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川芎Rhizoma Chuanxiong为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎[1]，最早记载于《神农本草经》，有活血行气，祛风止痛的功效，是中医临床上最常用的药材之一，在活血化瘀类成方制剂中占有重要地位。
现代药理学表明，川芎含有多种药理活性成分，主要包括苯酞类化合物（如藁本内酯）、酚类和有机酸类（如阿魏酸）、生物碱类（如川芎嗪）、多糖类等，其中苯酞类化合物广泛的应用于治疗心脑血管系统和神经系统疾病，主要成分存在于川芎挥发油中，其含量占挥发油总质量的80%以上。川芎挥发油除含有苯酞类化合物，还含有烯萜醇、脂肪酸类化合物，近年来随制剂工艺的发展，川芎药材以挥发油入药已经比较常见，在制剂工艺方面，不同的提取工艺获得的川芎挥发油含量与成分不同，药效也会有差异[2-8]。川芎挥发油的常见提取方法主要有经典的水蒸气蒸馏法和近年来快速发展的超临界流体萃取技术(supercritical fluid extracation, SFE)，本研究分别采用水蒸气蒸馏法和超临界CO2萃取法两种常用工艺对川芎药材中挥发油类成分进行提取，并对提取成分进行比较，旨在为不同药效中药制剂中川芎有效成分的提取工艺研究提供参考。
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川芎药材（都江堰市伦洋中药材种植农民专业合作社，批号：Z02031-190201）；乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA试剂有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；CO2为医用级；水为重蒸馏水。
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WF-20B高速万能粉碎机（江阴市海鑫药化机械制造有限公司）；HA420-40-96型超临界萃取装置（南通市华安超临界萃取有限公司）；挥发油测定器（天长市天沪分析仪器有限公司）；智能数显加热套（上海豫康科教仪器设备有限公司）；Thermo Fisher ITQ1100气相色谱-质谱联用仪（美国赛默飞世尔公司）。
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取川芎药材粉碎品（过一号筛）200 g，置5 000 ml圆底烧瓶中，加入2 000 ml蒸馏水、少许碎瓷片，充分混匀后于室温浸泡2 h，按《中国药典》2015版四部通则2204挥发油测定法甲法进行。提取完成后分取油层，无水硫酸钠干燥离心，转移挥发油置棕色瓶中密封，4 ℃保存。
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取川芎药材粉碎品（过一号筛）1 000 g，置萃取釜中，萃取条件为：萃取压力35 MPa，流体温度40 ℃，萃取1.5 h。萃取完成后从出料口放出挥发油，转移挥发油置棕色瓶中密封，4 ℃保存。
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InertCap 5MS/NP熔融石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气氦气；程序升温，初始温度60 ℃，保持1 min，5 ℃/min升温至100 ℃，3 ℃/min升温至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min升温至280 ℃，保持2 min；进样口温度280 ℃；分流比30:1；传输线温度280 ℃；进样量1.0 μl，体积流量1.0 ml/min；离子源温度220 ℃；溶剂延迟4 min；EI源电离方式；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 50-400；质谱检索数据库NIST 11。
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精密移取挥发油提取物样品25 μl置于25 ml量瓶中，加入乙酸乙酯至刻度，摇匀，作为供试品溶液，吸取1.0 μl注入GC-MS联用仪进行分析。
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按照水蒸气蒸馏和超临界CO2萃取法提取挥发油后，根据得油量和药材量计算两种提取方法的挥发油得率分别为0.35%和4.8%。
采用GC-MS联用技术对两种提取工艺所得的挥发油提取物进行分析，利用质谱检索数据库和相关文献资料[9-12]，对挥发油中相对含量较大，与相邻峰分离度良好的主要色谱峰进行了分析，确定了18个主要成分，其峰面积总和占总峰面积的95%以上，结果见表1和图1、2。水蒸气蒸馏提取物中苯酞类成分约占61%，单萜类成分约占25%，倍半萜类成分约占10%；超临界CO2萃取物中苯酞类成分约占97%，单萜类成分约占1%，倍半萜类成分约占0.4%。两种提取工艺的挥发油中Z-藁本内酯含量最高，其次是洋川芎内酯A、丁烯基苯酞和丁基苯酞。
表 1 川芎挥发油化学成分
