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盐酸普萘洛尔（propranolol hydrochloride，PPL）是治疗婴幼儿血管瘤的一线和首选药物[1]。口服盐酸普萘洛尔疗效确切，但其存在首过效应强、生物利用度低、半衰期短等问题，且不良反应发生率高[2]。普通盐酸普萘洛尔外用制剂只对浅表型血管瘤有效，对深部型和复合型血管瘤的治疗仍需结合口服给药。诸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可显著提高经皮给药制剂的皮肤渗透性，且能提高其在皮肤尤其是皮肤真皮层的药物滞留量，有望能提高盐酸普萘洛尔外用制剂对深部型和复合型血管瘤的疗效[3~5]。因此，课题组拟基于立方液晶载药技术将盐酸普萘洛尔制备成一种纳米经皮给药制剂，以期能降低或避免口服给药带来的高不良反应发生率，提高盐酸普萘洛尔的治疗效果和患者依从性。前期实验中，课题组筛选了盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL-Cubs）的制备方法，并通过单因素考察结合星点设计效应面法优化了其最佳处方和制备工艺，结果制得的PPL-Cubs包封率低（约50%），远低于药典规定的80%。立方液晶为多层囊泡结构，类似于多囊脂质体，其可能与脂质体同样存在对水溶性化合物包封率较低的问题。鉴于前期研究表明，盐酸普萘洛尔在不同pH磷酸盐缓冲液下的溶解度存在极大差异，因此，本研究拟在立方液晶常规制备的基础上，引入“pH梯度法”的载药思路，制备PPL-Cubs，以期提高其包封率。
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岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DV215CD型分析天平（美国奥豪斯公司）；AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；高压均质机（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS激光粒度测定仪（美国PSS粒度仪公司）；超滤离心管（100KD，Millipore）。
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盐酸普萘洛尔（含量99.9%，常州亚邦制药有限公司）；单油酸甘油酯（法国GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德国BASF公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
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取PPL-Cubs适量，装入超滤离心管中，于4000 r/min离心10 min，收集离心液，采用课题组前期建立的盐酸普萘洛尔含量测定方法测定离心液中游离药物浓度C游离；取未透析的PPL-Cubs，测定药物浓度C总；根据公式EE（%）=[(C总−C游离)/ C总]×100%计算PPL-Cubs的包封率。
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精密称取单油酸甘油酯9 g和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml无水乙醇，20 ℃水浴下搅拌溶解，为A相；精密称取盐酸普萘洛尔3.5 g，加入86 g纯化水，20 ℃水浴下搅拌溶解，为B相。于20 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢地滴加至B相中，待磁力搅拌1 h后加入适量纯化水使总质量为100 g，再在800 bar压力下高压均质7次，得PPL-Cubs。
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精密称取单油酸甘油酯适量，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407适量，加入适量纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至酸性，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，得空白立方液晶纳米粒粗品；取空白立方液晶纳米粒粗品，高压均质数次，得空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）。取盐酸普萘洛尔溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入一定比例的B-Cubs中，搅拌均匀，并用氢氧化钠溶液调节pH至一定值，于一定温度下持续搅拌一定时间，再放置至室温，即得PPL-Cubs。
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前期试验结果表明，磁力搅拌速度、时间、温度、内水相pH值对B-Cubs的粒径基本无影响，高压均质压力及均质次数是影响其粒径的主要因素，故拟进一步优化高压均质压力和均质次数。
