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糖皮质激素（glucocorticoid, GC）是一种在临床上广泛应用于治疗类风湿性关节炎、胃肠道疾病及自身免疫疾病的药物[1]。然而，研究显示，有超过50%的患者在长期接受GC的治疗过程中会发生骨质疏松症[2]。目前，糖皮质激素诱导的骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP）已成为病理性骨丢失的第三大常见病症，仅次于老年性骨质疏松症和绝经后骨质疏松症。与此同时，GIOP由于其高致残率和高发病率给社会和家庭生活造成了极大的负担，因此，如何预防和治疗GIOP成为医学上关注的热点。
啤酒花（Humulus lupulus L.）为桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性带花果穗不仅是酿造啤酒的添加原料，也是全球广泛应用的药物品种，并在欧洲广泛用于缓解更年期潮热及绝经后骨质疏松症[3]。黄腐酚（xanthohumol, XN）为啤酒花中的代表性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等活性[4]。课题组前期研究发现，啤酒花提取物及黄腐酚可显著改善去卵巢小鼠的骨丢失，防治绝经后骨质疏松症。此外，两者还可显著调节成骨细胞与破骨细胞的活性，维持骨稳态[5-6]。然而，目前对于啤酒花及黄腐酚抗GIOP的作用机制尚不明确。故笔者拟以地塞米松（DEX）诱导的骨质疏松小鼠及其损伤的成骨细胞为模型，采用Micro-CT及体外活性检测等方法，对啤酒花及黄腐酚抗GIOP的作用进行探究。
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啤酒花（PJH-01），产地新疆，购自河北安国中药材市场，经海军军医大学药学院生药学教研室辛海量副教授鉴定，密封存放于干燥阴凉处。称取啤酒花药材粉末70 g，加入料液比为1∶15的75%乙醇，回流提取3次，减压浓缩干燥成浸膏，HPLC测定得浸膏中黄腐酚含量为0.55%[5]。使用前配制成相应浓度的提取液。
其他试剂及购买厂家：黄腐酚（纯度≥98%，上海历鼎）；地塞米松（大连美仑）；阿仑膦酸钠（上海国药）；I型胶原C端肽（CTX-I）及骨钙素（BGP）Elisa试剂盒（南京建成）；碱性磷酸酶（ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（南京建成）；胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；骨形成蛋白2（BMP-2）及成骨特异性转录因子（Runx-2）抗体（Abcam，英国）；Micro-CT（eXplore Locus SP，GE，美国）。
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3月龄ICR小鼠，体重（20 ± 2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物质量合格证号：2013001831722；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0004]。小鼠饲养于海军军医大学药学院实验动物中心清洁级动物房，室温（24 ± 0.5）℃，每日12 h光照/12 h黑暗，自由饮食饮水，适应1周后开始动物实验。
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取自新生24 h Wistar大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。
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将56只大鼠按体重以随机区组设计分为7组（n=8）：空白对照组（CON），DEX模型组（MOD, 2.5 mg/kg），阿仑膦酸钠阳性对照组（ALN, 1 mg/kg），啤酒花提取物低剂量组（HLE-L, 1 g/kg），啤酒花提取物高剂量组（HLE-H, 3 g/kg），黄腐酚低剂量组（XN-L, 30 mg/kg），黄腐酚高剂量组（XN-H, 90 mg/kg）。除空白组外，所有组别小鼠腹腔注射DEX注射液，空白对照组小鼠注射同体积的生理盐水，每周3次；与此同时，予相应药物灌胃，空白对照组和模型组小鼠灌胃相同体积生理盐水。每周灌胃给药6次，连续给药12周。每周称量体重，按体重0.1 ml/10 g调整给药体积。末次给药后，小鼠禁食、不禁水过夜，摘除眼球取血，静置离心取血清，储存于−80 ℃冰箱中用于生化指标检测，剥离小鼠后肢右侧股骨用于Mirco-CT测定。
