大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

毛泽玲; 文波

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

毛泽玲^1,,
文波^2, ,

1.
浙江省桐庐县中医院, 浙江杭州 311500
2.
浙江桐君堂中药饮片有限公司, 浙江杭州 311500

基金项目: 杭州市卫生科技计划项目（B20210302）

详细信息

作者简介:
毛泽玲，主管中药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究，Tel：15757165880，Email：876231359@qq.com

通讯作者: 文　波，高级工程师，研究方向：中药质量标准研究，Tel：18067998908，Email：wenborin@126.com

HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

MAO Zeling^1
,,
WEN Bo^{2
, ,}

1.
Department of Traditional Chinese Medicine, TCM Hospital of Tonglu County, Hangzhou 311500, China
2.
Zhejiang Tong Jun Tang Chinese Medicine decoction Piece Co., Ltd., Hangzhou 311500, China

摘要: 目的建立不同种大黄的HPLC特征指纹图谱和禁用农药残留检测方法，并综合评价其药材质量。方法收集3种大黄共20批，采用HPLC法进行分析，流动相为甲醇-0.1 ％磷酸溶液；梯度洗脱；柱温35 ℃；检测波长254 nm；流速1.0 ml/min；并对结果进行聚类分析。采用直接提取法，并建立HPLC-串联质谱法，气相色谱-串联质谱法，对不同来源、产地大黄的33种禁用农药进行检测。结果掌叶大黄、唐古特大黄、药用大黄3种来源大黄的指纹图谱与其对照指纹图谱的相似度均>0.95，聚类分析将20批大黄样品分为3类。不同产地的大黄样品均未检出33种禁用农药。结论 3种大黄药材质量差异较大，建立的HPLC指纹图谱和禁用农残的方法稳定、可靠、简便准确,可以为大黄的质量控制评价提供依据。
- 大黄 /
- 指纹图谱 /
- 禁用农药残留
Abstract: Objective To establish the HPLC fingerprint and pesticide residue detection methods for different kinds of rhubarb, and evaluate the quality of rhubarb comprehensively. Methods 20 batches of three types of rhubarb were collected and analyzed by high-performance liquid chromatography. The mobile phase was methanol-0.1 % phosphoric acid solution; gradient elution; column temperature of 35 ℃; detection wavelength of 254 nm; flow rate 1.0 ml/min. And cluster analysis was performed on the results. Direct extraction method was used and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry were established, 33 prohibited pesticides from different sources and origins of rhubarb were detected. Results The similarity among the fingerprint spectra of three sources of rhubarb, namely Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim.ex Balf., and Rheum officinale Bail1., and their control fingerprint spectra was>0.95. 20 batches of rhubarb samples were divided into 3 categories by cluster analysis. 33 prohibited pesticides were detected in rhubarb samples from different regions. Conclusion The quality of three kinds of rhubarb was significantly different. The established HPLC fingerprint and the method of banning agricultural residues were stable, reliable, simple and accurate, which could provide a basis for quality control evaluation of rhubarb.
- rhubarb /
- fingerprint /
- forbidden pesticide residues

高脂血症是指血液中脂质水平异常，通常表现为总胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低^[1]。高脂血症是心脑血管疾病的重要危险因素，可诱发动脉粥样硬化，导致冠心病、脑卒中、心肌梗死，增加心脑血管疾病的发病率和病死率。因此，预防和控制高脂血症具有重要意义^[2]。国内外研究和临床实践证明，血脂异常是可以预防和控制的。胆固醇水平降低可显著减少心肌梗死、缺血性卒中事件、心血管死亡，提高心血管病患者的生活质量，有效减轻疾病带来的负担^[3]。据统计全球每年约有3000万人死于高脂血症等脂代谢紊乱疾病，且呈逐年增长趋势^[4]。

姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎中提取的一种多酚类物质^[5]。它被认为是姜黄中最重要一类活性成分，具有一系列药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、细胞保护和降低血脂等^[6]。有研究表明，姜黄素对氧化应激、抑制癌症和炎症的进展有显著疗效^[7]。此外，姜黄素的降脂作用也被广泛研究。综上所述，姜黄素可作为一种潜在的候选药物用于控制高脂血症所诱导的疾病，如动脉粥样硬化。众所周知，他汀类药物是一种临床常用的治疗高胆固醇血症和相关动脉粥样硬化疾病的处方药，而目前姜黄素已被证明在降低血浆总胆固醇和甘油三酯方面与他汀类药物疗效相当。然而姜黄素存在溶解度低和渗透差的问题，从而导致其口服给药时药物生物利用度低，对于高脂血、动脉粥样硬化等需要达到一定血药浓度为疗效前提的病症来说，姜黄素的传统剂型与市售剂型均无法达到理想的治疗效果。

本研究前期成功构建了姜黄素纳米乳口服给药系统，改善了姜黄素水溶性差的特性。基于此，本文继续探究了姜黄素纳米乳在大鼠体内的药动学特性，观察其对高脂血症模型大鼠的治疗作用，为姜黄素的临床应用提供更多的理论依据。

1. 仪器与试药

1.1 仪器

101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Agilent 6410 Triple Quad LC/MS（美国Agilent科技有限公司）；全自动生化分析仪Chemray 240 （深圳雷杜生命科技有限公司）；微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