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按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在400、600、800、900、1000 bar下高压均质7次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表1）。结果表明，随高压均质压力的提高，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质压力≥900 bar时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质压力为900 bar。
表 1 高压均质压力的考察（n=3）
压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 -
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在900 bar下高压均质3、5、7、9次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表2）。结果表明，随高压均质次数的增加，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质次数≥7次时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质次数为7次。
表 2 高压均质次数的考察（n=3）
次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011 -
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定泊洛沙姆407用量为5%，内水相pH为3.0，考察单油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表3）。结果表明，随单油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs粒径呈先减小后增大趋势，多分散指数则不断降低，当单油酸甘油酯用量为25%时，制得的B-Cubs具有最小的粒径和较适宜的多分散指数，故确定单油酸甘油酯用量为25%。
表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011 -
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定单油酸甘油酯用量为25%，内水相pH为3.0，考察泊洛沙姆407用量（3%、4%、5%、6%、7%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表4）。结果表明，制得的B-Cubs粒径随泊洛沙姆407用量的增加逐渐降低，多分散指数变化无明显规律，但均较小（<0.1）；当泊洛沙姆407用量≥5%时，粒径变化幅度降低，故确定泊洛沙姆407用量为5%。
表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021 -
根据前期盐酸普萘洛尔在不同pH的PBS中溶解度测定结果可知（见表5），盐酸普萘洛尔在pH≥8.5时溶解度显著下降。按照“2.2.2”项下方法，制备内水相pH为3.0的B-Cubs，并按载体/药物比（以单油酸甘油酯/盐酸普萘洛尔计）为6∶1的比例与B-Cubs和盐酸普萘洛尔水溶液进行混合，以10%氢氧化钠溶液分别调节外水相pH至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水浴（载药温度）下600 r/min磁力搅拌15 min（载药时间），制得PPL-Cubs中药物浓度为1%，测定对包封率等参数影响（见表6）。结果表明，PPL-Cubs的包封率随外水相pH值的提高逐渐增加，当外水相pH值≥8.5时，包封率增加趋势渐小；外水相pH值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）
pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08 表 6 外水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察内水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表7）。结果表明，不同内水相pH的B-Cubs对制得的PPL-Cubs包封率无明显差异，对PPL-Cubs的粒径和多分散指数亦无明显影响。
表 7 内水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载体/药物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表8）。结果表明，当载体/药物≥6时，PPL-Cubs的包封率不再增加；载体/药物比值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 8 载体/药物的考察（n=3）
载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药温度（20、30、40、50 ℃）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表9）。结果表明，载药温度对PPL-Cubs的包封率、粒径和多分散指数无明显影响。
表 9 载药温度的考察（n=3）