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取组织固定液中的小鼠右侧股骨，剔除其表面附着的结缔组织，用高分辨率Micro-CT对股骨远端进行扫描。计算骨密度（BMD）、骨表面积/骨体积（BS/BV）、相对骨体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N.）及骨小梁分离度（Tb.Sp.）。
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按照试剂盒说明书步骤，对小鼠血清中ALP、TRAP及CTX-I水平进行检测。
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采用二次消化法从新生大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞[7]，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，取3～4代成骨细胞进行增殖、分化以及Western blot分析。
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取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×104 个/ml细胞悬液接种于96孔板。24 h后分别更换为含药培养液（DEX: 10 μmol/L；HLE: 100、20 μg/ml；XN: 5、1 μmol/L），除空白组外均给予DEX损伤。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×104 个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8天裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞 ALP活性[8]。
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将3～4代的成骨细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。采用ELISA试剂盒对成骨细胞BGP含量进行检测，采用Westernblot技术[9]对BMP-2及Runx-2水平进行检测。
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实验结果以（
$\bar x \pm s$ ）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。检验水准（α）为 0.05。 -
模型组小鼠股骨的骨组织形态与空白组相比，出现明显空洞，见图1；药物治疗后，HLE及XN显著改善DEX小鼠的骨组织形态及骨微结构，防止骨质空洞。
图 1 小鼠股骨Micro-CT扫描图
模型组小鼠BMD、BS/TV、BV/TV及Tb.N.水平较空白组显著降低，Tb.Sp.水平显著升高（图2）。药物治疗后，HLE及XN显著逆转了DEX小鼠BMD及骨小梁参数的异常，防治骨质疏松。
图 2 小鼠股骨骨密度（A）及骨小梁参数（B-E）（
$n=8\text{，}\bar{x}\pm s$ ） -
小鼠注射DEX后，其血清ALP水平显著降低，TRAP及CTX-I水平显著升高。药物治疗后，HLE及XN可显著提高小鼠血清ALP水平，并降低TRAP及CTX-I的高表达，调节骨代谢，且药物高剂量组治疗效果更佳（图3）。
图 3 小鼠血清生化指标（
$n=8\text{，}\bar{x}\pm s$ ） -
如图4A-B所示，DEX损伤成骨细胞后，其增殖能力及ALP活性显著降低。药物治疗后，HLE及XN可显著促进DEX损伤成骨细胞的增殖，提高ALP活性，促进成骨细胞的分化。
图 4 成骨细胞的增殖（A）、分化（B）水平及骨形成相关蛋白（C-E）的表达（
$n=4\text{，}\bar{x}\pm s$ ）在骨形成相关蛋白的表达方面，HLE及XN可显著促进DEX损伤成骨细胞中BGP及BMP-2的表达，XN还可显著促进成骨细胞Runx-2的表达（图4C-E），促进成骨细胞骨形成。
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DEX作为临床上常用的一种合成糖皮质激素，在抗炎抗免疫反应方面均具有良好的疗效。与其他糖皮质激素类似，长期使用DEX会引起严重的不良反应，尤其是对骨骼的影响，可大大增加骨质疏松及生理性骨折的发病风险[10]。本研究中，小鼠注射DEX后，其股骨的骨微结构显著破坏，骨质明显空洞，骨密度及骨小梁参数显著降低，且血清骨生化指标异常，提示小鼠处于典型的骨质疏松状态。药物治疗后，啤酒花提取物及黄腐酚均可显著改善GIOP小鼠的骨微结构破坏，增强骨密度，改善骨小梁参数，防治骨质疏松。ALP和TRAP分别为评价骨形成与骨吸收的常用指标，而CTX-I为成熟胶原降解的标志物，其活性水平与骨密度呈显著的负相关[11]。本研究中，啤酒花提取物及黄腐酚可显著提高ALP含量，抑制TRAP及CTX-I的高表达，表明两者可通过调节骨代谢的平衡防治骨丢失。
