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粉-液双室袋是采用特定工艺将药物和注射用溶剂独立封装在不同的两个腔室中的一种静脉注射用产品，在医护人员紧缺或战备、紧急救援等情况下，其优势突出[1]。1996年，日本研制出世界首个粉-液双室袋产品——头孢唑林钠氯化钠注射剂[2]。2015年，原中国食品药品监督管理总局出台首个《粉液双室袋产品技术审评要点》[3]，国内首个粉-液双室袋产品（注射用头孢他啶/氯化钠注射液）于2019年获得药品注册批件，正式上市。粉-液双室袋因其结构上的创新，给药预处理步骤简化在使用上具有独特的优势，因此粉-液双室袋产品自上市后就受到了广泛的关注。但对于这样一个新产品，是否真正安全有效，是否具有成本-效益，与市场上正在使用的传统粉针剂相比是否具有明显的优势等问题目前均未得到解答，利益各方大都采取观望的态度。
为促进粉-液双室袋产品临床合理应用，依据国家卫健委2020年发布的《药品临床综合评价管理指南（试行）》[4]，通过对文献资料进行调研，提取粉-液双室袋常用评价指标，以传统粉针产品为对照，从安全性、有效性、经济性、适宜性、可及性、创新性6个维度对粉-液双室袋产品进行综合评价。
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以“双室袋” “双腔袋” “多室袋” “多腔袋” “Multi chamber bag”和“dual chamber bag”等为关键词，在中国知网、万方数据、维普、PubMed 、Web of Science等数据库中进行系统文献检索，对发表年度不设限制。表1为具体的检索式及相应检索结果。
表 1 检索式及检索结果
检索条件 各数据库检索结果 中国知网 万方数据 维普 PubMed Web of Science （主题=双室袋 + 粉液双室袋）OR（主题=双腔袋）
OR（主题=多室袋）OR（主题=多腔袋）80 （（（（任意字段=双室袋 OR 任意字段=粉液双室袋）OR 任意字段=多室袋）OR 任意字段=双腔袋）OR 任意字段=多腔袋） 189 主题=（双室袋）OR 主题=（粉液双室袋）OR 主题=（多室袋）
OR 主题=（双腔袋）OR 主题=（多腔袋）6740 （Multi chamber bag）OR（dual chamber bag） 42 （Multi chamber bag）OR （dual chamber bag） 166 -
纳入标准：①研究对象为粉-液双室袋；②内容为安全性、有效性、经济性、适用性、创新性、可及性的研究；③文献类型为随机对照试验或观察实验；④有参考价值的多室袋研究文献。
排除标准：①研究对象为液-液双室袋；②内容为生产工艺、设备、分装技术和其他无关内容；③文献类型为综述、会议论文、专利、成果；④重复文献、不可下载文献。
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文献由2名研究员独立、同步进行筛选。参考中国医药包装协会发布的《基础输液临床使用评估指南（试行）》[5]和国家卫健委发布的《药品临床综合评价管理指南（试行）》[4]提取文献中的可用指标。如产生争议，由课题组成员讨论决定。
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系统检索文献得
7217 篇，排除重复文献2647 篇、文献类型为综述、会议论文等4424 篇、文献内容为生产工艺和技术介绍等123篇，最终纳入分析文献23篇，其中英文文献2篇，中文文献21篇。具体筛选过程如图1。
图 1 文献筛选流程图
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文献中使用的评价指标涉及5个维度，经过整合、汇总，见表2。由于双室袋产品和传统粉针剂的药物成分、给药途径一致，仅包装和给药预处理存在区别，故有效性、安全性两个维度仅包括与包装和给药预处理相关的指标。其中，虽配制过程刺伤、划伤等为操作失误，但双室袋产品简化了药液配制过程，无需使用注射器辅助配制，可完全避免意外伤害，与传统粉针剂存在差异，故纳入为安全性指标。
表 2 已发表文献使用的评价指标
评价维度 判别可用指标 有效性 药液稳定性、配制浓度准确性、药液残留量 安全性 不溶性微粒、刺伤划伤等意外事情发生率 经济性 配制成本a、废弃物重量、住院成本、血液感染发生率 适宜性 配制时间、平均医护人员人力占用、包装重量和
储运体积b、环境适应性、废弃物处理难易程度可及性 生产厂家数量、产品原材料供应能力、患者可负担性 a：为药液成本、配制用品以及配制人工成本的总和；b：包括药液配制过程所需用品储运体积总和，传统粉针剂产品的配制用品包括注射器、西林瓶粉针、配制用溶剂等，粉-液双室袋产品仅包括产品本身。 -
于庆坤等[6-12]研究结果显示，与传统粉针剂相比，双室袋产品的药液含量随时间变化小，配制的实际浓度更接近理论浓度，无残留药液，具体见表3和表4。
表 3 药液配置后5 h的稳定性对比[7]
产品名称 不同温度时的百分含量（%） 4℃ 25℃ 非PVC粉-液双室袋产品 96.33 96.32 玻璃瓶粉针产品 95.37 95.79 -
