黑色素瘤提供一种新的治疗策略。然而，未来的研究应进一步探索其分子作用机制，并评估其临床应用的安全性和长期疗效。