1.2 药品与试剂

姜黄素原料药（批号XC20190521，西安小草植物科技有限公司）；姜黄素对照品（批号1108135-201412，纯度>99.8 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20190418，上海凌峰化学试剂有限公司）；Tween-80（批号2018161，上海凌峰化学试剂有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号18139，上海嘉法狮贸易有限公司）；高脂饲料（批号20036219，常州鼠一鼠二生物科技有限公司）；姜黄素片（批号20190925，美国自然之宝^®股份有限公司）；辛伐他汀片（SV，批号J20190011，舒降之^®杭州默沙东制药公司）；TG试剂盒（批号2020012）、TC试剂盒（批号2020006）、HDL-c试剂盒（批号2020003）、LDL-c试剂盒（批号2020010，长春汇力生物技术有限公司）；SOD试剂盒（批号20200617）；MDA试剂盒（批号20200720）；肝脏匀浆TG试剂盒（批号20200810）；肝脏匀浆TC试剂盒（批号20200411，南京建成有限公司）；乌来糖（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；水为重蒸水。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，SPF级，体重（180±20）g，海军军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2019-0004。温度：20~25 ℃；相对湿度：40 %~70 %；饮用水：高压灭菌，符合SPF级动物饮用水标准；光照条件：人工光线，12 h照射，12 h黑暗。

2. 方法与结果

2.1 姜黄素纳米乳的制备

姜黄素纳米乳的处方如下：油相Capryol 90在体系中占比为33.10 %，表面活性剂Tween-80为 34.16 %，助表面活性剂1,2-丙二醇为17.21 %，水相占比为15.52 %。制备方法为：精密称取处方量油相Capryol 90、表面活性剂Tween-80和助表面活性剂1,2-丙二醇，混合置于锥形瓶中，于45 ℃ 恒温搅拌至全溶，称取适量姜黄素原料药，搅拌至原料药完全溶解于上述体系中，冷却至室温后向体系中缓慢滴加蒸馏水至体系变为透明均匀的液体，即得姜黄素纳米乳，测得载药量为0.919 mg/g。对姜黄素纳米乳进行特性表征，结果表明所制备的纳米乳粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（123.5±1.2）nm，PDI为(0.204±0.07)，表明该制剂的粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图1所示。结果表明，纳米乳呈圆整均一的球体或类球体，具明显层状结构，粒径大小约为123.5 nm。

图 1 最优处方纳米乳的透射电镜图

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2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立

2.2.1 色谱质谱条件^[8]

色谱条件：色谱柱：Dikma Inspire C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流动相：乙腈-0.1 %（V/V）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.3 ml/min；进样量：5 μl；柱温：35 ℃。

质谱条件：ESI离子源，正离子化模式，扫描方式为多反应监测（MRM模式），干燥气温度：350 ℃，干燥气流速：10 L/min，雾化压力：35 psi，裂解电压145eV，碰撞能量30 eV，定量离子对为m/z=369.3→286.4和m/z=369.3→177.0。

2.2.2 方法学考察

取7份大鼠空白血浆，每份600 μl，分别加入各浓度姜黄素标准品溶液 600 μl，涡旋震荡2 min，再加入1 000 μl甲醇及2 000 μl乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡5 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。上清液用氮气吹干，1 000 μl甲醇复溶，过0.22 μm针式微孔滤膜，所得滤液即加药血浆样品。同法处理空白血浆。按2.2.1项下条件进样测定，记录色谱图及峰面积。方法学考察表明，血浆中姜黄素在2.00~500.00 ng/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y = 411.32 X+2071.88（r= 0.999 9）。专属性考察结果表明，血浆内源物质对姜黄素的含量测定没有干扰，方法专属性良好（结果如图2）。低、中、高3个浓度的姜黄素-血浆溶液的日内精密度分别为0.54 %、1.21 %、0.93 %，日间精密度分别为0.91 %、0.76 %、0.42 %。3个浓度血浆中的姜黄素提取回收率分别为72.9.2%、78.3%、80.2%，表明该方法可用于血浆中姜黄素的含量测定。

图 2 姜黄素血浆样品的专属性

A.含药血浆；B.空白血浆；C.姜黄素对照品

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2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究

2.3.1 给药方案

18只大鼠随机分为3组（姜黄素原料药组、姜黄素片剂组、姜黄素纳米乳组），每组6只，适应性饲养3 d后，禁食不禁水12 h。3组大鼠分别给予姜黄素原料药混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）、姜黄素片剂粉末混悬液（62.8 mg/kg，以姜黄素含量计算）各1 ml，姜黄素纳米乳（31.4 mg/kg，以姜黄素含量计算）2 ml。于灌胃给药后的0、1、2、4、8、12、16、24、30、36 h时眼球后静脉丛取血1 ml，置预肝素化离心管中，上下颠倒混匀后3 000 r/min离心15 min，上清液即为含药血浆样品。吸取含药血浆样品600 μl，照“2.2.2”项下方法处理，上清液照“2.2.1”项下色谱条件进样测定。

2.3.2 药动学参数计算

药动学参数计算通过软件Kinetica 5.0对数据进行分析处理得到，计算结果如图3及表1所示。结果表明，与原料药相比，片剂的相对生物利用度为112.10 %，纳米乳的相对生物利用度为313.47 %。与纳米乳组相比，原料药组的c_max为201.48 %，片剂组的c_max为193.02 %，且平均滞留时间（MRT）比原料药组及片剂组更高（为原料药组的183.52 %，是片剂组的154.21 %），表明纳米乳组具有延缓药物吸收的效果，从而在更大程度上发挥稳定血药浓度，提高药物生物利用度的作用。

图 3 各给药组姜黄素的血药浓度-时间曲线 ($\bar x $±s，n=6)

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表 1 各给药组姜黄素的药动学参数($\bar x $±s，n=6)