静脉输液中的不溶性微粒会造成血栓和静脉炎[13]，药典规定用于静脉注射、滴注的药品需检查不溶性微粒。双室袋法配制过程不溶性微粒无明显增加[8,10,14-15]，详见表5。以18名护士为观察对象，粉针配制过程1名护士被划伤，双室袋配制过程无人员刺伤、划伤[10]。粉-液双室袋以非PVC多层共挤膜为膜材，其强光照射实验表明0.9%氯化钠、5%葡萄糖、葡萄糖氯化钠、复方氯化钠注射液与膜材相容性良好，稳定性试验表明非PVC多层共挤膜的水蒸气渗透、透光率、pH、易氧化物检测均符合规定[14,16]。
表 5 配制过程不溶性微粒比较
文献作者 样品 不溶性微粒数（个/ml） ≥5 ≥8 ≥10 ≥12 ≥25 ≥100 李英等[15]a 粉针输液产品 318 66 21 6 0 0 配制增加微粒数b 285 55 15 3 0 0 双室袋输液产品 2 0 0 0 0 0 双室袋增加微粒数c 0 0 0 0 0 0 沈敏娜等[16]a 粉针输液产品 322 68 23 7 0 0 配制增加微粒数 289 55 17 5 0 0 双室袋输液产品 3 1 0 0 0 0 双室袋增加微粒数c 0 0 0 0 0 0 王宇航等[8]a 粉针输液产品 240 326.5 43 24 7 0 双室袋输液产品 240 2 0 0 0 0 罗莉等[10]d 粉针输液产品 219.52±84.73 43.93±21.68 14.93±7.96 4.05±2.60 0.01±0.04 双室袋输液产品 3.49±0.95 0.39±0.19 0.20±0.11 0.13±0.09 0.03±0.03 a：实验重复配制（均≥100份），由于数据资料不服从正态分布，选中位数表征平均水平，表中均为中位数值；b：增加微粒数=溶液微粒数−（粉体+液体），表示溶配方法增加的不溶性微粒；c：双室袋法配置的不溶性微粒增加数计算结果为负值，由于混合前为取出粉末后在非封闭的环境中进行溶解测试，而混合后则是在封闭的袋内进行开通溶解后测试，从而导致粉体检测结果高于混合液的情况出现，因此即配型双室袋法配置的不溶性微粒增加数视为零；d：本实验所取数据为不溶性微粒数范围值。 -
在纳入的双室袋产品相关经济性研究[8,17-18]中考虑到的成本指标包括配制成本（包括配制环境、设备以及环境维护费、人工成本、耗材成本）、废弃物重量，效果/效益以血液感染（BSI）为指标。采用双室袋输液，药液配制过程得到简化，一方面可节省储存场所、人工及耗材成本，一方面产生的废弃物减少，废弃物处理费会有所减少。王宇航等[8]通过计算发现按照4.82元/kg的垃圾清理费算，每年可减少废弃物处理费约7万元。此外，双室袋输液配制过程减少与空气的接触，可在一定程度上减少输液后血液感染的发生率。苗雅楠等[17]发现在
1000 例患者中，输液系统由半开放式转换为全密闭输液系统可减少172例血液感染。已上市的粉-液双室袋产品与对应的传统粉针相比，有效期相同，对于储备来说，两者轮换周期一致。 -
对于易溶于水但在水溶液中不稳定的药物一般选择制成注射用无菌粉针，此类产品在使用前需要与特定的配制用溶剂临时配制注射用溶液。与粉针剂西林瓶产品运用的药液配制方法相比，双室袋法输液预处理环节有所简化，能明显缩短药液配制时间[8,10,19]，具体见表6，在医护资源匮乏（如应急医学救援）时，可减少医护人员人力的占用。此外双室袋为全密闭输液系统，对环境的耐受性强。
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可及性包括可获得和可负担两方面的要求。双室袋产品的药液与传统粉针一致，包装材料有所不同，目前双室袋包材审批通过已登记的有15项（1项为进口），双室袋产品生产厂家超过5家，产品大都为头孢类抗感染药物，在生产供应方面，可以满足可及性的要求。此外，2022年《国家基本医疗保险药品目录》的协议期内谈判药品部分有5个粉-液双室输液产品被纳入，为医保乙类药品，可达到患者可负担的要求。
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截止到2023年4月，与粉-液双室输液袋有关的发明专利有22项，实用新型专利89项，外观专利5项，包括生产、灌装、检漏等方面。粉-液双室袋产品能缩短配液时间，简化输液预处理过程，降低了输液对环境的要求，顺应了突发事件应急医学救援与创伤急救的需求。
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本研究采用系统综述的方法对现有文献信息分析提取，得到的指标可作为评价指标池的一部分，后续可用于建立粉-液双室袋产品综合评价指标体系。
粉-液双室袋产品与传统粉针药效成分、给药途径相同，我国对药品上市后包装变更无临床试验的要求[20]，已发表文献中均未报告其有效性、安全性的临床结局指标，且两者仅在包材和给药预处理方面存在差异，故纳入的有效性指标只包括药物学工艺重现性，安全性指标只包括不良事件或风险的比较指标。除列出指标外，安全性评价还需考虑渗漏隐患、破损率、误配、错配发生率等。经济性评价具有时间性，存在偏倚风险，仍需对此类产品进行更为可靠的经济学研究。适用性的考查应注重产品在紧急救援使用时缩短抢救时间，节约医护资源的能力。粉-液双室袋的技术壁垒较高，可及性方面不如传统粉针剂，但符合可及性的基本要求。
粉-液双室袋属于全封闭式输液系统，无空气通路，细菌污染降低，减少了输液反应的发生[21]。药液配制时间明显缩短，提高救援成功率[22]；无需临时计算溶剂用量，配制准确度高，无药液残留，且对环境、技术要求不高，降低了人工、设施及耗材成本；无需借助注射器反复穿刺橡胶塞，不溶性微粒显著减少，刺伤、划伤等意外事情可避免。虽单价高于传统粉针产品，但其在废弃物处理成本、人工成本以及输液后静脉炎发生率的减少方面展现出了一定的优势。此外国内双室袋产品的生产企业超过5家，且在原材料上摆脱了对进口的依赖，5种粉-液双室袋产品已纳入医保目录，符合可及性要求。