序号 TR/min 化合物 分子式 相对含量（%） 水蒸气蒸馏 超临界CO2萃取 1 5.66 α-蒎烯 C10H16 1.48 0.09 2 6.52 β-蒎烯 C10H16 5.70 0.30 3 7.71 邻伞花烃 C10H14 1.63 0.05 4 8.60 α-松油烯| C10H16 3.99 0.14 5 9.40 4-甲基-3-（1-甲基亚乙基）-1-环己烯 C10H16 3.66 0.21 6 11.43 1,3,5-十一碳三烯 C11H18 5.04 0.30 7 12.02 4-松油醇 C10H18O 3.56 0.05 8 20.91 4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4α，7-四氢化萘 C15H24 1.31 0.22 9 23.21 γ-古芸烯 C15H24 6.11 0.85 10 23.56 β-马榄烯 C15H24 2.14 0.34 11 26.56 桉油烯醇 C15H24O 0.66 0.11 12 29.15 丁基苯酞 C12H14O2 1.31 0.89 13 29.93 丁烯基苯酞 C12H12O2 2.32 0.97 14 30.73 6-丁基-1,4-环庚二烯 C11H18 0.45 0.60 15 31.83 洋川芎内酯A C12H16O2 9.53 25.60 16 32.02 - - 1.97 2.95 17 32.33 Z-藁本内酯 C12H14O2 45.40 65.59 18 33.86 E-藁本内酯 C12H14O2 0.49 0.75 注：-表示未鉴定 
图 1 川芎水蒸气蒸馏挥发油总离子流图
图 2 川芎超临界CO2萃取挥发油总离子流图
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水蒸气蒸馏法是一种传统的挥发油提取工艺，对川芎药材中挥发性较强的成分如单萜和倍半萜类保留相对较强，适合低沸点、极性小的成分提取，且提取工艺对设备的要求不高，生产成本较低，在中药制剂工业上广泛应用，但是其挥发油提取率会相对较低。超临界CO2萃取法操作简单快速，基本2 h可完成提取过程，对川芎挥发油提取收率高，尤其对苯酞类有效成分的提取率相对较高，适合高沸点极性成分的提取，对环境及萃取产物无污染，便于提取工艺产业化。两种工艺的挥发油在成分上有一定的差异，因此在川芎挥发油入药的中药制剂工艺中，应根据制剂的功效充分考虑提取工艺对有效成分的影响，在适应证药效学研究的基础上分析不同工艺得到的挥发油的药效学和毒理学差异，而针对性的选择合适的提取工艺显得尤为重要。
Comparative study on volatile oil in Rhizoma chuanxiong by steam distillation and supercritical fluid extraction
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摘要:
目的 通过对不同工艺下得到的川芎挥发油的比较，阐明提取工艺对其有效成分的影响。 方法 分别采用超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法提取川芎挥发油，再通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术分析鉴定其中的主要化学成分及相对含量。 结果 2种方法所得川芎挥发油样品中共鉴定18种共有成分，水蒸气蒸馏提取物中苯酞类成分约占61%，单萜类成分约占25%，倍半萜类成分约占10%；超临界CO2萃取物中苯酞类成分约占97%，单萜类成分约占1%，倍半萜类成分约占0.4%。 结论 水蒸气蒸馏法对川芎药材中挥发性较强的单萜和倍半萜类保留相对较强，超临界CO2萃取法对苯酞类有效成分的提取率相对较高，因此在川芎挥发油入药的中药制剂工艺中，应根据制剂的功效充分考虑提取工艺对有效成分的影响。 Abstract:Objective To clarify the influence of the extraction process on its active ingredients by comparing the volatile oils of Rhizoma Chuanxiong obtained under different processes. Methods The volatile oil of Rhizoma Chuanxiong was extracted by supercritical CO2 extraction (SFE) and steam distillation. The main chemical components and relative contents were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results A total of 18 common components were identified in the volatile oil samples of Chuanxiong from the two methods. In steam distillation samples, main components included phthalides (61%), monoterpenoids (25%) and sesquiterpenes (10%). In SFE samples, phthalides (97%) were major components, followed by monoterpenoids (1%),sesquiterpenes (0.4%) and other minor components. Conclusion The steam distillation retains highly volatile components in Rhizoma chuanxiong such as monoterpenoids and sesquiterpenes. For SFE approach, the phthalides were extracted more efficiently compared with other components. The effect of the extraction process on the active ingredients should be fully considered in obtained products of Rhizoma chuanxiong since the difference in constituents may result in varied effects. -