	原料药组	片剂组	纳米乳组
c_max (ng/ml)	116.18±11.33	121.27±12.12	234.08±17.55
T_max (t/h)	2.00±0.00	2.00±0.00	4.00±0.00
AUC_0→36(ng·h/ml)	1151.12±125.77	1341.34±103.59	2914.42±323.15
AUC_0→∞(ng·h/ml)	1202.71±115.28	1348.77±131.39	3770.15±333.28
t_1/2 (t/h)	6.66±0.33	7.52±0.51	12.17±0.35
MRT(t/h)	9.89±0.59	11.77±0.31	18.15±0.38

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2.4 药效学研究

2.4.1 动物分组、造模及给药

取SD大鼠56只，进行为期一周的适应性饲养后随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=48），空白组饲喂正常饲料，模型组饲喂定制高脂饲料（饲料含2-硫氧嘧啶0.2 %，可可脂17.18 %，胆固醇1.25%，蔗糖12.5 %，胆盐0.22 %）。整个造模周期为16 d，造模期间每日观察各组大鼠的精神、活动、食量、排便量变化等。结束造模后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于眼球后静脉丛取血1 ml，室温静置30 min，3 000 r/min离心20 min，取上层血清检测各项生化指标（TC、TG、HDL-c、LDL-c）^[9,10]。

造模成功后将上述模型组大鼠再随机分为模型组、姜黄素片剂组、阳性药（SV）组和姜黄素纳米乳低、中、高剂量组，每组8只。空白组（A组）及模型组（B组）给予生理盐水5 ml/ (kg·d)；阳性药组（C组）给与辛伐他汀20 mg/ (kg·d)（以辛伐他汀含量计）；姜黄素片剂组（D组）给与姜黄素片 62.8 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计）；姜黄素纳米乳低（E组）、中（F组）、高（G组）3组给药剂量分别为15、30、60 mg/ (kg·d)（以姜黄素的含量计），连续21天灌胃给药。第21天给药结束后，各组大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1 ml离心取血清待测。

2.4.2 统计学处理

实验所得数据采用SPSS Statistics 22.0统计软件进行处理，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，其中组间比较采用LSD法，两两比较采用独立样本t检验；若方差不齐，采用非参数检验。实验结果均以（$\bar x $ ±s）表示，P<0.01表示具极显著性差异，P<0.05表示具显著性差异。采用 GraphPad Prism 6 绘制图表。

2.4.3 肝脏指数

大鼠颈椎脱臼处死，称定体重后解剖取肝脏，冰PBS洗净血迹，称定肝脏湿重并记录，计算肝脏指数；肝脏指数=肝脏湿重/体重×100 %。

图4为给药前后各组大鼠的体重变化。结果表明，给药3周后，与空白组相比，各组均存在极显著性差异（P<0.001）。给药的前2周纳米乳组的体重均表现出正向增长趋势，而模型组、阳性药组以及姜黄素片剂组体重则呈现负增长情况；给药第3周时，仅姜黄素纳米乳高剂量组的体重出现正向增长，阳性药组以及姜黄素纳米乳低、中剂量组大鼠体重降低幅度略有缩小但仍呈下降趋势。

图 4 给药前后大鼠体重变化

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实验结束后剖取大鼠肝脏，肉眼观察到空白组大鼠的肝脏呈现出鲜红色且有光泽，边缘清晰锐利，质地软，与周围组织无明显黏连；模型组大鼠的肝脏肥大，色泽偏黄，边缘圆钝，质地稍硬，且表面的白色沉积明显，与周围组织黏连明显。各给药组大鼠的肝脏比空白组略大，颜色呈不同程度的泛黄白带红，其中以姜黄素纳米乳中剂量组肝脏的颜色与空白组最为接近。

肝脏湿重：如图5所示，除空白组外，各给药组与模型组间均无显著差异，但各给药组肝脏湿重与空白组均具极显著性差异（P<0.001）；

图 5 肝脏湿重以及肝脏指数变化（$\bar x $±s，n=8）

^*P<0.05，^**P<0.001，与空白比较，；^#P<0.05，^##P<0.001，与模型组比较。

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肝脏指数：如图5所示，除姜黄素纳米乳低剂量组外，其他各给药组与模型组之间均存在显著性差异，表明肝脏指数的降低与药物剂量间存在依赖性。阳性药组和片剂组肝脏指数尚未恢复到正常水平，推测原因可能是阳性药和片剂的给药周期还不能完全抵消造模导致的肝脏增重所致。

2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片

取肝脏左、右外叶上端分别于多聚甲醛中固定，脱水，切片，染色后置于光镜下观察。图6为肝脏的HE染色切片。其中A组肝细胞排列整齐，呈索状，内壁边界清晰，无中性粒细胞浸润，仅有零星小泡性脂肪病变；B组视野内可见明显的弥漫性大泡性脂肪病变，肝细胞肿胀，胞浆基质疏松，淡染，存在严重的气球样病变，可见Mallory小体，肝小叶边界不清，汇管区肿大，呈现中性粒细胞浸润，存在重度的肝细胞脂变率；C组和D组以中轻度脂肪病变为主，脂肪细胞占比显著减少；E组汇管区细胞排列比C、D两组更为整齐，肝细胞整体肿胀程度减轻，大泡性脂肪病变仅存在于Ⅲ带，炎性浸润程度减轻，水样病变减轻；F组和G组以小泡性脂变为主，少见大泡性脂变。

图 6 各组大鼠肝脏病理切片H&E染色（200×）

A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；黑色箭头指大泡样脂肪病变，黄色箭头指小泡样脂肪病变，黄色无柄箭头指气球样病变，黑色无柄箭头指Mallory小体。染色结果：空泡为脂滴，细胞核为蓝紫色，细胞质为紫红色。