粉-液双室袋为新兴产品，仅有23篇符合纳入条件。外文文献较少，仅纳入2篇。因多室袋与双室袋原理一致，故将以多室袋为研究对象的文献也纳入。期待随着粉-液双室袋在我国广泛应用，未来可获得高质量、精细化的研究数据，以开展更全面、可靠的综合评价研究。
Comprehensive evaluation of powder-liquid double-chamber bag products: a systematic review
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摘要:
目的 以传统粉针剂为对照，对粉-液双室袋产品进行综合评估。 方法 采用系统综述法，收集粉-液双室袋文献资料，提取常用评价指标，评估粉-液双室袋产品的使用价值，与传统粉针剂产品进行综合比较。 结果 共纳入文献23篇，评估使用的有效性指标为药液稳定性、配制浓度准确性、药液残留量；安全性指标为不溶性微粒、刺伤划伤发生率；经济性指标为配制成本、废弃物重量、住院成本、血液感染发生率；适用性指标为配制时间、平均医护人员人力占用、包装重量和储运体积、环境适应性、废弃物处理难易程度；可及性指标为生产厂家数量、原料供应能力、患者可承担性。通过文献证据对其评估，表明粉-液双室袋稳定性、浓度准确性高于传统粉针剂，并已实现国产供应。双室袋法配制药液可减少输液反应，能缩短药液配制时间。 结论 相比于传统粉针产品，粉-液双室袋在有效性、安全性、经济性、适宜性、创新性维度均具备优势，可及性维度符合要求。 Abstract:Objective To evaluate the advantages of powder-liquid double-chamber bag products compared with traditional powder injection. Methods The systematic review method was used to collect the literature on powder-liquid double-chamber bag, extract common evaluation indicators, evaluate the use value of powder-liquid double-chamber bag products, and conduct a comprehensive comparison with traditional powder injection products. Results A total of 23 articles were included in the literature. The effectiveness indicators used for evaluation were the stability of the liquid medicine, the accuracy of the preparation concentration, and the residual amount of the liquid medicine; the safety indicators were the incidence of insoluble particles and the incidence of punctures and scratches. The economic indicators were preparation cost, occupied volume of preparation supplies, waste weight, hospitalization cost and incidence of blood infection. The applicability indicators were preparation time, average occupation of medical staff, packaging weight and storage and transportation volume, environmental adaptability, and ease of waste disposal. Accessibility indicators are the number of manufacturers, raw material supply capacity, and patient affordability. Through the evaluation of literature evidence, it was found that the stability and concentration accuracy of the powder-liquid double-chamber bag were higher than those of the traditional powder injection, and the domestic supply had been achieved. The double-chamber bag method can reduce the infusion reaction and shorten the preparation time of the liquid medicine. Conclusion Compared with traditional powder injectabler products, powder-liquid double-chamber bags have advantages in the dimensions of effectiveness, safety, economy, suitability and innovation, and the accessibility dimension meets the requirements. -
