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盆腔炎是一种常发病于年轻女性上生殖道感染的妇科疾病。临床研究发现，盆腔炎患者上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞[1]。在炎症和病原体的刺激下，巨噬细胞过度激活可以释放出大量炎症因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）。研究发现，NLRP3炎性小体激活可以促使caspase-1活化并切割IL-18、IL-1β前体，促进IL-18、IL-1β的成熟与释放，而抑制NLRP3炎性小体过度激活以减轻盆腔炎临床症状，并且与降低炎症因子、趋化因子释放有关。巨噬细胞在不同刺激下可以活化为不同表型：经典活化的M1型和替代活化的M2型。在含有脂多糖（LPS）和IFN-γ微环境中，巨噬细胞活化为变形虫样的M1型，参与炎症的发生。巨噬细胞在含有IL-4、IL-10、IL-13等抗炎因子微环境中被活化为M2型，表达精氨酸酶 1(Arg-1)和甘露糖受体1(CD206) 等特异性标志分子，参与炎症消退和组织重塑。研究发现，M1 /M2比例失衡是多种炎症性疾病的病理标志，如肥胖[2]、糖尿病[3]、动脉粥样硬化[4]等。
益母草碱（LEO）是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用的天然黄酮类化合物[5]，研究报道显示益母草碱可抑制Bax/Bcl-2信号通路激活抑制炎症因子的表达[6]。但鲜有益母草碱对巨噬细胞中NLRP3炎症小体影响的报道。本实验以益母草碱为研究对象，探讨其对巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响，以及对巨噬细胞M1/M2表型的调节作用。
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益母草碱（纯度>98%，西格玛奥德里奇贸易有限公司，上海）；脂多糖（L6143）、DMEM高糖培养基、胎牛血清、NuPAGE 10% Bis-Tris Gel、10×MOPS SDS 运行缓冲液、10×传输缓冲液、预制蛋白Marker、荧光定量PCR、反转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）；青-链霉素混合液、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；Griess试剂盒（江苏碧云天生物试剂公司）；IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；caspase-1兔抗单克隆抗体、β-actin兔抗单克隆抗体、羊抗兔/羊抗鼠单克隆二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；NLRP3兔抗单克隆抗体（英国Biorbyt生物试剂公司）；四甲基偶氮唑蓝溶液（MTT，美国Bio-Rad公司）；TRIzol Regent试剂盒（日本TaKaRa公司）。
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C57BL/6小鼠，6周龄，雌性，体重(20±2) g，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠饲养于实验室SPF级动物房，温度（22 ± 1）°C和湿度（60 ± 2）%，动物自由饮食。动物实验操作均通过实验动物伦理委员会批准。
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以颈椎脱臼的方式处死小鼠，置于75%的乙醇溶液中浸泡10 min，将15 ml PBS缓冲液注入小鼠腹中，仰卧平放，揉捏小鼠腹部5 min，吸出腹液，离心分离巨噬细胞，用DMEM培养液调整细胞浓度，在细胞培养箱中以5%CO2、37 ℃恒温孵育24 h后，换液，去除未贴壁细胞，即得到纯化的小鼠腹腔巨噬细胞[7]。以1.5×105个/ml密度接种于24孔（或96孔）板中培养24 h后，随机分为空白组、益母草碱（10 μmol/L）组、脂多糖（1 μg/ml）组、脂多糖+益母草碱（10 μmol/L）组，益母草碱预处理1 h之后加入脂多糖，放回孵箱中培养，24 h后，提取上清液和细胞蛋白，检测相关指标。