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图7为油红O染色切片。A组大鼠肝细胞结构完整，细胞核颜色明显；B组肝细胞存在大片鲜艳脂滴，细胞核萎缩、色浅，存在重度脂肪病变；C组和D组仍存在大片连续脂滴，但汇管区附近脂滴颜色明显变淡；E组Ⅲ带脂滴色浅且小；F组和G组视野内所见均为浅色小脂滴，细胞核体积趋向空白组细胞核体积。

图 7 各组大鼠肝脏病理切片油红O染色（200×）

A.空白组；B.模型组；C.阳性药组；D.姜黄素片剂组；E.姜黄素纳米乳低剂量组；F.姜黄素纳米乳中剂量组；G.姜黄素纳米乳高剂量组；染色结果：脂滴呈橘红色至鲜红色，细胞核呈蓝色。

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2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平

第21天给药结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第22天眼球后静脉丛取血1ml，室温静置2 h后3 000 r/min离心15 min取血清，按试剂盒操作说明检测血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平。

给药3周后，大鼠血清中各生化指标变化如表2所示。与模型组相比，姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量组对TC降低效果均有统计学意义（P<0.001），其中，以中剂量组为佳，低剂量组对LDL-c的改善效果更为明显。对于血清中TG、TC的改善情况，与阳性药组相比，纳米乳低、中、高3个剂量组之间差异无统计学意义（P<0.05）；中、高剂量组TC与HDL比值的降低具有统计学意义（P<0.05），表明血脂比存在纳米乳剂量依赖性。

表 2 大鼠血清中TG、TC、HDL-c、LDL-c的表达水平及TC/HDL-C的变化趋势($\bar x $±s，n=8）

组别	TG（mmol/L）	TC（mmol/L）	HDL-c（mmol/L）	LDL-c（mmol/L）	TC/HDL
空白组	1.34±0.09	2.90±0.44	0.31±0.10	1.88±0.17	9.35±0.41
模型组	2.88±0.51	12.45±0.13	1.84±0.10	3.56±0.66	6.77±1.14
阳性药组	1.41±0.25^##	10.81±0.36^##	3.03±0.53^#	2.87±0.20^##	3.57±0.47
姜黄素片剂组	1.79±0.22^##	11.24±1.21	3.42±0.42^#	4.08±0.32	3.29±0.89
姜黄素纳米乳低剂量组	1.29±0.20^##	8.88±0.73^##	2.39±0.62^##	2.85±0.33^#	3.72±0.57^#
姜黄素纳米乳中剂量组	1.44±0.04^##	7.68±0.34^##	1.94±0.78^##	2.57±0.82	3.96±0.36^#
姜黄素纳米乳高剂量组	1.38±0.28^##	8.89±0.64^##	1.83±0.34^##	2.85±0.67	4.86±0.49^##
^P<0.05，^*P<0.001，与空白组比较；^#P<0.05，^##P<0.001，与模型组比较

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2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平

将肝脏分为4份，一份置于−80 ℃冷冻保存，一份按如下步骤处理后待测：冰PBS冲洗肝组织表面血迹→研磨后制成10 %匀浆→离心→取上清液→测定各生化指标。

给药3周后大鼠肝脏匀浆中各生化指标表达水平如表3所示。结果表明，模型组肝脏匀浆中TG、TC表达水平的增幅与空白组相比具有统计学意义（P<0.001）；给药3周后，阳性药组和纳米乳低、中剂量组的TG、TC表达水平与模型组相比均有统计学差异（P<0.001），姜黄素纳米乳低、中、高3个剂量对大鼠肝脏中TG、TC表达水平的降低均具有统计学意义（P<0.05），其中，低剂量组效果最佳，这也与血清中TC水平变化趋势相一致。

表 3 大鼠肝脏匀浆中TG、TC、SOD以及MDA的变化趋势（$\bar x $±s，n=8）

组别	TG（mmol/L）	TC（mmol/L）	SOD（U/mgprot）	MDA（nmol/mgprot）
空白组	0.42±0.16	0.11±0.03	956.31±142.64	0.47±0.06
模型组	0.69±0.05^**	0.09±0.02^**	769.26±141.64^**##	1.98±0.26^**
阳性药组	0.50±0.11^*##	0.7±0.01^*##	988.25±168.90^##	0.64±0.15^*##
姜黄素片剂组	0.66±0.10^**#	0.04±0.01^*##	933.99±103.39^#	0.79±0.11^**
姜黄素纳米乳低剂量组	0.64±0.07^**##	0.06±0.02^*##	972.23±142.10^##	0.80±0.03^**#
姜黄素纳米乳中剂量组	0.58±0.05^**##	0.07±0.02^**##	916.55±117.32^#	0.59±0.09^##
姜黄素纳米乳高剂量组	0.54±0.13^##	0.10±0.03^**	799.81±121.85^**	0.70±0.23^*##
^P<0.05，^*P<0.001，与空白组比较；^#P<0.05，^##P<0.001，与模型组比较

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超氧化物歧化酶（SOD）是机体内重要的抗氧化酶，能催化自由基清除反应，保护细胞免受自由基的攻击，明显改善肝肾等组织的氧化损伤，能直观的反映体内抗氧化酶的活性^[11]。MDA是脂质过氧化反应的产物，反映了自由基的活跃程度，可用于评价机体内脂质过氧化的程度^[12]。因此，选择SOD和MDA作为评价高脂血症大鼠肝功能损伤程度的指标。