Key words:
- powder-liquid double chamber bag /
- comprehensive evaluation /
- injection
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创伤性脑损伤（TBI）是脑部受外力打击后引起的神经系统疾病，可导致大脑暂时性或永久性的功能或结构损伤[1]，是急诊外科最为常见的损伤，同时也是现代战争的标志性创伤之一。TBI可分为原发性损伤和继发性损伤，继发性损伤包括氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍等，是TBI患者神经修复预后不良的主要原因[2]，也与多种神经退行性疾病的病理机制密切相关。
基于干细胞的组织再生修复治疗已经在基础研究和临床试验中得到广泛开展[3]。间充质干细胞（MSCs）移植是促进中枢神经损伤后修复极具潜力的方向[4]。MSCs是一种多能干细胞，可以从骨髓、脐带等组织中获取[5-6]。研究表明，炎症环境中，MSCs可以迁移到脑损伤部位，通过旁分泌机制分泌生长因子、抗炎因子等，具有减少神经炎症、增强神经发生以及改善运动和认知功能的作用[4, 7-8]。TBI后，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）直接注射到脑损伤部位，或通过静脉或动脉注射，被证明可以显著改善运动和认知障碍[9-11]。白藜芦醇（RSV）是非黄酮类多酚有机化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[12]。RSV已被证明可抑制神经元自噬和炎症，减轻TBI引起的脑水肿，提高学习记忆能力，并促进运动感觉功能恢复[13]。
组织工程支架是再生医学中非常有应用潜力的工具，使用无毒、低免疫原性、可注射和降解的生物材料作为支架负载生物活性单元，如干细胞/胞外囊泡进行移植治疗，具有局部定位、修补缺损组织、可在较长时间内发挥治疗活性的优势[14]，有效解决干细胞移植滞留和存活率低的难题。温度敏感水凝胶因其对温度变化的敏感性而得到了广泛应用，该特性赋予了水凝胶局部可注射及驻留的特性[15]。N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）是热敏感性聚合物之一，低临界相转变温度为32℃，接近于人体温度，化学性质稳定，已被广泛用作具有智能温度响应性的药物和基因传递系统，是制备温度响应性水凝胶的理想材料[16]。透明质酸（HA）是细胞外基质的主要成分之一，存在于全身组织，并且具有低硬度和生物相容性，是一种有潜力用于脑组织的生物医学应用材料[17]。丝素蛋白（SF）是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有低免疫原性及可生物降解特性[18]。
本研究以SF和HA为聚合物骨架，结合温敏分子NIPAM制备了温敏水凝胶NIPAM-HA-SF，负载BMSCs和RSV-LIP，考察水凝胶对TBI的治疗作用。
1. 材料和方法
1.1 实验仪器和材料
Thermo UltiMate 3000液相色谱仪（美国Thermo公司）；冷冻干燥机V55C（美国Virtis有限公司）。FBS（美国Gibco公司）；MSCs培养基套装（上海唯恩生物有限公司）；MEM培养基（上海源培生物科技股份有限公司）；RSV（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氢化卵磷脂[艾伟拓（上海）医药科技有限公司]；胆固醇（99%生物技术级，上海麦克林生化科技股份有限公司）；NIPAM（上海泰坦科技股份有限公司）；透明质酸[生工生物工程（上海）股份有限公司]；丝素蛋白[150 KD，复向丝素医疗科技（苏州）有限公司]；活性氧检测试剂盒、Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TNF-α ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司）；激光粒度分析仪（英国Malvern公司）；多功能荧光测定仪（美国Agilent公司）。
SD大鼠、C57小鼠均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；动物实验均经海军军医大学医学伦理委员会批准，并按照海军军医大学动物护理和使用指南进行饲养。
1.2 BMSCs的提取和培养
取SD大鼠（雄性，2～3周），麻醉后脱颈处死，分离股骨和胫骨，PBS冲洗骨髓腔并收集冲洗液，过70 μm筛网后以300×g离心5 min，以PBS重悬，300×g离心5 min，以红细胞裂解液重悬，静置10 min。450×g离心后以PBS重悬，300×g离心5 min得到细胞沉淀。加入MSCs完全培养基，接种于细胞培养皿，置于37℃，5% CO2细胞培养箱培养。