在GIOP细胞层面的发病机制中，GC对成骨细胞的影响占主导地位[12]。在成骨细胞活性检测中，MTT值及ALP活性分别代表成骨细胞的增殖及分化水平。其中，ALP合成于骨基质成熟阶段，利于骨基质矿化[13]。本研究中，DEX损伤成骨细胞后，其MTT值及ALP活性均显著下降，表示糖皮质激素抑制了成骨细胞的增殖及分化。药物治疗后，啤酒花提取物及黄腐酚可显著提高损伤成骨细胞的MTT值及ALP活性，有效促进了细胞的增殖与分化，提高成骨细胞活性。BGP、BMP-2及Runx-2均为典型的骨形成相关蛋白，其中BGP是由非增殖期的成骨细胞特异合成并分泌的非胶原蛋白[14]，BMP-2是参与成骨细胞分化阶段的主要蛋白[15]，而Runx-2是早期成骨细胞分化的调节因子，三者在骨骼形态发生阶段均起着关键作用[16]。本研究发现，啤酒花提取物及黄腐酚可显著促进DEX损伤成骨细胞中BGP、BMP-2及Runx-2的表达，进一步证实了其可通过促进成骨细胞的骨形成对抗GIOP。以上研究为深入探讨啤酒花及其活性成分黄腐酚抗骨质疏松的作用机制以及相关药物的研发奠定了基础。
Effects of Humulus lupulus L. and its active ingredient xanthohumol on preventing glucocorticoid-induced osteoporosis
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摘要:
目的 研究对啤酒花及其活性成分黄腐酚抗糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）作用。 方法 腹腔注射地塞米松（DEX）造模，并结合Micro-CT及Elisa试剂盒检测等方法，对小鼠股骨的骨微结构、骨密度及血清骨生化指标进行评价。同时，采用DEX损伤成骨细胞，对其增殖、分化水平及骨形成相关蛋白的表达进行评价。 结果 啤酒花提取物及黄腐酚可显著改善GIOP小鼠的骨微结构破坏，增强骨密度，改善骨小梁参数。在成骨细胞水平上，啤酒花及黄腐酚既可促进DEX损伤成骨细胞的增殖、分化，又可提高骨钙素（BGP）、骨形成蛋白2（BMP-2）以及成骨特异性转录因子（Runx-2）的表达水平，促进骨形成。 结论 该研究首次明确了啤酒花及黄腐酚具有抗GIOP作用，为抗骨质疏松药物的开发提供了新资源。 -
关键词:
- 啤酒花 /
- 黄腐酚 /
- 糖皮质激素性骨质疏松 /
- 地塞米松 /
- 成骨细胞
Abstract:Objective To explore the effects of Humulus lupulus L. extract (HLE) and xanthohumol (XN) on preventing glucocorticoid-induced osteoporosis (GIOP). Methods The GIOP model was established by intraperitoneal injection of dexamethasone (DEX). Bone microstructure, bone mineral density and serum biochemical indexes were evaluated by Micro-CT and ELISA kits. The levels of cells proliferation and ALP activity, and the expression of bone formation related proteins were assayed with primary osteoblasts injured by DEX. Results HLE and XN significantly alleviated the bone microstructure damage, enhanced the bone mineral density, and improved the trabecular parameters in GIOP mice. In vitro experiments showed that HLE and XN can prevent bone loss not only by improving cell proliferation and ALP activity, but also through increasing the expression of bone γ-glutamic acid-containing proteins (BGP), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and runt-related transcription factor 2 (Runx-2). Conclusion This study confirmed that HLE and XN had anti-GIOP effects for the first time. It provides a new resource for the development of anti-osteoporosis medications. -