给药3周后，与模型组相比，阳性药组及姜黄素纳米乳低剂量组均能够上调大鼠肝脏中SOD的表达水平（P<0.001），姜黄素纳米乳中剂量组对其表达水平也有正向影响（P<0.05）；此外，实验中发现，与姜黄素纳米乳低、中剂量组相比，高剂量组对体内SOD的表达呈现出抑制，推测此现象与姜黄素的双向调节机制有关；对于MDA的表达水平，与模型组相比，阳性药组和姜黄素纳米乳各剂量组对其表达的抑制作用均具有统计学意义（P<0.001），但效果仍以中剂量组为佳。

3. 讨论

　　姜黄素是一种被广泛研究的中药多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和降血脂的药理活性。已有报道将他汀类与姜黄素对于改善血脂的功效进行了比较。他汀类药物是治疗高胆固醇血症和高脂血症的一线药物。研究表明，姜黄素在降低甘油三酯(TG)方面最有效，而他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面最有效。姜黄素影响血浆脂质改变的途径与他汀类药物相似^[13]。几乎所有胆固醇运输的途径都会受到药物制剂的影响，包括胃肠道对膳食中胆固醇的吸收、肝细胞对血浆胆固醇的清除、胆固醇逆向运输的介质以及从外周组织中清除胆固醇。此外，姜黄素的活性氧(ROS)清除能力降低了脂质过氧化的风险，而脂质过氧化会引发炎症反应，导致心血管疾病(CVD)和动脉粥样硬化^[14]。综上所述，姜黄素或可作为一种安全且耐受性良好的他汀类药物辅助药物，更有效控制高脂血症。

图 1 20批大黄叠加指纹图谱

T1-T5.唐古特大黄样品；Y1-Y7.药用大黄样品；Z1-Z8.掌叶大黄样品

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图 2 混合对照品及3种基原大黄对照图谱

A.混合对照品；B.唐古特大黄；C.药用大黄；D.掌叶大黄；1.芦荟大黄素；2.大黄素；3.大黄酚；4.大黄素甲醚

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图 3 大黄样品聚类分析树状图

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表 1 20批大黄采集信息表

编号	来源	产地	采集时间
1	唐古特大黄	青海海东	2021年9月
2	唐古特大黄	青海海东	2021年9月
3	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
4	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
5	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
6	药用大黄	四川绵阳	2021年9月
7	药用大黄	四川绵阳	2021年9月
8	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
9	药用大黄	湖北恩施州	2021年9月
10	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
11	药用大黄	湖北恩施州	2021年9月
12	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
13	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
14	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
15	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
16	掌叶大黄	甘肃宕县	2021年9月
17	掌叶大黄	甘肃宕县	2021年9月
18	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月
19	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月
20	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月

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表 2 梯度洗脱条件

时间（t/min）	流动相（A）	流动相（B）
0.0	10	90
5.0	25	75
45.0	60	40
60.0	70	30
70.0	80	20
90.0	80	20
90.1	10	90
100.1	10	90

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表 3 掌叶大黄相似度结果

序号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	对照
S1	1.000	0.969	0.993	0.989	0.980	0.976	0.995	0.986	0.991
S2	0.969	1.000	0.989	0.993	0.993	0.989	0.986	0.993	0.993
S3	0.993	0.989	1.000	0.997	0.993	0.990	0.998	0.998	0.999
S4	0.989	0.993	0.997	1.000	0.997	0.986	0.996	0.996	0.998
S5	0.980	0.993	0.993	0.997	1.000	0.982	0.989	0.994	0.995
S6	0.976	0.989	0.990	0.986	0.982	1.000	0.989	0.993	0.992
S7	0.995	0.986	0.998	0.996	0.989	0.989	1.000	0.996	0.998
S8	0.986	0.993	0.998	0.996	0.994	0.993	0.996	1.000	0.999
对照	0.991	0.993	0.999	0.998	0.995	0.992	0.998	0.999	1.000

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表 4 唐古特大黄相似度结果

序号	S1	S2	S3	S4	S5	对照
S1	1.000	0.992	0.987	0.996	0.990	0.996
S2	0.992	1.000	0.992	0.994	0.994	0.997
S3	0.987	0.992	1.000	0.987	0.998	0.996
S4	0.996	0.994	0.987	1.000	0.994	0.997
S5	0.990	0.994	0.998	0.994	1.000	0.998
对照	0.996	0.997	0.996	0.997	0.998	1.000

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表 5 药用大黄相似度结果

序号	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	对照
S1	1.000	0.984	0.964	0.996	0.978	0.992	0.978	0.996
S2	0.984	1.000	0.912	0.980	0.951	0.994	0.977	0.986
S3	0.964	0.912	1.000	0.975	0.977	0.938	0.941	0.964
S4	0.996	0.980	0.975	1.000	0.987	0.990	0.983	0.998
S5	0.978	0.951	0.977	0.987	1.000	0.976	0.984	0.987
S6	0.992	0.994	0.938	0.990	0.976	1.000	0.990	0.996
S7	0.978	0.977	0.941	0.983	0.984	0.990	1.000	0.991
对照	0.996	0.986	0.964	0.998	0.987	0.996	0.991	1.000