1.3 NIPAM-HA-SF的合成
称取0.153 g NIPAM，溶解于双蒸水中，在冰浴条件下氮气除氧1 h。过硫酸钾（KPS，0.058 g）和2-巯基乙胺（AET，0.122 g）分别溶解于双蒸水中，在冰浴条件下氮气保护搅拌。4 h后，加入HA溶液（0.256 g溶解于双蒸水中），加入EDC/NHS（0.200 g/0.100 g），N2保护低温反应24 h，得到NIPAM-HA。
将NIPAM-HA和SF混合（SF∶HA=1∶1），加入EDC/NHS（0.400 g/0.200 g），N2保护低温反应24 h。透析3 d，收集产物，−80℃过夜，使用真空冷冻干燥机冻干3 d，得NIPAM-HA-SF。
1.4 RSV-LIP的制备与表征
1.4.1 RSV-LIP的制备
以薄膜分散-挤出法制备RSV-LIP。称取RSV、卵磷脂、氢化卵磷脂、胆固醇适量，溶解于10 ml混合溶剂中（甲醇∶氯仿=1∶1，V/V），浓度分别为0.200、0.660、1.540、0.734 mg/ml。45℃，20 r/min避光旋蒸1 h，加入5 ml PBS（1×，pH 7.4），45℃水化1 h。而后将混悬液依次通过挤出器过400、100 nm膜各挤出30次，得到RSV-LIP。
1.4.2 RSV-LIP粒径和Zeta电位测定
取RSV-LIP混悬液，马尔文激光粒度仪测定粒径、Zeta电位。
1.4.3 RSV-LIP包封率和载药量测定
色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）（65∶35）；流速：0.8 ml/min；检测波长：306 nm；柱温：35℃；进样量：10 μl。
取 200 μl RSV-LIP溶液，加入4倍体积甲醇涡旋15 min，4℃，15 000 r/min离心30 min，取上清液，HPLC法测定脂质体中药物浓度。同时取200 μl RSV-LIP，4℃，15 000 r/min离心30 min，吸弃上清液，加入甲醇混匀，4℃，15 000 r/min离心 30 min，取上清液，HPLC分析，按照以下公式测定载药量和包封率：
$$ \begin{split}\text{包封率} & =\frac{\text{脂质体中包封的药量}}{\text{脂质体中总药量}}\times 100\text{%；} \\ \text{载药量} & =\frac{\text{脂质体中包封的药量}}{\text{脂质体总质量}}\times 100\text{%。}\end{split} $$ 1.5 NIPAM-HA-SF水凝胶的制备和释药
1.5.1 水凝胶的制备
取适量NIPAM-HA-SF溶解于双蒸水，加入适量RSV-LIP，搅拌均匀，置于37℃孵育10 min即得载RSV-LIP水凝胶。
1.5.2 水凝胶中RSV的释药
线性：色谱条件同“1.4.3”。精密量取一定体积的对照品母液于5 ml容量瓶中，分别用甲醇稀释浓度为1、4、10、20、50、100、200 μg/ml的对照品溶液。按上述色谱条件进行测定，以RSV质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归。
专属性：精密称定RSV对照品10 mg加甲醇溶解，置于100 ml棕色容量瓶并定容至刻度线，摇匀，即为对照品溶液。取100 μl载RSV-LIP的水凝胶，甲醇溶解后置于5 ml容量瓶中并定容，超声5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜即得供试品溶液。取100 μl空白脂质体凝胶，按供试品溶液的制备方法制备，即得阴性样品溶液。
精密度：取4、20、200 μg/ml的对照品溶液，按上述色谱条件1 d内重复进样3次考察日内精密度，同时连续3 d测定以考察日间精密度。
回收率：取100 μl载空白脂质体的水凝胶置于5 ml容量瓶中，分别加入不同体积的RSV对照品溶液，以甲醇定容至刻度线，使RSV浓度分别为4、20、200 μg/ml，同浓度制备3份。摇匀，超声5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后进样测定。
体外释药：取适量载RSV-LIP的水凝胶装封于透析袋（3.5×106 Da）中，置于20 ml的双蒸水中，37℃，100 r/min条件下持续震荡。分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h吸取1 ml袋外溶液，并补充相同温度体积的空白释放介质。取出溶液加入适量甲醇，10 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.22 μm滤膜后进样。测定不同时间点释放介质内RSV的浓度，绘制体外释放曲线，计算RSV的累计释放度。
1.5.3 BMSCs在水凝胶中的活性考察
将BMSCs与RSV-LIP和水凝胶一起共孵育，使用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测BMSCs生存情况。取生长状态良好的BMSCs，将1