Key words:
- Humulus lupulus L. /
- xanthohumol /
- glucocorticoid-induced osteoporosis /
- dexamethasone /
- osteoblast
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花椒为芸香科植物红花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.或青花椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，味辛，性温，具有温中止痛、杀虫止痒的功效，主治脘腹冷痛、呕吐泄泻、虫积腹痛[1]。生物碱是花椒的主要特征性成分，组成丰富、结构多样，具有抗炎、镇痛、抗菌、抗氧化、降脂和抗肿瘤等多种药理活性[2-8]。其中，不饱和脂肪酰胺类生物碱如羟基-α-山椒素（HAS）、羟基-β-山椒素（HBS）已经被证实能够调节脂质代谢，对非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的预防具有潜在效果[9]。然而，对花椒生物碱的制备、富集纯化工艺优化的研究较少。花椒生物碱高效提取与纯化是其后续活性评价和产品开发的基础，有利于花椒药用价值的深度开发，因此优化花椒生物碱的富集纯化工艺具有重要意义。
大孔吸附树脂法是最常用的富集纯化手段，具有选择性好、吸附能力强、富集效果好、环保绿色等优点，在中药材、中药制剂方面应用广泛[10-11]。因此，本实验以HAS、HBS的得率为指标，筛选适宜纯化花椒生物碱的大孔树脂类型，采用单因素实验和正交试验确定树脂的最佳吸附、除杂、洗脱条件，建立大孔树脂富集纯化花椒生物碱的最佳工艺。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MSE）技术鉴定成分，以期为花椒生物碱的物质基础研究和进一步的综合开发利用提供科学依据。
1. 材料
1.1 样品
花椒药材（批号：20220705-2，购于陕西省渭南韩城市），经海军军医大学张成中副教授鉴定为芸香科花椒属红花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）的干燥果皮。
1.2 仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Acquity I-CLASSTM UPLC 超高效液相色谱系统、Xevo G2-XS 四级杆串联飞行时间质谱（美国沃特世科技有限公司）；R-100型旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；XS205DU电子分析天平（梅特勒托利多科技公司）。
HAS对照品（纯度≥98%，批号：P2834270，源叶）；HBS对照品（纯度≥98%，批号：P2832664，诗丹德）；95%乙醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技公司）；APS-17型、NKA-9型、HP-20型、AB-8型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；HPD-400型大孔吸附树脂（上海一飞生物科技有限公司）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱化学株式会社）。
2. 方法
2.1 花椒中生物碱成分含量测定方法的建立
2.1.1 溶液的配制
称取50 g花椒于圆底烧瓶中，加入500 ml的50%乙醇，95℃水浴加热，回流提取1 h，共提取3次。过滤后合并滤液，45℃减压浓缩至无醇味，过滤，加水分散至250 ml，即得上样液。
取216 ml上样液，上样于直径为2.7 cm、高度为18.9 cm的三菱HP-20型大孔树脂柱，动态吸附30 min，静置1 h后，取216 ml 20%乙醇除杂24 min；540 ml 80%乙醇洗脱1 h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得提取物粉末。
对照品溶液：精密称定HAS、HBS对照品适量，加50%乙醇定容，分别制成0.61 mg/ml、0.11 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液：精密称定适量提取物粉末，加50%乙醇定容后，0.45 μm微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。