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脂多糖预处理巨噬细胞24 h后，在96孔板中每孔加入10 μl（5 mg/ml）MTT溶液，于37 ℃孵箱中培养，4 h后取出，移除细胞上清液，每孔加入200 μl二甲基亚砜，放置于恒温摇床震摇10 min，于562 nm处测定OA值，检测相关指标。
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Griess试剂盒取出，恢复至室温。将细胞上清液和标准品和加入到96孔板中，将试剂I 和试剂II 混匀加入96孔板中，避光，放置于恒温摇床震摇30 min，于470 nm处测定OA值，检测NO含量。
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提前将ELISA试剂盒取出，恢复至室温。稀释细胞上清液，配置标准品工作液，按照ELISA试剂盒说明书要求依次加入反应液，最后加入终止液，于450 nm处检测OD值，计算IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α含量。
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按照Trizol法提取巨噬细胞中总RNA，根据逆转录试剂盒说明书，进行RT-PCR反应。设定反应条件为：5 ℃预变性30 s，接着95 ℃变性6 s，最后60 ℃退火，延伸37 s，重复反应40个循环。RT-PCR引物设计见（表1）。以GAPDH为内参，利用2−∆∆Ct方法分析结果。
表 1 PCR引物序列
基因 引物序列（5′→3′） NLRP3 F: AGAAGAGACCACGGCAGAAG R: CCTTGGACCAGGTTCAGTGT ASC F: TGGATGCTCTGTACGGGAAG R: CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA caspase-1 F: CTTGGAAATAGCTCCCAGAA R: CATTTGGGAACTTCTCATCC TNF-α F: CCAATGGCAGAGTGGGTATG R: TGAAGAGGACCTGGGAGTAG iNOS F: GGGAATCTTGGAGCGAGTTG R: GTGAGGGCTTGGCTGAGTGA CD206 F: CAGGTGTGGGCTCAGGTAGT R: TGGTGAGCTGAAAGGTGA Arg-1 F: TTGCTGTGCTCCATAGTTTCCA R: CCATGCAAGTTTCCACTTGT GAPDH F: GGAGAAACCTGCCAAGTATG R: TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG -
脂多糖处理巨噬细胞24 h后，弃去细胞上层培养基，置于冰上，PBS洗涤3次，加入RIPA裂解液（含1%PMSF）反应30 min，离心，收集上清液。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量，配置缓冲液，变性。每孔10 μl加入到10%预制胶中，设置电压200 V电泳30 min，设置电压25 V电转30 min，TBST洗涤，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤，4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育30 min，TBST洗涤，加入曝光剂，曝光。
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采用SPSS18.0分析实验中所涉及的数据，组间比较方差齐，用LSD检验，方差不齐采用 Dunnett’s T3检验，以P < 0.05为统计学差异，数据结果用均数 ± 标准误（
$\bar x \pm s$ ）表示。 -
首先，观察益母草碱和脂多糖对巨噬细胞活力的影响（图1）。结果显示，脂多糖和益母草碱均能提高巨噬细胞的活力（P<0.05），当益母草碱与脂多糖共同刺激巨噬细胞时，巨噬细胞活力得到了进一步的增强（P<0.05）。
图 1 益母草碱对巨噬细胞活力的影响