$ \times $ 105个细胞接种到共聚焦皿中，并加入灭好菌的水凝胶及RSV-LIP，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。培养1、4 d后，用 Calcein AM/PI检测工作液检测。激光共聚焦显微镜观察染色效果，活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。1.6 BMSCs联合RSV-LIP的体外药效学考察
1.6.1 BMSCs联合RSV-LIP对神经元细胞ROS的抑制作用
以TBHP制备神经元细胞氧化应激损伤模型。分组为对照组、TBHP组、BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组和BMSCs+RSV-LIP组。取对数生长期的HT22细胞接种至24孔板，37℃孵育24 h后，每孔加入1 ml培基稀释的TBHP（10 μg/ml），37℃孵育24 h后吸弃上清液，按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×105个/孔，37℃孵育48 h。使用活性氧检测试剂盒检测各组ROS水平，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex/Em=488/525 nm）。
1.6.2 BMSCs联合RSV-LIP对小胶质细胞炎症因子 TNF-α的抑制作用
以LPS制备小胶质细胞炎症损伤模型。分组为对照组、LPS组、BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组和BMSCs+RSV-LIP组。取对数生长期的BV2细胞接种至24孔板，37℃孵育24 h后，每孔加入0.10 μg/ml的 LPS，37℃孵育24 h后吸弃上清液。按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×105个/孔，37℃孵育24 h。取细胞上清液，收集于离心管内，使用ELISA 试剂盒检测TNF-α水平，酶标仪 450 nm检测吸光度值。
1.6.3 BMSCs联合RSV-LIP对NE-4C细胞的诱导迁移作用
构建划痕损伤模型。分组为对照组、BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组和BMSCs+RSV-LIP组。取对数生长期的NE-4C接种至24孔板，细胞密度达80%～90%后用1 ml枪头在细胞层上进行划痕。划痕结束后，使用PBS洗细胞1次，按分组加入各组样品，其中RSV为10 μg/ml，BMSCs为1×105个/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养。0、12、24 h观察各组细胞的迁移情况并拍照。
1.7 载BMSCs+RSV-LIP水凝胶的体内药效学考察
1.7.1 TBI小鼠模型的构建及给药
C57小鼠（雄性，8周龄）随机分组：Sham组（假手术组）、对照组（造模后不给药）、载BMSCs水凝胶组、载RSV-LIP水凝胶组、载BMSCs+RSV-LIP水凝胶组，每组6只。
建立控制皮质冲击（CCI）损伤模型。腹腔注射1%（w/v）戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠（50 mg/kg），固定于脑立体定位仪，沿头顶正中线做约1 cm左右的纵向切口，暴露出头骨。在前囟后约1 mm，冠状缝右侧约2 mm位置，钻出一个直径为4 mm 圆形孔。设置仪器工作参数：冲击速度为5 m/s，冲击深度为1.0 mm，冲击持续时间为100 ms，对小鼠脑部进行撞击。撞击结束后按分组进行处理，脑损伤原位注射20 μl含药凝胶（BMSCs：1×106个/只，RSV：0.9 mg/kg），消毒伤口并进行缝合。
1.7.2 载BMSCs+RSV-LIP水凝胶对TBI小鼠运动感觉功能的作用
改良神经功能损害（mNSS）评分实验。根据mNSS评分标准，对各组TBI小鼠的运动、感觉、平衡能力以及反射反应等情况予以评估。mNSS评分为0～18分，分数越高表明TBI小鼠的神经功能损伤越严重。本实验于TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d进行评估。
踏空实验。TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d将各组TBI小鼠放置在铁丝网格随机的位置上，观察并记录其行走的总步，以及在移动过程中踩空的次数。计算踩空次数和总步数的比值，比值越大说明TBI小鼠的神经损伤越严重。
悬挂实验。水平悬空固定一根钢针，TBI术后1、2、3、4、5、6、7、9、11、14 d依次将各组TBI小鼠挂在钢针的中间，观察并记录其在钢针上悬挂的时间及状态。评分标准为： ①脱落（0分）；②仅悬挂在钢针上（达30 s），但无法移动（1分）；③前爪挂在钢针上，同时后爪试图挂钢针上（2分）；④2只前爪和1只或2只后爪挂在钢针上（3分）；⑤4只爪子都挂于钢针，且尾巴卷在钢针上（4分）；⑥爬到了一侧固定的架子上（5分）。分值越低说明TBI小鼠的神经损伤越严重。
1.8 统计学处理
采用GraphPad Prism 9（GraphPad Software, San Diego, CA）计算。两组间数据的比较采用Unpaired Student’s T-test，多组间的数据比较采用One-way ANOVA。以P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异非常显著。
2. 结果