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表 6 流动相梯度洗脱程序

时间（t/min）	流动相A（%）	流动相B（%）
0~1	70	30
1~12	70→0	30→100
12~14	0	100

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表 7 线性参数表

农药	测定方法	线性范围（µg/L）	线性回归方程	相关系数
甲胺磷	LC-MS/MS	5.10~102	Y=5 757.95X-9 518.72	0.999 7
涕灭威亚砜	LC-MS/MS	9.95~199	Y=4 925.37X+2 962.42	0.999 2
久效磷	LC-MS/MS	3.00~60	Y=14 184.41X-13 024.63	0.999 6
涕灭威砜	LC-MS/MS	10.20~202	Y=7 266.57X-25 291.33	0.999 8
3-羟基克百威	LC-MS/MS	5.20~104	Y=3 651.39X-9 142.13	0.998 5
硫环磷	LC-MS/MS	3.10~62	Y=7 354.36X-5 852.39	0.999 7
苯线磷亚砜	LC-MS/MS	2.05~41	Y=655.91X-32.39	0.999 8
磷胺	LC-MS/MS	5.15~103	Y=3 005.51X-5 182.82	0.999 0
涕灭威	LC-MS/MS	10.10~202	Y=11 866.99X-36 969.07	0.999 6
甲磺隆	LC-MS/MS	4.85~97	Y=2 297.70X-1 847.56	0.999 1
苯线磷砜	LC-MS/MS	2.00~40	Y=1 208.50X-552.45	0.997 8
克百威	LC-MS/MS	5.05~101	Y=11 404.76X-20 949.40	0.998 8
氯磺隆	LC-MS/MS	5.05~101	Y=894.56X-339.12	0.999 7
甲拌磷亚砜	LC-MS/MS	2.05~41	Y=10 206.115X-5 030.10	0.999 8
胺苯磺隆	LC-MS/MS	5.00~100	Y=4 500.82X-6 147.15	0.998 6
内吸磷	LC-MS/MS	2.10~42	Y=6 926.58X-4 823.80	0.999 3
特丁硫磷	LC-MS/MS	2.00~40	Y=16 908.79X-7 218.66	0.999 8
甲拌磷砜	LC-MS/MS	1.95~39	Y=451.97X-397.40	0.995 4
水胺硫磷	LC-MS/MS	5.05~101	Y=13 593.18X-18 646.43	0.999 7
苯线磷	LC-MS/MS	2.00~40	Y=3 783.93X-1 458.19	0.999 3
灭线磷	LC-MS/MS	2.05~41	Y=6 444.63X-3 624.02	0.999 5
特丁硫磷砜	LC-MS/MS	2.10~42	Y=947.36X+163.48	0.998 7
氯唑磷	LC-MS/MS	1.00~20	Y=11 742.40X-2 819.51	0.999 6
硫线磷	LC-MS/MS	2.00~40	Y=9 943.19X-7 358.47	0.999 3
甲基异柳磷	LC-MS/MS	2.10~42	Y=20 034.52X-18 536.68	0.999 2
地虫硫磷	LC-MS/MS	2.05~41	Y=581.22X-921.56	0.999 5
蝇毒磷	LC-MS/MS	5.05~101	Y=527.96X-760.59	0.999 8
治螟磷	LC-MS/MS	2.05~41	Y=9 943.19X-7 358.47	0.999 3
甲拌磷	LC-MS/MS	2.05~41	Y=353.64X-30.70	0.999 2
杀虫脒	LC-MS/MS	2.10~42	Y=1.947 933X+0.014 093	0.995 3
α-六六六	GC-MS/MS	4.95~99	Y=4.880 537X-0.007 851	0.998 8
特丁硫磷	GC-MS/MS	2.10~42	Y=9.683 112X-0.016 638	0.996 1
β-六六六	GC-MS/MS	4.90~98	Y=4.061 750X-0.031 009	0.997 1
氟甲腈	GC-MS/MS	2.15~43	Y=2.987 868X+0.007 871	0.998 7
γ-六六六	GC-MS/MS	4.70~94	Y=3.840 197X+0.053 611	0.997 2
δ-六六六	GC-MS/MS	4.75~95	Y=5.344 570X-0.013 935	0.998 1
艾氏剂	GC-MS/MS	4.75~95	Y=1.527 440X+0.001 431	0.998 8
甲基对硫磷	GC-MS/MS	1.90~38	Y=3.734 819X+0.029 243	0.999 5
氟虫腈硫化物	GC-MS/MS	2.00~40	Y=5.988 870X+0.002 575	0.997 3
氟虫腈	GC-MS/MS	2.10~42	Y=3.631 274X-0.019 063	0.998 4
对硫磷	GC-MS/MS	2.00~40	Y=1.428 485X-0.010 180	0.999 6
三氯杀螨醇	GC-MS/MS	5.00~100	Y=9.069 256X-0.030 626	0.998 2
α-硫丹	GC-MS/MS	5.20~104	Y=0.695 002X+0.006 066	0.999 4
氟虫腈砜	GC-MS/MS	1.95~39	Y=2.529 407X-0.031 948	0.994 6
4,4'-滴滴伊	GC-MS/MS	4.70~94	Y=11.689 424X-0.043 865	0.999 0
狄氏剂	GC-MS/MS	5.15~103	Y=1.010 844X-0.010 762	0.999 0
除草醚	GC-MS/MS	5.10~102	Y=1.658 219X-0.009 227	0.997 3
2,4'-滴滴涕	GC-MS/MS	4.90~98	Y=12.444 953X-0.117 27	0.998 4
4,4'-滴滴滴	GC-MS/MS	4.75~95	Y=6.152 856X+0.000 8	0.999 6
β-硫丹	GC-MS/MS	4.90~98	Y=0.629 329X-0.002 075	0.998 3
4,4'-滴滴涕	GC-MS/MS	4.75~95	Y=9.002 096X-0.058 095	0.997 6
硫丹硫酸酯	GC-MS/MS	4.85~97	Y=0.579 655X-0.001 658	0.999 7