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观察益母草碱对巨噬细胞炎症因子释放的影响，在脂多糖刺激下，巨噬细胞上清液中NO的释放增加，而益母草碱可以抑制巨噬细胞NO释放（图2A）。检测脂多糖对巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-18和IL-6释放的影响，结果发现，益母草碱可以降低巨噬细胞IL-1β、IL-18和IL-6释放（图2B-2D）。结果显示，益母草碱可以减少脂多糖引起的巨噬细胞炎症因子的释放。
图 2 益母草碱对巨噬细胞产生NO、IL-1β、IL-6及IL-18的影响
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细胞内IL-1β、IL-18等炎症因子的释放需要经过NLRP3炎症小体的激活，为此，观察了益母草碱对NLRP3炎症小体激活的影响。RT-PCR结果显示（图3），脂多糖刺激后，NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达增加，益母草碱可以降低mRNA表达。Western blot结果也证实益母草碱可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达（图4）。
图 3 益母草碱对NLRP3炎症小体相关蛋白mRNA表达影响
图 4 益母草碱对NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响
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应用RT-PCR检测益母草碱对巨噬细胞M1/M2表型的影响。正常情况下，巨噬细胞M1型标志物TNF-α和iNOS表达量较低，经脂多糖诱导刺激后TNF-α和iNOS的表达水平显著升高，益母草碱可以降低脂多糖引起的TNF-α和iNOS的mRNA表达（图5A和5B）。另一方面，脂多糖诱导刺激后，巨噬细胞M2型标志物Arg-1和CD206的表达水平降低，益母草碱预处理可以增加脂多糖引起的Arg-1和CD206表达（图5C和5D）。表明益母草碱可以调控脂多糖引起的巨噬细胞由M1向M2型转化。
图 5 益母草碱调节巨噬细胞由M1/M2型极化
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研究发现在盆腔炎患者的上生殖道内存在大量激活的巨噬细胞[8]。巨噬细胞是参与炎症反应的天然免疫细胞，当病原体入侵或者组织发生病变时，巨噬细胞分泌多种炎症因子，诱导更多的巨噬细胞活化、募集，加强局部抗炎作用。正常生理情况下，炎症因子的含量极少，具有维持机体免疫和调节心脑血管等功能[9]。但当机体长期受到病原微生物、致炎因子刺激时，会导致一系列病理改变，如长期慢性子宫内膜炎刺激可以增加子宫纤维化的发病率[10]。基于此，本实验利用革兰阴性菌来源的脂多糖刺激巨噬细胞，观察益母草碱对脂多糖诱导的巨噬细胞激活和炎症因子表达的影响。结果显示，脂多糖刺激可以引起巨噬细胞过度激活，相关炎症因子表达增加，益母草碱预处理可以减少炎症因子的表达和分泌，提示益母草碱的抗炎作用与抑制巨噬细胞中炎症因子的产生有关。
为了进一步阐明益母草碱的抗炎作用，本实验对NLRP3炎症小体进行了研究。大量研究发现脂多糖可以激活NLRP3炎症小体，引起细胞因子释放增加。鉴于盆腔炎是炎性刺激引起的病理变化，且抑制NLRP3炎症小体可以降低炎症，推测抑制NLRP3炎症小体过度激活可能对盆腔炎起到一定的治疗效果。本实验中发现，益母草碱可以通过抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3炎症小体相关蛋白表达，从而减少炎症因子释放，证实益母草碱可以抑制脂多糖诱导的巨噬细胞内NLRP3炎症小体的过度激活发挥抗炎作用。
巨噬细胞的表型转化在盆腔炎的病理进程中发挥着重要作用，M1型巨噬细胞主要发挥促炎、吞噬病原体的作用，M2型巨噬细胞主要发挥促进组织重塑、损伤修复等。因此，在盆腔炎疾病中，M1型巨噬细胞能够加重上生殖道炎症进展，而M2型巨噬细胞能抑制疾病进展。为了明确脂多糖对巨噬细胞分化的影响，使用RT-PCR实验验证不同处理方式对巨噬细胞分型的影响。结果显示，脂多糖能够促进M1型标志物TNF-α和iNOS的mRNA表达，而益母草碱能明显抑制 TNF-α和iNOS的mRNA表达，同时促进M2型标志物Arg-1和CD206的mRNA表达。上述结果提示，益母草碱能抑制脂多糖诱导的巨噬细胞向M1型分化以及IL-18、IL-1β、TNF-α表达，促进巨噬细胞向M2型分化。