2.1 BMSCs的培养及在水凝胶中的活性考察
如图1所示，BMSCs与RSV-LIP和水凝胶共培养1、4 d，激光共聚焦显微镜观察显示绿色荧光细胞较多，BMSCs生长状况良好，随着时间的延长，死细胞的比例增加，活细胞也有所增加，说明装载RSV-LIP的水凝胶支架对细胞活性无影响，具有较好的生物相容性。
2.2 RSV-LIP的制备与表征
2.2.1 RSV-LIP的粒径和Zeta电位
RSV-LIP的粒径、Zeta电位分别为（127.80±0.41） nm，（−4.90±0.51） mV。
2.2.2 RSV-LIP的包封率和载药量
RSV-LIP中RSV的包封率为（78.50%±1.48%），载药量为（2.37%±0.06%）。
2.3 载RSV-LIP水凝胶色谱分析方法的建立
2.3.1 专属性、线性和范围
如图2所示，方法专属性良好，RSV保留时间为5.90 min，空白载体对RSV测定无干扰。1~200 µg/ml浓度范围内，RSV浓度（C, μg/ml）与峰面积（A）呈良好线性关系，线性回归方程为 A=1.953 8 C+3.012 3，R2=
0.9998 。2.3.2 精密度和回收率
由表1可知，低、中、高浓度RSV在日内和日间均具有良好的精密度，日内精密度和日间精密度RSD均小于5%，表明所建立方法的精密度满足要求，可用于样品中RSV的含量测定。
表 1 RSV的HPLC色谱分析法精密度（$\bar x $ ±s, n=3）浓度
（μg/ml）日内 日间 $ \bar x $±s RSD（%） $ \bar x $±s RSD（%） 100 104.40±0.22 0.21 103.40±0.25 0.24 20 24.03±0.13 0.54 2.48±0.23 1.02 4 3.80±0.02 0.53 3.78±0.03 0.79 由表2可知，低、中、高浓度RSV的回收率均在95%～115%范围内，且RSD值均小于等于5%，表明该方法稳定可靠，可用于样品中RSV含量的测定。
表 2 RSV的HPLC色谱分析法回收率（$\bar x $ ±s, n=3）加样浓度（μg/ml） 回收浓度（μg/ml） 回收率（%） RSD（%） 100 107.70±0.03 107.10 0.03 20 20.99±0.02 104.60 0.10 4 4.02±0.02 100.20 0.50 2.3.3 水凝胶中RSV的释药
载RSV-LIP的水凝胶前2 h累计释放RSV约15%，在24、48和72 h的累计释药量分别是（39.57%±0.36%）、（42.23%±0.13%）和（43.31%±0.34%），具有明显的缓释作用。
2.4 BMSCs联合RSV-LIP的体外药效学考察
2.4.1 BMSCs联合RSV-LIP对HT22细胞ROS的抑制作用
如图3所示，BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组和BMSCs+RSV-LIP组ROS水平均低于TBHP组，其中，BMSCs+RSV-LIP组差异显著（P<0.001），说明BMSCs和RSV均具有抗氧化应激损伤的作用，合用具有协同增效的作用。
2.4.2 BMSCs联合RSV-LIP对BV2细胞炎症因子 TNF-α的抑制作用
如图4所示 BMSCs组、RSV组、RSV-LIP组、BMSCs+RSV-LIP组的TNF-α水平均低于LPS组（P<0.001），说明BMSCs和RSV均具有抗炎作用。其中，BMSCs+RSV-LIP组、RSV-LIP组的抗炎作用显著高于RSV组（P<0.01）、BMSCs组（P<0.001），说明RSV以脂质体形式给药具有显著抗炎作用。
2.4.3 BMSCs联合RSV-LIP对NE-4C细胞的诱导迁移作用
如图5所示，比较0、12和24 h划痕宽度，BMSCs组和BMSCs+RSV-LIP组NE-4C细胞迁移速度明显较快，表明BMSCs可以促进神经干细胞迁移，有助于损伤神经系统的再生修复。
2.5 载BMSCs+RSV-LIP水凝胶的体内药效学考察
如图6A所示，BMSCs+RSV-LIP水凝胶组悬挂得分显著高于对照组（P<0.001），RSV-LIP水凝胶组得分显著高于对照组（P<0.001）。如图6B所示，BMSCs水凝胶组、RSV-LIP水凝胶组、BMSCs+RSV-LIP水凝胶组踏空概率均显著低于对照组（P<0.001）。如图6C所示，BMSCs+RSV-LIP水凝胶组mNSS评分低于对照组（P<0.01），综合说明载BMSCs+RSV-LIP水凝胶可以改善TBI小鼠肢体协调能力和平衡功能，促进TBI小鼠感觉运动功能的恢复。
图 6 BMSCs联合RSV-LIP水凝胶改善TBI小鼠运动感觉功能（n=6）A. 悬挂实验；B. 踏空实验；C. mNSS得分**P<0.01，***P<0.001, 与对照组比较。3. 讨论