载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药时间（15、30、45、60 min）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表10）。结果表明，载药时间对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 10 载药时间的考察（n=3）
载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026 -
通过调整高压均质压力，制备不同粒径B-Cubs。按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察B-Cubs粒径和多分散指数对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表11）。结果表明，B-Cubs的粒径和多分散指数不影响所制得PPL-Cubs的包封率，但B-Cubs的粒径和多分散指数基本决定了制得PPL-Cubs的粒径和多分散指数。
表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）
载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045 -
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察药物浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表12）。结果表明，随着PPL-Cubs中药物浓度的提高，包封率呈逐渐增加趋势，当药物浓度≥1%时，包封率增加趋势变慢。
表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）
浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007 -
精密称取单油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至3.0，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，再在900 bar下高压均质7次，得B-Cubs。取盐酸普萘洛尔1 g，溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入24 g B-Cubs中，搅拌均匀，用10%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，于20 ℃水浴持续搅拌15 min，再放置至室温，即得PPL-Cubs
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立方液晶纳米粒常用的制备方法包括注入法、熔融-分散法、热处理法、喷雾干燥法等[6]。试验前期以粒径、包封率等为评价指标筛选了最佳制备方法为注入法，并优化了其最佳处方制备工艺，结果制得的载药立方液晶纳米粒包封率较低（约50%）[7]。立方液晶是两亲性脂质分子分散在过量水中形成的含双连续水区和闭合脂质双分子层的蜂窝状液晶结构；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂质双层膜中，两亲性分子则贯穿其中。盐酸普萘洛尔在酸性环境下具有较高的溶解性，常规方法制得的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒pH约为3.5，如何让其具有进入立方液晶载体内相的“动力”是提高载药立方液晶纳米粒包封率的关键。因此，本研究引入“pH梯度法”，通过创造高溶解度内环境（低pH值内水相）和低溶解度外环境（高pH值外水相），给盐酸普萘洛尔提供进入立方液晶载体内相的“动力”。离子化的盐酸普萘洛尔在调节pH的过程中逐渐变为分子形态的普萘洛尔而进入脂质区，脂质区的普萘洛尔分子接触内水相酸性环境而被离子化，内水相中离子化的盐酸普萘洛尔无法再通过脂质区而被捕获于内水相。结果表明，pH梯度法显著提高了PPL-Cubs的包封率，包封率达到90%。
Preparation of propranolol hydrochloride cubosomes by pH gradient method
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摘要:
目的 制备具有较高包封率的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL- Cubs）。 方法 采用pH梯度法制备PPL-Cubs；以粒径、多分散指数为评价指标，优化空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）制备的高压均质压力、高压均质次数、单油酸甘油酯用量及泊洛沙姆407用量；以包封率等为评价指标，优化外水相pH值、内水相pH值、载体/药物比、载药温度、载药时间、B-Cubs粒径和多分散指数、药物浓度等。 结果 高压均质压力为900 bar、均质次数为7次、单油酸甘油酯用量为25%、泊洛沙姆407用量为5%时，制得的B-Cubs具有较小的粒径和多分散指数。外水相pH值为8.5、内水相pH值为3.0、载体/药物比为6∶1、载药温度为20 ℃、载药时间为15 min、药物浓度为1%时，制得的PPL-Cubs包封率较高；B-Cubs粒径和多分散指数对制得的PPL-Cubs包封率无明显影响。 结论 pH梯度法能制得较高包封率的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒。 