在炎症反应过程中，脂多糖可以引起巨噬细胞中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等炎症因子表达增加，益母草碱可以通过抑制NLRP3炎症小体激活发挥其抗炎作用，提示抑制NLRP3炎症小体过度激活可能成为盆腔炎治疗的新策略，同时，本研究也为进一步开发益母草碱作为妇科用药提供理论基础。
Effect of leonurine on peritoneal macrophages M1/M2 phenotypic differentiation via inhibiting overactivation of NLRP3 inflammasome
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摘要:
目的 研究益母草碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞免疫应答影响及相关机制。 方法 分离小鼠腹腔巨噬细胞，用脂多糖和益母草碱预处理24 h，MMT法检测巨噬细胞活性；Griess法检测NO释放量；ELISA法检测IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的释放量；RT-PCR法检测NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、iNOS、Arg-1和CD206的mRNA表达量；Western blot检测NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量。 结果 益母草碱能显著抑制脂多糖引起的巨噬细胞上清液中NO、IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的释放。RT-PCR及Western blot实验结果显示，益母草碱可以抑制脂多糖引起的巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA及蛋白表达；益母草碱还能明显抑制脂多糖所诱导的巨噬细胞向M1型分化，并促进巨噬细胞向M2型分化。 结论 益母草碱能通过抑制NLRP3炎症小体，促进脂多糖诱导的巨噬细胞由M1表型向M2表型分化。 Abstract:Objective To find the effect of leonurine on LPS-induced macrophages activation and its potential mechanism. Methods Mouse primary peritoneal macrophages were isolated and pretreated for 24 h with LPS and leonurine. MTT assay was used to detect the cell viability of macrophages. The production of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-18 in culture medium were tested by ELISA, and the production of NO was detected by Griess reagent. The mRNA expression of NLRP3, ASC, caspase-1, TNF-α, iNOS, Arg-1 and CD206 were detected by RT-PCR, and the protein expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were detected by Western blotting. Results LPS can significantly increase the releases of NO、IL-1β、IL-6、TNF-α and IL-18 from macrophages. Leonurine can suppress the expression of pro-inflammatory factor levels, such as IL-1β (P<0.05), IL-18 (P<0.05), NO(P<0.05), IL-6(P<0.05) and TNF-α (P<0.05). Leonurine can decrease the activation