2.1.2 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）；流速：0.3 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：5 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%三乙胺（B）；洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~30 min，35%→50%A；30~36 min，50%→90%A，36~39 min，90%A，39~40 min，90%→10%A。
2.1.3 线性关系
取HAS对照品溶液、HBS对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 ml置于5个5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，摇匀后得到系列梯度浓度的标准工作溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.2”项下色谱条件下进样。
2.1.4 精密度
取“2.1.1”项下对照品溶液2.0 ml置于5 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，混匀后0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次。
2.1.5 稳定性
取“2.1.1”项下的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24 h分别进样。
2.1.6 重复性
按照“2.1.1”项方法平行制备供试品溶液 6 份，在“2.1.2”项下色谱条件进样测定。
2.1.7 加样回收率
精密称取已知HAS、HBS含量的花椒生物碱粉末适量, 共取9份，分别准确加入HAS、HBS对照品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析并计算加样回收率。
2.2 大孔树脂纯化富集工艺优化
2.2.1 树脂类型
95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，95%乙醇淋至洗脱液澄清透明，水洗至洗脱液无醇味，备用。取预处理后的不同类型的大孔树脂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并进样，计算HAS、HBS的总得率。
2.2.2 上样量
湿法装柱，取“2.1.1”项下制备的上样液450 ml，以2 BV/h上样，流出液每30 ml收集1份。按“2.1.2”项下色谱条件进样，以累计上样体积（V/ml）为横坐标（X），以HAS、HBS的总泄漏率（%）为纵坐标（Y），绘制泄漏曲线。
2.2.3 单因素实验考察上样条件
除变量外固定其他工艺条件（树脂类型、上样量与树脂体积比、除杂溶剂、除杂体积、除杂流速、洗脱溶剂、洗脱体积及洗脱流速分别为三菱HP-20型、1 g∶2.5 ml、10%乙醇，2 BV、5 BV/h、70%乙醇、5 BV及5 BV/h）不变的情况下，分别考察上样液浓度（0.1、0.2、0.4 g生药/ml）、树脂柱径高比（1∶5、1∶7、1∶9）及吸附流速（1、2、4 BV/h）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响。
2.2.4 正交试验考察除杂、洗脱条件
在单因素实验的基础上，采用L9（33）正交试验进一步分析除杂条件（除杂溶剂、体积、流速）、洗脱条件（洗脱溶剂、体积、流速）对花椒生物碱中HAS、HBS总得率的影响（表1），总结最佳工艺并进行验证。统计分析使用SPSS 26.0 软件。
表 1 除杂、洗脱条件正交试验因素水平表条件 水平 因素 A因素溶剂 B因素体积（BV） C因素流速（BV/h） 除杂 1 蒸馏水 1 2 2 10%乙醇 2 3 3 20%乙醇 3 5 洗脱 1 55%乙醇 3 2 2 70%乙醇 5 3 3 80%乙醇 8 5 2.3 花椒生物碱的化学成分分析
2.3.1 样品制备
精密称定“2.2.4”项下以最佳工艺制备的花椒生物碱粉末5.0 mg，50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm微孔滤膜过滤备用。
2.3.2 色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3柱（2.1×100 mm, 1.7 μm）；检测波长：270 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：30℃；进样量：3 μl。流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：0~18 min，10%→35%A；18~24 min，35%→46%A；24~30 min，46%→90%A；30~32 min，90%A；32~33 min，90%~10%A；33~36 min，10%A。