Abstract:Objective To prepare propranolol hydrochloride loaded cubosomes (PPL-Cubs) with high entrapment efficiency. Methods PPL-Cubs was prepared by pH gradient method. Pressure and cycles of high pressure homogenization, dosage of glyceryl monooleate and poloxamer 407 were optimized to prepare blank cubosomes with particle size and polydispersity index as the indexes. The influences of various factors, including exterior pH values, internal pH values, the ratio of carrier to drug, particle size and polydispersity index of blank cubosomes, incubation temperature and time, and drug concentration on the entrapment efficiency were investigated. Results The blank cubosomes with small particle size and polydispersity index was prepared under homogenization conditions of 900 bar for 7 cycles, glyceryl monooleate dosage of 25%, and poloxamer 407 dosage of 5%. PPL-Cubs showed high entrapment efficiency with exterior pH value of 8.5, internal pH value of 3.0, ratio of carrier to drug of 6∶1, incubation temperature of 20 ℃, and incubation time of 15 min, and drug concentration of 1%. The particle size and polydispersity index of blank cubosomes showed no influence on entrapment efficiency. Conclusion PPL-Cubs with high entrapment efficiency could be prepared under the pH gradient method. -
Key words:
- propranolol hydrochloride /
- cubosomes /
- pH gradient method
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随着社会经济发展和饮食结构改变，功能性便秘（FC）发生率逐年攀升，并具有顽固性、复发性的特点，无根治特效药[1]，目前临床上对于便秘的干预措施主要包括药物、按摩、膳食调理等，但都存在依从性低、副作用明显、疗效不可靠等弊端[2]，新型抗便秘产品的研发具有迫切需求。黑蒜是一种发酵大蒜，在高温高湿条件下发酵一定时间制得[3]。黑蒜主要化学成分包括多糖、类黑精、蛋白质、多酚、含硫化合物等[4]，研究表明其具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肥胖[5-9]等作用，近年，黑蒜在通便相关的药食同源产品研发领域应用较多，但关于黑蒜抗便秘作用的研究较少，抗便秘功效成分更不明确，相关产品进一步研发与推广缺乏足够的科学依据。且黑蒜用于抗便秘每日需服用20 g以上[10]，易导致依从性差，难以长期坚持等问题。有研究发现大蒜多糖具有一定抗便秘作用[11]，而大蒜在加工成黑蒜的过程中糖类物质含量可增加数倍[12-13]，可合理推测黑蒜多糖可能具有更显著的抗便秘作用，是黑蒜抗便秘作用的物质基础之一，但目前还没有相关的研究。因此，本文建立复方地芬诺酯（CO.D）诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用，为新型抗便秘产品的研发提供科学依据。
1. 材料与仪器
1.1 实验材料
黑蒜（批号：20231030，上海明可名生物科技有限公司）；乳果糖口服液（规格：667 mg/ml，批号：22110047，北京韩美药品有限公司）；复方地芬诺酯片（2.5 mg/片，批号：210804，仁和堂医药连锁股份有限公司）。
1.2 实验试剂
D-无水葡萄糖（批号：S22J12H137237，源叶生物）；无水乙醇（批号：P2708277，泰坦科技）；生理盐水（批号：230327042，雷根生物）；4%多聚甲醛（批号：HP184401，博光生物）；浓硫酸（批号：
20230420）、 丙酮（批号：20230807 ）、石油醚（批号：20220507 ）均购自国药集团；三氯乙酸（批号：C14990699）、活性炭粉（批号：C14853603）、阿拉伯树胶粉（批号：C15109301）、苯酚（批号：C15031044）均购自麦克林生化；所有水均为超纯水机所制一级水。1.3 实验仪器