of macrophage as well as the expression of NLRP3 Inflammasome.Protein expressions of NLRP3、ASC、caspase-1 were mitigated. Conclution Leonurine exerts beneficial effects through M1/M2 phenotypic differentiation of peritoneal macrophage via inhibiting overactivation of NLRP3 inflammasome. These findings suggest that leonurine might have a therapeutic potential for pelvic inflammatory disease. -
Key words:
- macrophage /
- inflammasome /
- leonurine /
- NLRP3 inflammasome /
- M1/M2 polarization
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超多孔水凝胶（SPF）是一种三维结构的亲水性高分子聚合网格，在水中能够溶胀但不溶解，且因其具有良好的生物相容及生物可降解性，被广泛应用于医学、药学等领域。与传统水凝胶相比，超多孔水凝胶通过致孔剂、模板等方法调整孔隙率，从而改变溶胀速率以及释药速率[1-3]。胰岛素等生物大分子类药物不仅体内稳定性差、易被酶解、生物半衰期短、不易透过生理屏障，故现有给药方式多以注射为主，患者依从性差[4]。有研究显示[5]，超多孔水凝胶承载胰岛素灌胃后可以显著降低大鼠血糖：给药2 h后血糖显著下降，4～6 h降至最低，但12 h即回至最初血糖的80%，说明该制剂起效快但持续时间短，血糖波动大，需频繁给药，患者依从性差。上述情况，结合胃肠道对胰岛素的灭活等原因，本实验拟合成具有缓释作用的聚（丙烯酸-丙烯酰胺）/O-羧甲基壳聚糖[P(AA-co-AM)/O-CMC]互穿网络聚合物超多孔水凝胶（SPH-IPN），以期通过皮下给药包载胰岛素的SPH-IPN后，实现长效、减小血糖波动的目的。
1. 材料与仪器
1.1 材料与试剂
丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）、N,N′-亚甲基-双丙烯酸胺（Bis）、过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆127（PF127，北京化工厂）；O-羧甲基壳聚糖（O-CMC，大连美仑生物技术有限公司）；戊二醛（GA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；姜黄素（宝鸡国康生物科技有限公司）；牛胰岛素（上海源叶生物有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、碳酸氢钠、盐酸、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯，实验用水为去离子水。
1.2 仪器
85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）；透析袋（Viskase，美国）；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Thermo，美国）；AVANCE III 400核磁共振谱仪（Bruker，德国）；FE28型pH计（Mettler Toledo，美国）；Waters UPLC：二元溶剂管理系统、在线脱气机、自动进样器、PDA检测器（Waters公司，美国）；TTL-DC型多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）；SHA-B双功能恒温水浴振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）。
1.3 实验动物
雄性SD大鼠，体重范围（220±20）g，合格证号：SCXK（京）2017-0002，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。
2. 方法与结果
2.1 超多孔水凝胶（SPH-IPN）的制备[5]