2.3.3 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描。离子源温度120℃，雾化气流速为800 L/h，毛细管电压为3.0 kV。锥孔电压40 V，补偿电压80 V。低能量扫描电压6 eV，高能量扫描电压30~60 eV；喷雾器压力为6.5×105 Pa，气帘气体积流量为50 L/h，扫描范围m/z为50~
1500 。亮氨酸-脑啡肽（m/z∶ 554.261 5 [M-H]−）和（m/z∶ 556.277 1[M+H]+）作为外标进行质量实时校正，体积流量设为5 μl/min。MassLynx V4.1工作站使用MSE模式采集质谱数据。
3. 结果与分析
3.1 HPLC图与方法学实验结果
3.1.1 花椒生物碱的HPLC图
供试品HPLC图如图1所示，该色谱条件下，HAS与HBS色谱峰分离度大于1.5、理论塔板数均大于
30000 、峰形稳定、无干扰，能够满足样品分析检测要求。3.1.2 线性关系考察结果
以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到HAS的回归方程Y=
3312.7 X−8.887，r=0.999；HBS的回归方程Y=33030 X+12.061，r=0.999。即HAS、HBS分别在进样浓度为24.4~488 μg/ml、4.4~88 μg/ml范围内呈良好的线性关系。3.1.3 精密度实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.94%、0.34%，仪器精密度良好，符合定量测定要求。
3.1.4 稳定性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.20%、0.43%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
3.1.5 重复性实验结果
HAS、HBS峰面积的RSD分别为0.26% 和0.26%，表明方法重复性良好。
3.1.6 加样回收率实验结果
计算得到HAS低、中、高浓度的加样回收率分别为（103.66±0.62）%、（100.22±3.10）%、（102.47±1.24）%；HBS的低、中、高浓度的加样回收率分别为（101.35±0.89）%、（98.58±2.48）%、（98.86±1.02）%。结果表明该测定方法准确性好，可用于样品中HAS、HBS的含量测定。
3.2 大孔树脂纯化富集工艺
3.2.1 树脂类型的确定
使用三菱HP-20型树脂富集花椒生物碱类成分时，HAS、HBS两成分的总含量（X）最高且结果稳定，结果见表2。因此，优选三菱HP-20型大孔吸附树脂进行后续实验。
表 2 不同类型树脂对HAS、HBS总得率的影响（n=3）树脂类型 HAS、HBS
总浓度（mg/ml）HAS、HBS
总含量（%）$ \bar{X} $±SD（%） APS-17 2.42 4.06 4.06±2.17 NKA-9 2.08 3.50 3.50±1.76 宝恩HP-20 3.68 6.19 6.19±1.09 AB-8 3.58 6.02 6.02±1.28 HPD-400 3.59 6.03 6.03±0.98 三菱HP-20 4.10 6.89 6.89±0.62 3.2.2 上样量的确定
由图2可知，当上样液体积为90 ml时，花椒生物碱开始少量泄漏；随着上样体积增加，流出液中生物碱浓度呈现上升趋势；当上样液为210 ml时，累计泄漏率为9.61%，接近上样液中HAS、HBS总浓度的10%[12]。因此确定最大上样量为210 ml，即上样生药量与树脂体积比约为1 g∶2.5 ml。
3.2.3 上样条件的确定
由图3可知，当上样液浓度为0.2 g生药/ml时，HAS和HBS的得率最高；随着浓度升高，杂质增多，与生物碱竞争吸附活性位点，得率下降；此外高浓度上样液在静置吸附过程中较容易发生絮凝和沉淀现象[13-14]。故优选上样液浓度为0.2 g生药/ml。树脂径高比为1∶7、吸附流速为4 BV/h时，HAS和HBS的总得率最高。故选用树脂径高比为1∶7的三菱HP-20型树脂柱，动态吸附流速为4 BV/h。
3.2.4 除杂、洗脱条件的确定
如表3所示，以HAS、HBS总得率为指标时，影响三菱HP-20型大孔树脂纯化花椒总生物碱的除杂因素依次为除杂溶剂（A）>除杂流速（C）>除杂体积（B）。除杂的最佳条件为20%乙醇、流速为5 BV/h。除杂体积由2 BV提升到3 BV，结果差异并不明显，为节约溶剂、提高效率，优选2 BV为除杂体积。