鼓风干燥箱DAG-924（满贤经贸）；循环水式多用真空泵SHB-III（明杰仪器）；万分之一天平JA1003（恒平仪器）；电热恒温水浴锅HWS-12（一恒仪器）；高速离心机M18G（创宜生物）；旋转蒸发器RE-52AA（亚荣仪器）；超纯水机Smart-S（和泰仪器）。
1.4 实验动物
SPF级C57雄性小鼠，体重18 ~22 g，许可证号： SCXK（浙）2019-00004，杭州子源实验动物科技有限公司。
2. 方法
2.1 黑蒜多糖的提取
取10 g黑蒜，按下列步骤处理： ①脱脂：剥去外壳，研磨成泥，85%乙醇水溶液（V/V）浸渍，常温静置8 h，抽滤，滤渣用85%乙醇水溶液洗涤2次，置于烘箱60℃挥干至无醇味，充分研磨获得脱脂黑蒜粉。②水提：所得脱脂黑蒜粉用80℃热水浸提1 h，料液比为1∶50，抽滤，滤液减压浓缩至原体积1/2。③脱蛋白：在浓缩液中加入等体积10%三氯乙酸水溶液，充分混匀，4℃静置10 h，离心取上清液。④醇沉：上清液加入无水乙醇，调节乙醇水溶液浓度为80%，充分混匀，4℃静置12 h，离心取沉淀。⑤干燥：挥干有机溶剂，烘箱60℃干燥，去除残留溶剂，得黑蒜多糖干燥粉末。
2.2 多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[14]测定多糖含量。
2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制
精密称取D-无水葡萄糖适量，配置为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的葡萄糖标准溶液，分别吸取250 μl于离心管中，依次加入6%苯酚溶液150 μl、浓硫酸625 μl，迅速振摇，静置反应30 min，吸取200 μl于96孔板，设置3个复孔，测量490 nm处吸光度。绘制葡萄糖标准曲线，求得回归方程。
2.2.2 样品测定
精密称取适量黑蒜多糖干燥粉末，加入蒸馏水配制成一定浓度的多糖溶液，根据酶标仪检测范围进行稀释。吸取250 μl多糖溶液于96孔板中，按照2.2.1项下方法进行测定，计算样品中多糖的含量，进一步计算黑蒜多糖的得率和纯度。
计算公式：黑蒜多糖得率（%）=
$ \dfrac{W2}{W1}\times 100\text{%} $ 黑蒜多糖纯度（%）=
$ \dfrac{C\times V\times D}{W2}\times 100\text{%} $ 式中：
$ W $ 1为黑蒜质量（g）；$ W $ 2为黑蒜多糖粉末质量；$ C $ 为样品中多糖的质量浓度（mg/ml）；$ V $ 为提取溶剂体积（ml）；$ D $ 为样品稀释倍数。2.3 动物实验给药剂量及配置
乳果糖口服液：乳果糖含量为667 mg/ml，正常成人用药量15 ml/d[15]，换算可得小鼠的用药剂量为4 g/（kg·d）。量取乳果糖口服液6 ml，加蒸馏水14 ml，配置成200 mg/ml的乳果糖口服液。
CO.D混悬液：参考贾红慧等[16]研究结果，选用5 mg/kg剂量CO.D造模，模型稳定、灵敏。取CO.D 4片，研磨成细粉，加蒸馏水20 ml，配置成0.5 mg/ml的 CO.D混悬液，使用前需充分混匀。
黑蒜多糖低、中、高剂量溶液：参考胡淼等[17]研究结果，黑蒜多糖低、中、高剂量组剂量分别选用0.25、0.5、1 g/kg。称取0.5、1、2 g黑蒜多糖干燥粉末，分别加蒸馏水20 ml，配置成25、50、100 mg/ml的黑蒜多糖溶液。
墨汁[18]：阿拉伯树胶于蒸馏水中加热至完全溶解，料液比为1∶8。加入5 g活性炭粉末，混合均匀，重复煮沸3次，冷却后定容至100 ml，使用前需充分混匀。
含药墨汁：取适量受试药，加入墨汁，配制成与上述受试药剂量相同的含药墨汁。
2.4 实验动物分组及给药方法
2.4.1 小鼠小肠墨汁推进实验
小鼠60只，适应性饲养1周，正常饮食饮水。给药前按照体重随机分为空白组、模型组、阳性组、黑蒜多糖低、中、高剂量组，每组10只。
按照0.1 ml/10 g灌胃给药。①给药：空白组和模型组小鼠给予蒸馏水，阳性组和黑蒜多糖组小鼠分别给予乳果糖口服液和黑蒜多糖溶液。1次/d，连续给药1周，观察并记录小鼠体重变化及一般状态。②造模：末次给药后禁食12 h，自由饮水，空白组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组小鼠灌胃CO.D溶液。③给药：30 min后空白组、模型组灌胃墨汁，其它组小鼠灌胃相应含药墨汁。25 min后处死，剖取小鼠小肠（幽门至盲肠上端），平铺成直线，测量小肠总长度和墨汁推进距离，避免拉伸小肠，影响实验结果。
计算公式：小肠墨汁推进率（%）=墨汁推进距离（cm）/小肠总长度（cm）×100%
2.4.2 小鼠排便实验
分组、给药剂量及方法同“2.4.1”项下实验方法，给药后，记录每只小鼠首次排出黑便的时间、6 h内排出黑便的数量及重量，并进行粪便含水量测定，同时观察粪便性状。含水量测定方法为：将小鼠新鲜粪便置于提前干燥、称重的容器中，称重，于烘箱中干燥至重量不再变化，计算粪便含水量。
计算公式：粪便含水量（%）=
$ \dfrac{M1-M2}{M1}\times 100\text{%} $ 式中：M1为干燥前粪便质量（g），M2为干燥后粪便质量（g）。
2.5 统计学方法
采用SPSS 24统计软件进行数据分析，以均数±标准差（
$ \bar{X} $ ±S）表示计量资料。两两比较采用LSD-t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。3. 结果与分析
3.1 黑蒜多糖的得率和纯度
精密称量所得黑蒜多糖干燥粉末质量为0.832 g，代入公式计算可得黑蒜多糖的得率为8.32%。以葡萄糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，可得回归方程为Y=