依次向西林瓶中加入50% AM和AA溶液，以10 mol/L NaOH调节pH至5.0。随后再加入2.5% Bis溶液、10% PF 127溶液、20%APS溶液和50 μl 16.7% TEMED溶液，磁力搅拌混匀。室温放置15 min后，逐滴加入 6% O-CMC溶液，使溶液中O-CMC/单体比（w/w）为0.144，迅速加入NaHCO3粉末，搅拌约20 s使其产生气泡，将其置于40 ℃水浴加热5 min，室温固化30 min，即得半互穿网络水凝胶（semi-IPN）。将所得semi-IPN置于GA/O-CMC比（w/w）为2∶10的GA溶液（用0.2 mol/L的盐酸溶液调节pH至1.0）中至将其吸干，室温放置1 h，得粗P(AA-co-AM)/O-CMC超多孔水凝胶（SPH-IPN）。将SPH-IPN置于0.1 mol/L盐酸溶液中，透析5 d，无水乙醇中脱水透析2 d，30 ℃烘干至恒重，干燥密闭保存，即得纯化后的SPH-IPN。
2.2 SPH-IPN的结构表征
将样品充分干燥，KBr压片法制样，使用傅里叶变换红外光谱仪测定500～4 000 cm−1波数的SPH-IPN的IR谱。将样品置于氧化锆样品管（A=4 mm），转速5 000 Hz，固体碳谱测定。
2.3 SPH-IPN的溶胀性能测定
取干燥的SPH-IPN，室温下浸于过量水中（pH 7.0），于不同时间点用筛网取出SPH-IPN，吸去表面残余水后称重，根据以下公式计算SPH-IPN在不同时间点的溶胀比（QS）：
$$ {Q_{\rm{S}}} = \frac{{{W_{\rm{S}}} - {W_{\rm{d}}}}}{{{W_{\rm{d}}}}} $$ 其中，WS为溶胀后SPH-IPN质量（g）；Wd为干SPH-IPN质量（g）。
2.4 SPH-IPN孔隙率测定
采用乙醇替代法测定SPH-IPN的孔隙率[6]。取干燥的SPH-IPN，置无水乙醇中浸泡12 h，取出后吸去表面残余乙醇，称重，根据以下公式计算孔隙率：
$$ {\text{孔隙率}}=\frac{{M}_{2}-{M}_{1}}{\rho V}\times 100\;\text{%}$$ 其中，M1为干SPH-IPN质量（g）；M2为乙醇浸泡后的SPH-IPN质量（g）；ρ为乙醇密度（g/cm），V为SPH-IPN体积（cm3，以游标卡尺测量长方体SPH-IPN的长、宽、高后计算而得）。
2.5 载胰岛素SPH-IPN的制备及含量测定
2.5.1 载胰岛素SPH-IPN的制备
取胰岛素15 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加0.1 mol/L pH 7.4 PBS溶解并定容至刻度，得1.5 mg/ml的胰岛素溶液。称取50 mg SPH-IPN置装有10 ml胰岛素溶液的西林瓶中，37 ℃温浴放置2 h，取出，置烘箱内，30 ℃恒温干燥。
2.5.2 载药量的测定
取胰岛素SPH-IPN适量，研磨粉碎，取20 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加入0.1 mol/L pH 7.4 PBS，定容至刻度。37 ℃温浴2 h，超声10 min，精密量取上清液20 μl注入HPLC仪，记录色谱图，计算胰岛素含量，并根据以下公式计算载药量：
$$ {\text{载药量}}(\%)=\frac{cV}{M}\times 100$$ 其中，c为测得胰岛素的浓度（mg/ml），V为量瓶体积（ml），M为SPH-IPN的质量（mg）。
2.6 载胰岛素SPH-IPN降血糖实验
2.6.1 不同方法载药SPH-IPN的制备
按“2.5.1”项下方法制备载胰岛素SPH-IPN，采用冷冻干燥法将其冻干即得含胰岛素的冻干SPH-IPN。称取空白凝胶200 mg置于1.5 mg/ml的胰岛素溶液37 ℃中溶胀2 h，备用，即得含胰岛素的预溶胀SPH-IPN。
2.6.2 糖尿病大鼠模型的建立
给大鼠喂食高脂饲料（88.8%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油和 0.2%胆盐[7]）喂养4周，动物自由进食和饮水，每周记录体重。于喂养的第28天晚禁食，在第29天一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg，将一次性注射STZ 3 d后大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准[8]。对照组大鼠则腹腔注射无菌生理盐水（0.3 ml/100 g）。注意测血糖前应禁食12 h，空腹测血糖。造模期间要防止感染，注意消毒。未造模成功的大鼠再次注射STZ35 mg/kg，3 d后测血糖验证是否造模成功。