表 3 除杂条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率（%） 除杂溶剂（A） 除杂体积（B） 除杂流速（C） 1 1 1 1 7.87 2 1 2 2 9.09 3 1 3 3 9.31 4 2 1 2 10.33 5 2 2 3 10.42 6 2 3 1 10.67 7 3 1 3 11.82 8 3 2 1 10.73 9 3 3 2 11.66 k1 8.75 10.06 9.71 − k2 10.44 10.07 10.34 − k3 11.37 10.48 10.52 − R 2.62 0.64 0.81 − 由表4可知，洗脱因素对HAS、HBS总得率的影响次序依次为洗脱溶剂（A）>洗脱流速（C）>洗脱体积（B）；最佳组合条件为洗脱溶剂80%乙醇，洗脱体积为5 BV，洗脱流速5 BV/h。
表 4 洗脱条件L9（33）正交设计及结果编号 因素 总得率
（%）洗脱溶剂（A） 洗脱体积（B） 洗脱流速（C） 1 1 1 1 2.55 2 1 2 2 5.38 3 1 3 3 7.15 4 2 1 2 5.75 5 2 2 3 8.11 6 2 3 1 9.57 7 3 1 3 9.20 8 3 2 1 8.28 9 3 3 2 6.36 k1 5.03 5.83 6.80 − k2 7.81 7.26 5.83 − k3 7.95 7.69 8.15 − R 2.92 1.86 2.32 − 3.2.5 花椒生物碱富集纯化最佳工艺及验证
实验确立花椒生物碱制备的最佳工艺为料液比1∶10，溶剂为50%乙醇，95℃水浴加热，每次回流提取1 h，提取3次，过滤后合并滤液；45℃减压浓缩至无醇味，纱布过滤，加水分散至生药浓度相当于0.2 g/ml的上样液；按上样生药量与大孔吸附树脂的体积比1 g∶2.5 ml，上样于三菱HP-20型大孔树脂，树脂柱径高比1∶7，动态吸附流速4 BV/h，静置1 h后，2 BV、20%乙醇以5 BV/h除杂；80%乙醇洗脱，体积5 BV，流速5 BV/h。收集洗脱液，45℃减压浓缩并干燥，即得花椒生物碱提取物。
由表5可知，三次重复实验花椒生物碱得膏率相近，富集纯化后HAS、HBS总含量的RSD为0.87%，证明本方法确定的大孔树脂富集纯化花椒生物碱的工艺稳定可靠，重复性高。此外，经纯化后花椒生物碱中HAS、HBS的含量分别为4.71%、1.02%，与富集纯化前相比，花椒生物碱的含量得到明显升高。
表 5 最佳工艺验证结果编号 得膏率
（%）富集前
总含量（%）富集后
总含量（%）富集后
总含量RSD（%）1 6.88 0.82 5.73 0.87 2 6.91 0.81 5.72 0.87 3 6.95 0.82 5.64 0.87 3.3 生物碱类化合物的鉴定
通过中药系统药理学数据库与分析平台、PubChem、Web of science等数据库和国内外文献，收集花椒的化学成分信息，包括绘制化学结构、整理化合物名称与分子式、利用MasslynxV4.1计算化合物精确质量等，建立共包含95种生物碱的花椒化学成分数据库。
由图4可知，在正离子模式下，生物碱类化合物得到了较好的分离。结合质谱数据、相关文献对照品的裂解规律和紫外吸收，并与自建的花椒化学成分数据库进行对比分析，共识别鉴定或推导出20种生物碱类化合物，包括木兰花碱、茵芋碱、HAS、HBS等（见表6）。
表 6 正离子模式下花椒生物碱类成分碎片离子及鉴定结果峰号 保留时
间（t/min）化合物 分子式 离子模式 理论值
（m/z）实测值
（m/z）误差
（ppm）碎片离子
（m/z）参考
文献1 4.716 木兰花碱 C20H24NO4+ [M]+ 342.170 5 342.169 0 −4.38 342.169 0[M]+, 297.110 6[M-C2H7N]+, 282.088 2[M-C2H7N-CH3]+, 265.085 2[C17H13O3]+, 222.065 3[C15H10O2]+, 191.084 6[C15H11]+, 194.071 4[C14H10O]+, 165.069 3[C13H9]+ [17] 2 5.483 ZP-amide D C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 3 5.877 ZP-amide E C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 320.182 5[M+Na]+ [18] 4 6.043 ZP-amide A C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 5 6.724 ZP-amide B C16H25NO4 [M+Na]+ 318.168 1 318.168 5 1.26 613.338 5[2M+Na]+, 319.169 2[M+H+Na]+, 318.168 5[M+Na]+, 296.183 8[M+H]+, 278.175 6[M-OH]+ [18-19] 6 6.793 ZP-amide C C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18, 