生脉注射液临床上常用于辅助治疗心肌梗塞、心源性休克、脓毒症和感染性休克。心肌梗塞引起组织产生大量氧自由基，直接损伤心肌细胞并触发细胞凋亡，免疫介导的炎症损伤会加大心梗范围和心梗损伤[1]。心源性休克激活的炎症反应可诱导产生大量NO，促进细胞凋亡[2]。脓毒血症是由细菌引起的全身性炎症，大量致炎因子破坏机体的免疫平衡，从而导致机体代谢紊乱[3]，严重者可能引起感染性休克。本研究特选择抗氧化及抗炎能力作为生物效应指标，考察生脉注射液质量与生物效应之间的相关性。
课题组前期对生脉注射液中11种成分[4]进行了指认并进行了定量，均符合药典标准。药理学实验表明，生脉注射液中人参皂苷、木质素和麦冬皂苷等多种化学成分均在细胞及动物模型上表现出良好的抗炎效果[5-8]，且临床研究表明其可以通过抗炎通路发挥对器官损伤的保护作用[9-10]。现今生物效应评价在中药材和中成药质量控制研究中有所应用[11-12]，2015版《中国药典》收录了生物活性测定法作为质量控制标准，如洋地黄生物测定法和黄体生成素生物测定法，说明通过生物效应控制药品质量是可行的。
抗炎和抗氧化损伤是生脉注射液产生药理作用的重要机制，但现今的质量标准仅对化学成分进行定性定量分析，不能全面体现其整体的药效活性，为此，本研究尝试通过评价其抗氧化能力以及抗炎活性，建立有效的生脉注射液生物学质量控制方法。
1. 材料
1.1 试剂与药品
二苯基苦基苯肼（DPPH，质量分数≥97%，含10%～20%苯，批号：PRPDE-JO，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；水溶性维生素E (Trolox)、DMEM培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京Solarbio公司；胎牛血清（FBS，德国PAN Seratech公司）；N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；无水乙醇（北京化工厂）；水（屈臣氏）。
9批次生脉注射液分别由5个不同厂家生产，样品详细情况见表1。
表 1 生脉注射液样品来源、批号及有效成分含量(μg/ml)[4]编号 生产厂家 批号 规格 人参皂苷Rb1 人参皂苷Re 人参皂苷Rg1 五味子醇甲 麦冬皂苷D S1 A 16120401005 10 ml/支 61.16 51.39 84.69 51.43 1.48 S2 B 160502 10 ml/支 101.69 55.61 88.99 73.09 3.42 S3 C 17071014 10 ml/支 56.99 44.87 80.42 36.78 1.68 S4 C 17040423 20 ml/支 63.12 44.51 81.54 39.63 1.28 S5 D 1704252 20 ml/支 77.15 62.10 86.11 29.05 3.62 S6 E 17091302 10 ml/支 85.52 57.74 88.45 33.55 1.40 S7 E 17092903 10 ml/支 80.43 41.52 86.36 37.30 1.33 S8 E 17061103 20 ml/支 74.88 61.06 80.00 35.18 1.72 S9 E 17053005 20 ml/支 79.97 48.54 80.34 44.83 1.59 1.2 主要仪器及设备
电子分析天平（AB265-S，梅托勒-托利多有限公司）；超声波清洗仪（B25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；TS-2000A脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔板、多功能连续波长酶标仪（InfiniteM1000，TECAN公司）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；二氧化碳培养箱（MCO-15AC，三洋电机株式会社）。
1.3 细胞培养
RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。培养条件：完全培养基为含10%FBS的DMEM培养基，在37℃含5% CO2的培养箱中培养。每天换液，细胞生长达对数生长期时，传代（传代比例为1:6）并开展实验，实验用细胞控制在10代以内。
2. 方法与结果
2.1 DPPH法评价生脉注射液质量
2.1.1 实验过程
取96孔板，每孔依次加入100 μl初浓度2.0%的受试液、100 μl 0.5 mmol/L DPPH溶液，震荡均匀后避光反应20 min。
测定方法：每孔依次加入100 μl受试液和DPPH溶液，在摇床上振荡均匀，避光反应20 min后，用酶标仪测定波长在517 nm处的吸光度。