2.6.3 分组、给药及血糖测定
取糖尿病大鼠12只，按随机数字表分为2组，即模型1组和模型2组；取正常大鼠12只，按随机数字表分为2组，即正常1组和正常2组。模型组1组和正常1组皮下埋植含胰岛素的预溶胀SPH-IPN，模型2组和正常2组皮下埋植含胰岛素的冻干SPH-IPN。给药后分别于1、2、4、6、8、10、12、24、28、32、36、48、60、72 h不同时间间隔大鼠尾部取血0.02 ml，用血糖仪测定血糖值，考察不同时间血糖值的变化情况。
3. 实验结果
3.1 IPN结构表征
3.1.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）
图1为SPH-IPN的FTIR图。在1 651 cm−1处有-COOH的伸缩振动峰，且1 615 cm−1附近无AA和AM的C=C双键吸收峰，说明已聚合成P(AA-co-AM)，SPH-IPN中存在P（AA-co-AM），图中3 335和2 922 cm-1处分别为-O-H和-C-H的伸缩振动峰；1 604和1 416 cm−1处分别为羧酸盐-COO-的反对称伸缩振动峰和对称伸缩振动峰；1 086、1 044和1 171 cm−1处分别为O-CMC中糖环羟基-CH-OH、一级羟基-CH2-OH和醚基C-O-C中的C-O伸缩振动峰。以上结果表明SPH-IPN中存在P(AA-co-AM)，还存在的一些杂峰可能是还有一些未反应单体未被除尽。
3.1.2 核磁共振（13C-NMR）
图2为SPH-IPN的13C-NMR图。图中41.926×10−6为P(AA-co-AM)上主链碳原子的化学位移峰；179.499处为羧基碳原子的化学位移峰，说明结构中含有羧基官能团，AA与AM已聚合形成P(AA-co-AM)。
由于制得的水凝胶未找到合适的溶液将其溶解，因此在测定核磁共振图谱时，采用的是固体核磁技术[9]。
综合红外和碳谱结果可知，通过该方法可聚合形成P(AA-co-AM)结构，而该结构又是超多孔水凝胶SPH-IPN的主要结构，由此可说明已成功聚合SPH-IPN。
3.2 SPH-IPN的溶胀性能
图3为不同温度介质中SPH-IPN的溶胀曲线，可见随着温度升高，SPH-IPN的溶胀速率加快，平衡溶胀比增大，原因是温度较高时相互缠绕的聚合物链松开，破坏分子间的氢键，增加链运动，水分子在凝胶骨架内外的扩散速率加快，从而促进了聚合物的溶胀[10]。
3.3 SPH-IPN孔隙率的测定
表1为SPH-IPN孔隙率测定结果，所制SPH-IPN超多孔水凝胶空隙分布均匀。除此之外，与传统水凝胶相比[11]，孔隙率高，更利于药物的释放。
表 1 SPH-IPN的孔隙率测定结果干重M1
(m/g)湿重M2
(m/g)乙醇密度
(g/cm3)体积
(V/cm3)孔隙率
(%)平均值
(%)RSD
(%)0.5425 0.6327 0.816 0.13 85.03 81.63 3.88 0.5751 0.6779 0.816 0.16 78.74 0.5628 0.6621 0.816 0.15 81.13 3.4 SPH-IPN载胰岛素含量测定结果
37 ℃时SPH-IPN溶胀比较大，温度过高易引起胰岛素变性，故选择37 ℃温度载药，胰岛素的载药量试验结果见表2。
表 2 SPH-IPN对胰岛素的载药量试验组 载药量(w/w,%) 平均值(w/w,%) RSD（%） 1 3.13 3.19 1.88 2 3.25 3 3.20 3.5 载胰岛素凝胶降血糖实验
图4是含胰岛素的预溶胀SPH-IPN和冻干SPH-IPN对糖尿病大鼠和正常大鼠降糖作用的比较。图中预溶胀模型组在10 h时血糖值才有所降低，最低值为10 h的16.8 mmol/L，之后血糖又开始慢慢升高；预溶胀正常大鼠组在给药4 h后血糖开始降低，到24 h时血糖达到7.3 mmol/L，之后维持平稳状态；冻干模型组在包埋1 h后血糖便开始下降，血糖值降到6.7 mmol/L，在24 h后血糖开始慢慢升高，冻干正常大鼠组在1 h后血糖降至5.3 mmol/L，之后虽有起伏，但也一直在正常范围内。说明冻干凝胶的降糖作用较预溶胀组好，冻干凝胶在1～24 h时间段内的降糖作用较平稳。
4. 讨论
4.1 SPH-IPN的制备