20] 7 7.222 ZP-amide L C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 8 7.902 ZP-amide K C16H27NO4 [M+Na]+ 320.183 8 320.182 5 −4.06 321.186 4[M+H+Na]+, 320.182 5[M+Na]+ [18] 9 12.427 ZP-amide N C18H31NO4 [M+Na]+ 348.215 1 348.213 0 −6.03 349.217 7[M+H+Na]+, 348.213 0[M+Na]+ [18] 10 16.168 茵芋碱 C14H13NO4 [M+H]+ 260.092 3 260.092 3 0.00 229.037 0[M-2CH3]+, 227.056 6[C13H9NO3]+, 202.046 8[C11H8NO3]+, 199.062 5[C12H9NO2], 184.037 9[C11H6NO2]+, 156.043 4[C10H6NO]+, 77.037 7[C6H5]+ [21] 11 22.312 羟基-ε-山椒素 C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 302.171 4[M+K]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [22] 12* 22.701 羟基-α−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.184 4[M-OH]+ [23] 13* 23.113 羟基-β−
山椒素C16H25NO2 [M+Na]+ 286.178 3 286.178 3 0.00 287.179 5[M+H+Na]+, 286.178 3[M+Na]+, 246.187 5[M-OH]+ [23] 14 23.605 Zanthoamides A C18H27NO4 [M-OH]+ 304.191 3 304.191 3 0.00 345.184 4[M+H+Na]+, 344.181 6[M+Na]+ [24] 15 26.156 羟基-γ−山椒素 C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 16 26.379 羟基-γ−
异山椒素C18H27NO2 [M+Na]+ 312.193 9 312.193 5 −1.28 601.398 7[2M+Na]+, 313.164 8[M+H+Na]+, 312.193 5[M+Na]+, 272.200 9[M-OH]+ [22] 17 26.786 bungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 18 26.957 isobungeanool C18H29NO2 [M-OH]+ 274.217 1 274.216 5 −2.19 565.363 6[2M-OH]+, 314.210 3[M+Na]+ [15] 19 27.586 α−山椒素 C16H25NO [M+H]+ 248.201 4 248.201 2 −0.81 286.178 3[M+K]+ [23] 20 29.068 四氢花椒素 C18H33NO2 [M+H]+ 296.259 0 296.257 7 −4.39 318.237 8[M+Na]+, 279.137 4[M+H-OH]+ [25] *：为与对照品比对的化合物。 4. 讨论
实验前期，考察了酸提碱沉法与乙醇回流提取法，经比较发现两方法制备得到的花椒生物碱中HAS、HBS含量差别不显著。但以酸性溶液浸提生物碱时，耗时长、水溶性杂质较多，而且酸性溶液可能会使部分生物碱吸收氢离子导致质子化从而发生重排反应，破坏分子结构，综合考虑下本实验选择乙醇回流提取法。
HAS、HBS是花椒的代表性酰胺类生物碱，具有降脂、抗氧化、麻醉、神经营养等多种活性，受到研究者的广泛关注[15-16]。本实验确立的工艺能够有效富集花椒生物碱，显著提高HAS、HBS含量，为后续HAS、HBS单体化合物的制备提供了基础。实验过程中尝试通过优化除杂条件、分段收集乙醇洗脱液等方法分离黄酮与生物碱类成分，但UPLC-Q-TOF-MSE得到的BPI图中，8~11 min仍存在着部分响应较高的黄酮类物质无法完全分离，后续还需要探索其他有效的方法进一步去除黄酮类成分。
本实验在单因素实验基础上采用正交设计考察了花椒生物碱的最佳纯化工艺，利用UPLC-Q-TOF-MSE对生物碱成分进行分析鉴定，使用HPLC对制备得到的花椒生物碱中的HAS、HBS进行含量测定。本纯化工艺简单可行、稳定有效，可为花椒生物碱的综合开发利用及工业化生产提供科学依据，对提升花椒的综合经济价值具有深远意义。
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