2.1.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：分别吸取样品编号为S9的药液，用纯水定容得到浓度为8%的生脉注射液受试液。逐级稀释，测定其吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到的线性关系方程为Y=-0.2081X+1.2209（r=0.9996）（图1-A），表明生脉注射液具有较强的DPPH自由基清除能力且具有浓度依赖性，体积浓度和平均吸光度具有良好的线性关系，在0%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为2.25%（见表2），表明该方法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S9，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照"2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.21%（见表2），表明该方法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S9，分别于0、4、8、24、48和72 h，配制得到浓度2.0%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.47%（见表3），表明该方法在72 h内稳定性良好。
图 1 生脉注射液抗氧化生物活性评价A. 生脉注射液对DPPH清除作用的标准曲线；B. Trolox对DPPH清除作用的标准曲线；C. 1.0%各批次生脉注射液相当于Trolox的量（mmol/L）表 2 1.0%生脉注射液对DPPH清除作用的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 1.063 4 1.087 9 2.25 1.138 9 1.135 6 2.22 2 1.115 6 1.175 6 3 1.098 3 1.135 7 4 1.114 3 1.096 7 5 1.064 9 1.129 2 6 1.070 9 1.137 7 表 3 1.0%生脉注射液对DPPH的清除作用的稳定性时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 1.038 5 1.078 8 2.47 4 1.105 7 8 1.072 2 24 1.080 5 48 1.065 7 72 1.110 0 2.1.3 生脉注射液抗氧化生物活性的质量评价
精密称定Trolox，加入100 μl无水乙醇溶解，纯水定容，得到初浓度为15.46 mmol/L的Trolox溶液。将其逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到的线性关系方程为Y=–0.0789X+1.1674（r=0.9951）（见图1-B），表明Trolox清除DPPH能力在作用浓度0.43~5.56 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液清除DPPH自由基的结果与Trolox比较，折算得到各批次生脉注射液相当于水溶性Trolox的作用浓度（见图1-C）。结果表明，终浓度1.0%的各批次生脉注射液清除自由基能力相对于Trolox作用浓度范围为1.2~1.9 mmol/L，在清除自由基即抗氧化能力方各批次不存在较大差异。
2.2 Griess试剂盒评价生脉注射液的抗炎活性
2.2.1 Griess试剂盒测定生脉注射液抑制NO释放能力
使用完全培养基配制为1.2%的生脉注射液样品溶液，及初浓度100μg/ml的LPS样品溶液。
取对数生长期的RAW264.7细胞，制备成2×106个/ml的细胞悬液，以每孔100 μl注入96孔板。培养24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μl样品溶液和100 μl的LPS溶液，孵育24 h后吸取50 μl上清液，按照Griess试剂盒说明书操作，用酶标仪测定波长540 nm处的吸光度。
2.2.2 方法学考察
考察内容：①线性关系：精密吸取样品编号为S6的药液，用完全培养基制成浓度为4.0%的溶液。逐级稀释，测定吸光度并计算该浓度下的平均吸光度。以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性方程为Y=–0.033ln(X)+0.243（r=0.9961）（见图2-A），表明生脉注射液具有良好的NO分泌抑制能力并具有浓度依赖性，终浓度和平均吸光度之间具有良好的线性关系，在0.2%~2.0%范围内线性关系良好。②精密度：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其吸光度的RSD值为1.71%（见表4），表明该法满足方法学精密度要求。③重复性：取样品S6，配制得到浓度为1.2%的受试液，设置平行复孔，按照“2.1.1“项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.79%（见表4），表明该法满足方法学重复性要求。④稳定性：取样品S6，分别于0、4、8、24和48 h时，配制得到浓度1.2%的溶液，设置平行复孔，按照“2.1.1”项下操作测定吸光度，计算其平均吸光度的RSD值为2.66%（见表5），表明该方法在48 h内稳定性良好。