2.2829 X+0.0764 ，相关系数r=0.9982 ，线性关系较好，代入回归方程计算可得黑蒜多糖的纯度为58.23%。3.2 黑蒜多糖对小鼠体重的影响
从表1可以看出，与空白组相比，各组小鼠体重均正常增长，无显著性差异，表明黑蒜多糖不会对正常小鼠体重产生影响。实验过程中，各组小鼠饮食正常，状态良好，无腹泻等不良反应，为后续实验提供前提保证。
表 1 黑蒜多糖对小鼠体重的影响组别 小鼠小肠墨汁推进实验 排便实验 初始体重
（m/g）最终体重
（m/g）初始体重
（m/g）最终体重
(m/g)空白组 21.28±1.15 22.23±1.19 21.80±1.02 22.90±0.61 模型组 21.20±1.36 22.24±1.22 21.58±1.00 22.64±0.84 阳性组 21.17±1.18 22.31±1.28 21.42±1.01 22.81±0.91 黑蒜多糖
低剂量组21.44±1.32 22.38±1.54 21.98±1.20 23.02±1.20 黑蒜多糖
中剂量组21.06±1.13 22.16±0.77 21.59±1.10 22.38±1.08 黑蒜多糖
高剂量组21.42±1.15 22.54±1.26 21.79±1.29 22.85±0.98 3.3 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响
从表2可以看出，与空白组相比，模型组墨汁推进率极显著减小，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠墨汁推进率均显著增大，分别增大了24.75%、56.95%、95.25%，表明黑蒜多糖对FC模型小鼠小肠运动具有促进作用，且成剂量依赖性。
表 2 黑蒜多糖对小鼠小肠墨汁推进的影响组别 碳末推进距离
（l/cm）小肠总长度
（l/cm）墨汁推进率
（%）空白组 28.86±3.25 34.87±1.60 82.90±9.97 模型组 9.60±0.73*** 34.09±2.31 29.50±1.35*** 阳性组 26.94±3.55### 34.15±1.60 79.00±9.92### 黑蒜多糖
低剂量组12.58±1.15### 34.35±1.67 36.80±4.42# 黑蒜多糖
中剂量组16.01±2.06### 34.48±3.18 46.30±4.19### 黑蒜多糖
高剂量组19.95±1.60### 34.66±1.96 57.60±4.06### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01， ###P<0.001，与模型组比较。 3.4 黑蒜多糖对小鼠排便的影响
从表3可看出，与空白组相比，模型组小鼠首次排出黑便时间极显著延长，6 h排便粒数显著减少，6 h排便重量极显著减少，粪便含水量极显著降低，粪便呈球形或短椭圆形，部分串联，质地干硬，颜色普遍偏黑，表明本实验小鼠FC模型造模成功。与模型组相比，黑蒜多糖组小鼠首次排出黑便时间均极显著缩短，分别缩短了42.55%、44.99%、45.81%；6 h排便重量显著增加，分别增加了68.42%、78.95%、78.95%；粪便含水量极显著增大，分别增大了29.96%、32.78%和35.82%，粪便呈长椭圆形，质地较软，颜色为深棕色，无腹泻现象；除黑蒜多糖低剂量组外，中、高剂量组小鼠6 h排便粒数有统计学差异，分别增加了31.45%和32.52%。表明黑蒜多糖可能通过增大FC模型小鼠粪便含水量发挥促排便作用，各剂量组间效果差异不明显。
表 3 黑蒜多糖对小鼠排便及粪便含水量的影响组别 首黑便时间
（t/min）6 h排便数
（粒）6 h排便湿重
（m/g）6 h排便干重
（m/g）含水量
（%）空白组 111.50±8.98 16.50±3.51 0.46±0.10 0.22±0.04 52.16±2.53 模型组 241.50±19.54*** 11.13±2.75** 0.19±0.02*** 0.13±0.01*** 32.58±2.35*** 阳性组 121.50±110.81### 15.13±4.09# 0.41±0.12### 0.20±0.06## 50.06±1.83### 黑蒜多糖低剂量组 138.75±10.79### 13.75±2.71 0.32±0.08## 0.19±0.42# 42.34±2.27### 黑蒜多糖中剂量组 132.88±8.34### 14.63±3.66# 0.34±0.10## 0.19±0.05## 43.26±2.68### 黑蒜多糖高剂量组 130.88±9.09### 14.75±3.73# 0.34±0.12## 0.19±0.05## 44.25±6.72### 注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与空白组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，与模型组比较。 4. 讨论