MSCs用于再生医学的多种机制及作用得到广泛研究，MSCs在中枢神经的修复中，不仅可以促进内源性神经干细胞的增殖、迁徙和分化[19]，同时具有抗炎作用[20]以及促进受损BBB恢复[21]等功能。但是干细胞移植治疗还存在一些问题，受损和病变组织内的恶劣环境不利于干细胞的有效保留、存活和增殖[22]。创造有利于干细胞局部驻留发挥活性的的微环境，成为提高干细胞移植疗效的重要举措。白藜芦醇可以抑制神经炎症和细胞凋亡，减少梗死体积和神经元损伤，改善神经功能[23-24]。白藜芦醇通过对NF-κB活化途径的抑制，抑制巨噬细胞分泌细胞因子，减轻炎症反应，还可以抑制脂质过氧化。研究发现，白藜芦醇可以剂量依赖性抑制IL-1α、IL-6和TNF-α的产生，并在体外下调IL-17的mRNA表达和蛋白质分泌[25]。Guo等[26]亦证实白藜芦醇可以明显抑制巨噬细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，下调了toll样受体4（TLR4）/NF-κB/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白表达，具有显著的抗炎、抗氧化机制[27]。但是白藜芦醇在碱性条件下稳定性降低，对光敏感易降解，水溶性差[28]，研究人员对多种递送系统如脂质体、微乳、纳米囊泡等进行了研究，用以控制白藜芦醇的稳定性和释放[29]。本研究中将白藜芦醇制备为脂质体，形成水分散系统从而有利于在水凝胶中分散，同时药物从脂质体中缓慢释放，从而持续发挥治疗作用。干细胞在水凝胶中的生物活性对其发挥作用很重要，本研究发现在载有白藜芦醇脂质体的水凝胶中，细胞的生存状态良好，说明BMSCs可以在水凝胶中维持较好的活性。
水凝胶具有三维交联的聚合物网络，能够提高细胞移植滞留和存活率，控制药物释放速度，常被用作治疗载体实现局部或全身药物输送。本文构建了的温敏水凝胶支架，包载BMSCs和RSV-LIP发挥协同作用。研究表明，内源性的神经干细胞的再生和分化在TBI损伤的情况下受到抑制，BMSCs具有促进神经干细胞增值的作用，同时白藜芦醇具有显著的抗炎和抗ROS活性，二者联合将改善TBI损伤后微环境，促进内源性神经干细胞的迁徙。同时水凝胶可以模拟细胞外微环境，为BMSCs驻留和活性保持提供适宜环境。水凝胶的基质材料为透明质酸和丝素蛋白，均为天然的高分子材料，透明质酸是构成细胞ECM的重要组成部分，丝素蛋白具有天然的降解特性，被FDA批准用于医药辅料，因此制备的水凝胶具有良好的生物相容性，可赋予细胞生长驻留的空间，提供支架环境以利于细胞增殖和活性保持，载体同时具有生物降解特性，安全性好适宜用于中枢给药。
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表 1 检索式及检索结果
检索条件 各数据库检索结果 中国知网 万方数据 维普 PubMed Web of Science （主题=双室袋 + 粉液双室袋）OR（主题=双腔袋）
OR（主题=多室袋）OR（主题=多腔袋）80 （（（（任意字段=双室袋 OR 任意字段=粉液双室袋）OR 任意字段=多室袋）OR 任意字段=双腔袋）OR 任意字段=多腔袋） 189 主题=（双室袋）OR 主题=（粉液双室袋）OR 主题=（多室袋）
OR 主题=（双腔袋）OR 主题=（多腔袋）6740 （Multi chamber bag）OR（dual chamber bag） 42 （Multi chamber bag）OR （dual chamber bag） 166 
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表 2 已发表文献使用的评价指标
评价维度 判别可用指标 有效性 药液稳定性、配制浓度准确性、药液残留量 安全性 不溶性微粒、刺伤划伤等意外事情发生率 经济性 配制成本a、废弃物重量、住院成本、血液感染发生率 适宜性 配制时间、平均医护人员人力占用、包装重量和
储运体积b、环境适应性、废弃物处理难易程度可及性 生产厂家数量、产品原材料供应能力、患者可负担性 a：为药液成本、配制用品以及配制人工成本的总和；b：包括药液配制过程所需用品储运体积总和，传统粉针剂产品的配制用品包括注射器、西林瓶粉针、配制用溶剂等，粉-液双室袋产品仅包括产品本身。
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表 5 配制过程不溶性微粒比较
文献作者 样品 不溶性微粒数（个/ml） ≥5 ≥8 ≥10 ≥12 ≥25 ≥100 李英等[15]a 粉针输液产品 318 66 21 6 0 0 配制增加微粒数b 285 55 15 3 0 0 双室袋输液产品 2 0 0 0 0 0 双室袋增加微粒数c 0 0 0 0 0 0 沈敏娜等[16]a 粉针输液产品 322 68 23 7 0 0 配制增加微粒数 289 55 17 5 0 0 双室袋输液产品 3 1 0 0 0 0 双室袋增加微粒数c 0 0 0 0 0 0 王宇航等[8]a 粉针输液产品 240 326.5 43 24 7 0 双室袋输液产品 240 2 0 0 0 0 罗莉等[10]d 粉针输液产品 219.52±84.73 43.93±21.68 14.93±7.96 4.05±2.60 0.01±0.04 双室袋输液产品 3.49±0.95 0.39±0.19 0.20±0.11 0.13±0.09 0.03±0.03 a：实验重复配制（均≥100份），由于数据资料不服从正态分布，选中位数表征平均水平，表中均为中位数值；b：增加微粒数=溶液微粒数−（粉体+液体），表示溶配方法增加的不溶性微粒；c：双室袋法配置的不溶性微粒增加数计算结果为负值，由于混合前为取出粉末后在非封闭的环境中进行溶解测试，而混合后则是在封闭的袋内进行开通溶解后测试，从而导致粉体检测结果高于混合液的情况出现，因此即配型双室袋法配置的不溶性微粒增加数视为零；d：本实验所取数据为不溶性微粒数范围值。
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