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表 8 大黄农药残留检测中33种农药回收率实验

农药	平均回收率（%）	RSD（%）	农药	平均回收率（%）	RSD（%）
甲胺磷	65.9	1.28	蝇毒磷	65.6	7.45
涕灭威亚砜	77.2	1.93	治螟磷	72.9	3.57
久效磷	76.3	2.02	甲拌磷	64.1	2.63
涕灭威砜	75.6	3.98	杀虫脒	100.8	3.65
3-羟基克百威	76.9	4.55	α-六六六	92.3	4.71
硫环磷	73.5	3.09	特丁硫磷	94.0	5.08
苯线磷亚砜	85.1	5.72	β-六六六	95.2	4.83
磷胺	80.2	3.83	氟甲腈	100.9	4.63
涕灭威	73.2	3.03	γ-六六六	100.2	3.84
甲磺隆	94.4	10.26	δ-六六六	92.6	2.21
苯线磷砜	80.7	5.93	艾氏剂	94.4	4.55
克百威	78.1	3.90	甲基对硫磷	99.9	4.53
氯磺隆	96.5	9.18	氟虫腈硫化物	96.6	4.88
甲拌磷亚砜	75.7	4.21	氟虫腈	94.5	4.09
胺苯磺隆	74.2	6.22	对硫磷	92.1	5.10
内吸磷	64.1	4.68	三氯杀螨醇	87.7	2.80
特丁硫磷	74.9	3.43	α-硫丹	95.6	5.37
甲拌磷砜	84.1	2.74	氟虫腈砜	94.7	3.63
水胺硫磷	78.5	4.23	4,4'-滴滴伊	101.2	4.07
苯线磷	69.6	5.98	狄氏剂	99.9	3.66
灭线磷	68.5	4.04	除草醚	94.2	2.33
特丁硫磷砜	80.5	4.76	2,4'-滴滴涕	101.3	4.73
氯唑磷	73.2	4.82	4,4'-滴滴滴	96.9	1.12
硫线磷	62.1	3.13	β-硫丹	94.2	6.55
甲基异柳磷	72.1	4.60	4,4'-滴滴涕	100.9	3.73
地虫硫磷	65.4	6.17	硫丹硫酸酯	97.0	2.57

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[1]	国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部: 2020年版 [M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 24-25.
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[4]	邓廷飞, 梁李广. 大黄抗衰老的实验研究[J]. 中华中医药学刊, 2007, 25(7):2.
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[9]	毛泽玲, 余伟庆, 焦育强. 大黄质量标准的研究进展[J]. 中国乡村医药, 2023, 30(1):72-74.
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图(3) / 表(8)

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大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（Rheum officinale Bail1.）的干燥根和根茎，用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证、水肿以及外治烧烫伤^[1]。研究表明，大黄含有蒽醌类、二苯乙烯类、苯丁酮类、多糖类、有机酸类、鞣质和多酚类等化学成分，具有泻下、抗衰老、抗肿瘤、防治心血管系统疾病和降血糖等多种药理作用^[2-6]。

大黄主要分布于我国甘肃陇南、临洮、宕县、礼县、武都、华庭、青海海东、玉树、海北、四川阿坝、湖北恩施和重庆奉节等地^[7-8]。近年来，大黄市场需求量逐渐增加，野生药材逐渐枯竭，家种大黄已经成为市场主流商品。但由于种植环境、种植技术水平差异较大，导致药材质量参差不齐，建立一套整体、全面的大黄药材质量控制方法尤为重要^[9-12]。

本研究收集3种来源的20批大黄样品，建立大黄的HPLC指纹图谱并进行方法学考察。建立了检测大黄中33种禁用农药残留的方法并进行方法学考察，为更充分利用大黄药材资源提供实验基础。

1. 仪器和材料

1.1. 仪器

SHIMADZU 20AT HPLC仪（日本岛津公司）；XS105万分之一分析天平[Mettler-Toledo international trading（Shanghai）co., Ltd.]；电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。Agilent 1260-6470 QQQ三重四极杆质谱仪，Agilent 8890-7000D气相色谱仪-三重串联四极杆质谱仪；LC-SFJ-10型手持高速匀浆机；GIPP型水浴氮吹仪；RG-160AT型离心机；Direct-Q3UV型超纯水机；XS105型电子天平；RE-52A型旋转蒸发仪；Vortex-250OMT型多管旋涡混合仪；WSZ-200A型振荡器。

1.2. 试药

芦荟大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110795-202011，纯度：97.5%），大黄素甲醚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110758-201817，纯度：99.2%），大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110796-201922，纯度：99.4%），大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110756-201913，纯度：96.0%），禁用农药混合对照溶液（中国食品药品检定研究院，批号：610020-202202），甲醇为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司）；磷酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈、甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3. 药材来源

20批大黄药材分别采集于甘肃、青海、四川、湖北，大黄药材经嘉兴东方国药饮片股份有限公司朱涛副主任药师鉴定为蓼科大黄属植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根和根茎，见表1。

表 1 20批大黄采集信息表

编号	来源	产地	采集时间
1	唐古特大黄	青海海东	2021年9月
2	唐古特大黄	青海海东	2021年9月
3	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
4	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
5	唐古特大黄	青海玉树	2021年9月
6	药用大黄	四川绵阳	2021年9月
7	药用大黄	四川绵阳	2021年9月
8	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
9	药用大黄	湖北恩施州	2021年9月
10	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
11	药用大黄	湖北恩施州	2021年9月
12	药用大黄	四川阿坝州	2021年9月
13	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
14	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
15	掌叶大黄	甘肃陇南	2021年9月
16	掌叶大黄	甘肃宕县	2021年9月
17	掌叶大黄	甘肃宕县	2021年9月
18	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月
19	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月
20	掌叶大黄	甘肃礼县	2021年9月