CO.D是一种止泻药，可通过抑制肠道平滑肌上的肠黏膜感受器抑制肠道运动，减慢排便进程，减少排便次数，同时肠内容物与肠粘膜接触时间延长，可促进肠内容物水分的重吸收，降低粪便含水量，是常用的FC小鼠模型造模药[19]。因此，本研究建立CO.D诱导的小鼠FC模型，探究黑蒜多糖的抗便秘作用。实验结果表明，黑蒜多糖可显著促进CO.D诱导的FC模型小鼠小肠蠕动，缩短排便时间，增加粪便含水量，从而发挥抗便秘作用。有研究显示成人每日服用约2 g黑蒜多糖便可达到较好疗效，用量仅为黑蒜的1/10[10]。给药期间小鼠状态良好、体重正常，未产生腹泻等副作用。因此，黑蒜多糖用于FC治疗可有效规避依从性差、副作用明显、疗效不可靠等弊端，前景广阔。此外，有相关研究发现，采用CO.D 10 mg/kg和15 mg/kg灌胃造模（大鼠）都存在停药后恢复的情况[20]，提示我们使用CO.D进行慢性便秘造模，在造模成功后的治疗给药阶段也需要持续用药，以维持药效。目前该便秘模型的建立没有统一标准，后续可对造模时间、造模剂量进行优化，为更深入的黑蒜多糖抗便秘机制研究提供基础。
FC是典型的胃肠动力障碍性疾病，现代研究普遍认为，其发病机制主要与卡哈尔间质细胞（ICCs）数量、功能以及分布异常、肠神经递质水平异常、水通道蛋白表达异常、氧化应激指标失衡、肠道菌群紊乱等有关[21-22]。大蒜多糖主要为果聚糖，占干重的65%，在发酵生成黑蒜的过程中，果聚糖因高温作用大量降解为低聚果糖（FOS）、果糖等小分子糖[23]。FOS在国际营养学界被称作“具有优良难消化性的水溶性膳食纤维”，还是典型的“超强双歧因子”。因其无法被肠道吸收，可被双歧杆菌等益生菌分解利用，短时间内促进双歧杆菌增殖10~100倍，分解生成的有机酸，可有效调节肠道pH，刺激肠道蠕动，促进排便[24]。双歧杆菌还可抑制有害肠道病菌生长、抵抗病原菌感染、产生维生素并促进矿物质吸收以维持肠道健康，有研究表明人体双歧杆菌含量随年龄增长逐渐减少，是老年人易发生便秘的主要原因[25]。因此，需要进一步明确黑蒜多糖的单糖组成、相对分子质量以及结构，为后续抗便秘机制研究提供依据。此外，便秘成因复杂，可结合具体的证型如脾虚、血虚、阳虚、津亏等便秘模型进一步探究黑蒜多糖抗便秘作用的有效性。
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表 1 高压均质压力的考察（n=3）
压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 
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表 2 高压均质次数的考察（n=3）
次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011
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表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011
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表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）
用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021
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表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）
pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08
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表 6 外水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006
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表 7 内水相pH值的考察（n=3）
pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006
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表 8 载体/药物的考察（n=3）
载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025
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表 9 载药温度的考察（n=3）
载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018
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表 10 载药时间的考察（n=3）
载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026
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表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）
载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045
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表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）
浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007
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