图 2 生脉注射液抗炎活性评价A. 生脉注射液对RAW264.7细胞分泌NO的标准曲线；B. L-NAME对RAW 264.7细胞分泌NO的标准曲线；C. 0.60%各批次生脉注射液相当于L-NAME的量（mmol/L）表 4 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的精密度和重复性考察编号 精密度试验 重复性试验 吸光度 均值 RSD(%) 吸光度 均值 RSD(%) 1 0.276 0 0.272 9 1.71 0.272 9 0.285 0 2.79 2 0.272 3 0.281 1 3 0.265 0 0.289 0 4 0.276 1 0.291 6 5 0.275 0 0.290 6 表 5 1.2%生脉注射液对LPS刺激264.7细胞分泌NO的稳定性考察时间 吸光度 均值 RSD(%) 0 0.264 5 0.262 3 2.66 2 0.273 6 4 0.257 4 24 0.257 4 48 0.258 6 2.2.3 生脉注射液抗炎生物活性的质量评价
精密称定eNOS抑制剂L-NAME，逐级稀释，按照“2.1.1“项下操作，测定并计算平均吸光度，以终浓度为横坐标（X），平均吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得到线性关系方程为Y=–0.052ln(X)+0.152（r=0.9957）（见图2-B），表明L-NAME抑制NO分泌能力在0.05~0.55 mmol/L范围内具有良好线性关系。
将9批次生脉注射液抑制NO分泌能力的结果与L-NAME比较，折算得到各批次生脉注射液相对于L-NAME的作用浓度（见图2-C）。
结果显示，除S2和S8样品外，终浓度0.6%的各批次生脉注射液对应的L-NAME浓度范围均在0.06~0.16 mmol/L范围内，表明在抑制NO分泌能力即抗炎能力方面S2和S8与其他样品存在较大差异。其中S2对应的L-NAME浓度远高于其他样品，其抗炎活性远高于其他样品组，推测这可能与化学成分含量差异有关，需要后续的实验加以证实。
3. 讨论
3.1 实验方法及阳性对照药的选择
测定抗氧化活性常用的方法有氧化自由基吸收能力（ORAC）、二苯基苦基苯肼（DPPH）法和总抗氧化能力检测（ABTS）法等，本实验首先采用DPPH法测定抗氧化能力，该方法操作简便，常用于体外评价化合物的抗氧化活性，其中Trolox和维生素C是常用的抗氧化剂对照药[13-14]，但相较之下，Trolox可通过清除自由基产生抗氧化机制，且具有剂量依赖性[15]，而维生素C稳定性较Trolox差，所以该方法选择了该药作为阳性对照。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）诱导产生NO是NO产生的重要途径[16]，L-NAME作为eNOS抑制剂，选择其作为对照药可以更加直观地评价药物对细胞产生NO的抑制能力。
3.2 结果分析
参考2015版药典生物测定方法，该试验通过测定生脉注射液的抗炎和抗氧化能力，初步建立了生脉注射液的生物效应质量控制方法，该方法不仅能满足方法学要求，而且可以克服现行质量控制方法的局限性，还可以有效的评价中药复方制剂在治疗过程中产生的效应强度，实现“质-量-效”的有效结合[17]。
4. 展望
中药复方是一个组分复杂，不仅化学成分复杂，未知组分众多，而且其可能通过不同成分的配伍产生作用机制，即其药理机制不是单一化学成分能够阐明的，因此，仅对中药复方的化学成分进行评价难以对其成分及作用进行全面阐述。生物效应质量控制方法能对中药复方的整体组分药效进行把控，从药理活性方面评价中药复方质量，弥补现有质控方法的不足。在生物效应质控方法建立过程中，应注意以下问题：①质控方法应根据药效及药理机制研究选择合适的生物效应指标，充分反映该药的药理活性特征；②选择的对照药应具有足够的专属性、关联性和可测性，能够充分准确地反映药物的生物效应[18-20]。参考已有的生物质量控制研究[11，21]并对生脉注射液可能的药理活性进行筛选，对此进行考察。重点考察其方法学验证，结果显示该方法可行性高，方法学符合生物效应评价要求，可以反映生脉注射液的整体生物效应。但抗炎活性的测定实验要求较高的实验操作，且该方法对中药复方的整体生物活性进行测定，并未对可能产生药理活性的化学组分和含量进行探究和测定，可能产生药理活性的化学成分及作用机制尚不明确，值得后续的探讨。
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表 1 川芎挥发油化学成分
序号 TR/min 化合物 分子式 相对含量（%） 水蒸气蒸馏 超临界CO2萃取 1 5.66 α-蒎烯 C10H16 1.48 0.09 2 6.52 β-蒎烯 C10H16 5.70 0.30 3 7.71 邻伞花烃 C10H14 1.63 0.05 4 8.60 α-松油烯| C10H16 3.99 0.14 5 9.40 4-甲基-3-（1-甲基亚乙基）-1-环己烯 C10H16 3.66 0.21 6 11.43 1,3,5-十一碳三烯 C11H18 5.04 0.30 7 12.02 4-松油醇 C10H18O 3.56 0.05 8 20.91 4-异丙基-1,6-二甲基-1,2,3,4,4α，7-四氢化萘 C15H24 1.31 0.22 9 23.21 γ-古芸烯 C15H24 6.11 0.85 10 23.56 β-马榄烯 C15H24 2.14 0.34 11 26.56 桉油烯醇 C15H24O 0.66 0.11 12 29.15 丁基苯酞 C12H14O2 1.31 0.89 13 29.93 丁烯基苯酞 C12H12O2 2.32 0.97 14 30.73 6-丁基-1,4-环庚二烯 C11H18 0.45 0.60 15 31.83 洋川芎内酯A C12H16O2 9.53 25.60 16 32.02 - - 1.97 2.95 17 32.33 Z-藁本内酯 C12H14O2 45.40 65.59 18 33.86 E-藁本内酯 C12H14O2 0.49 0.75 注：-表示未鉴定 
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