3. 讨论

本研究建立了20批不同产地不同种源大黄的指纹图谱，采用指纹图谱软件共标定出12个共有指纹峰。通过与对照品的色谱峰保留时间比对，4个色谱峰得到确认。生成3种不同来源大黄的指纹图谱，每一类大黄与其对照指纹图谱的相似度均大于0.95，说明建立的大黄指纹图谱方法具有较好的稳定性和可控性，能为质量评价提供参考依据。通过聚类分析将20批大黄分为3类，5批唐古特大黄S1 、S2 、S3 、S4、S5聚为一类，药用大黄S6、S7、S9、S11聚为一类，药用大黄S8、S10、S12、掌叶大黄S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20聚合为一类，表明大黄药材的内在质量与大黄种属有一定的关联，可能还与产地，海拔，种植环境有关。综上所述，本研究所建立的不同来源大黄指纹图谱准确度高，灵敏度高，专属性强，可以为大黄的质量控制提供可靠依据。同时本研究建立了大黄中33种禁用农药检测方法，结果显示所有大黄样品均未检出禁用农药，风险较小。结果显示，该方法操作简单、重复性好，可用于大黄的禁用农药残留筛查。

参考文献 (12)

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[1]	余小翠, 王习文, 张贵英, 徐君伟, 祝雨薇, 胡丹. 麝香接骨胶囊的HPLC特征图谱的研究及7种成分含量测定 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202307059
[2]	张成中, 朱雪艳, 卜其涛, 王宏瑞, 黄宝康. 基于网络药理学与分子对接预测鸡骨草特征图谱研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(8): 350-358. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202303048

留言板

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

作者简介: 毛泽玲，主管中药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究，Tel：15757165880，Email：876231359@qq.com

通讯作者: 文 波，高级工程师，研究方向：中药质量标准研究，Tel：18067998908，Email：wenborin@126.com

HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

1. 仪器与试药

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2. 方法与结果

2.1 姜黄素纳米乳的制备

2.2 血浆中姜黄素的LC/MS含量测定方法的建立

2.2.1 色谱质谱条件[8]

2.2.2 方法学考察

2.3 姜黄素纳米乳的药动学研究

2.3.1 给药方案

2.3.2 药动学参数计算

2.4 药效学研究

2.4.1 动物分组、造模及给药

2.4.2 统计学处理

2.4.3 肝脏指数

2.4.4 HE染色、油红O染色及病理切片

2.4.5 血清中TC、TG、HDL-c、LDL-c的表达水平

2.4.6 肝脏中TC、TG、MDA、SOD的表达水平

3. 讨论

计量

出版历程

大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057

1. 浙江省桐庐县中医院, 浙江 杭州 311500 2. 浙江桐君堂中药饮片有限公司, 浙江 杭州 311500

作者简介: 毛泽玲，主管中药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究，Tel：15757165880，Email：876231359@qq.com

通讯作者: 文 波，高级工程师，研究方向：中药质量标准研究，Tel：18067998908，Email：wenborin@126.com

English Abstract

HPLC fingerprint of Radix Rhubarb and forbidden pesticide residues

1. Department of Traditional Chinese Medicine, TCM Hospital of Tonglu County, Hangzhou 311500, China 2. Zhejiang Tong Jun Tang Chinese Medicine decoction Piece Co., Ltd., Hangzhou 311500, China

全文HTML

1.1. 仪器

1.2. 试药

1.3. 药材来源

2.1. HPLC指纹图谱方法学的建立

2.1.1. 供试品溶液制备

2.1.2. 对照品溶液制备

2.1.3. 色谱条件

2.1.4. 方法学考察

2.2. HPLC指纹图谱结果分析

2.2.1. 指纹图谱的相似度评价

2.2.2. 共有指纹峰的确定

2.2.3. 聚类分析

2.3. 禁用农药残留方法的建立

2.3.1. 检测条件

2.3.2. 供试品溶液的制备

2.3.3. 对照溶液的制备

2.3.4. 测定法

2.3.5. 方法学考察

2.3.6. 样品分析

目录

全文HTML

1.1. 仪器

1.2. 试药

1.3. 药材来源

2.1. HPLC指纹图谱方法学的建立

2.1.1. 供试品溶液制备

2.1.2. 对照品溶液制备

2.1.3. 色谱条件

2.1.4. 方法学考察

2.2. HPLC指纹图谱结果分析

2.2.1. 指纹图谱的相似度评价

2.2.2. 共有指纹峰的确定

2.2.3. 聚类分析

2.3. 禁用农药残留方法的建立

2.3.1. 检测条件

2.3.2. 供试品溶液的制备

2.3.3. 对照溶液的制备

2.3.4. 测定法

2.3.5. 方法学考察

2.3.6. 样品分析

作者简介:
毛泽玲，主管中药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究，Tel：15757165880，Email：876231359@qq.com

通讯作者: 文　波，高级工程师，研究方向：中药质量标准研究，Tel：18067998908，Email：wenborin@126.com

2.2.1 色谱质谱条件^[8]

1. 浙江省桐庐县中医院, 浙江杭州 311500

2. 浙江桐君堂中药饮片有限公司, 浙江杭州 311500

作者简介:
毛泽玲，主管中药师，研究方向：中药活性成分及质量标准研究，Tel：15757165880，Email：876231359@qq.com

通讯作者: 文　波，高级工程师，研究方向：中药质量标准研究，Tel：18067998908，Email：wenborin@126.com

1. Department of Traditional Chinese Medicine, TCM Hospital of Tonglu County, Hangzhou 311500, China

2. Zhejiang Tong Jun Tang Chinese Medicine decoction Piece Co., Ltd., Hangzhou 311500, China