本实验选用了能够迅速聚合的水溶性原料AA、AM为聚合反应单体；以APS/TEMED为引发体系；PF127为泡沫稳定剂，使产生的泡沫稳定时间更长；NaHCO3为起泡剂；O-CMC在合成过程中作为增稠剂，维持合适的起泡速率，使产生的气泡均匀、稳定，不致产生的气泡过快逸散[12]。采用溶液聚合法制备了含semi-IPN的水凝胶。因为该聚合反应在反应过程中会产生大量热量，这对泡沫的稳定极为有利，因此在常温条件下便能进行聚合反应，条件温和。以pH 1.0的GA溶液交联O-CMC时，可避免过度溶胀对孔隙结构的破坏，且pH 1.0时GA的交联能力较好。除此之外，相较于参考文献[5]，本实验中O-CMC/单体比较高，当O-CMC/单体比为0.144时，虽然可形成具有大量相互贯通孔隙的聚合物，但会导致其溶胀速率减慢，溶胀比降低，从而影响载药量和释药速率。随着溶胀速率减慢，药物溶出速率也相应减慢；随着溶胀比的降低，吸收的药物溶液减少，载药量随之降低。本实验提高O-CMC/单体的目的是希望通过减慢SPH-IPN的溶胀速率，从而尝试制备缓释制剂。
4.2 水凝胶的载药方法
水凝胶的载药方法通常有2种：一是将药物与单体溶液混合，随着单体聚合、交联将药物包埋于水凝胶中[13]；另一种方法为吸附载药，即凝胶在被载药液中溶胀，将载药水凝胶干燥，实现药物包埋[14]。姜黄素属于脂溶性药物，课题组前期研究结果表明，0.5%的SDS对姜黄素有一定的增溶效果；0.1 mol/L pH 7.4 PBS中SPH-IPN的溶胀比较大，对胰岛素具有一定的增溶作用，故分别选用这两种溶剂配制胰岛素溶液。
4.3 超多孔水凝胶的释药性能
文献[5]表明，超多孔水凝胶载药后的释药性能与O-CMC的含量、pH、离子强度、温度等多个因素有关，同时也有可能与载药SPH-IPN的制备过程有关。
笔者曾用SPH-IPN包载姜黄素，并开展探索性实验。结果发现20、40、60目不同粒径的凝胶累积释放率不同，前13 h三者的累积释放率均几乎一样（接近0），13 h后累积释放率逐渐增加，以40目凝胶的效果最佳，48 h后达到6.00%，明显高于其他组，但其释放速度慢，见图5。灌胃给予载姜黄素SPH-IPN后，部分大鼠排泄物中可见载姜黄素SPH-IPN，说明SPH-IPN在体内溶胀速率很慢；而载姜黄素SPH-IPN组和姜黄素原药组，灌胃后大鼠眼眶血中均未检出姜黄素，也进一步体现SPH-IPN未促进姜黄素的吸收。
将载胰岛素SPH-IPN予灌胃给药溶胀很慢，降糖效果极不明显，为延长SPH-IPN溶胀时间，最终考虑将其进行皮下包埋给药。
载胰岛素SPH-IPN皮下包埋给药发现，载胰岛素冻干SPH-IPN组的降糖效果优于载胰岛素溶胀SPH-IPN组，表明载药SPH-IPN的释放性能除与溶胀比有关外，其制备过程也会一定程度影响被载药物的疗效，与文献[5]报道一致。实验中将冻干组和溶胀组均进行包埋，均可延长溶胀时间，但冻干SPH-IPN组的降糖效果优，皮下包埋2 h后表现出明显的降糖作用，相比溶胀组而言，起效时间快（8 h左右）且持续时间长，24 h之内均具有良好的降糖作用。提示我们在制备载药SPH-IPN的过程中应该时刻关注被载药物的活性及稳定性，应在适当的条件下对药物进行包载以提高药物疗效，同时也说明载胰岛素冻干SPH-IPN可作为控释制剂，实现调节大鼠血糖的目的。结合实验结果分析可知，SPH-IPN能够增强药物的稳定性，提高生物利用度，比较适合作为蛋白质药物给药载体。
4.4 SPH-IPN载胰岛素的微针给药展望
文献研究发现，胰岛素经皮给药具有不错的疗效，与皮下给药效果几无差异，且依从性好，成为最新、有效、方便的给药方式。Norduist等[15]将微针贴剂用于胰岛素给药，结果发现，血浆胰岛素浓度变化与传统的皮下注射并无太大差异，但微针贴剂能极大地提高实验大鼠的依从性。无痛中空微针皮内胰岛素给药系统已获得 FDA批准，进入II期临床，相关产品有以色列纳米通道技术公司采用MEMS技术开发的中空微针器具，其中包括用于无痛释放胰岛素薄片与胰岛素微型泵相结合。Liu等[16]将可溶性材料透明质酸制备成负载胰岛素的微针阵列。在体实验发现，负载胰岛素的微针能够在1 h内完全溶解，携带的胰岛素快速释放入体内。
与上述研究及应用相比，本实验的载胰岛素SPH-IPN，释放药物无需微型泵，皮下包埋给药可以24 h内保持平稳、正常的血糖浓度，适合作为一日一次给药的控释制剂。为了提高患者的依从性，进一步研究将载胰岛素SPH-IPN制备为微针阵列的形式，以期得到一种方便、快捷、安全的胰岛素缓释递药系统。
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表 1 PCR引物序列
基因 引物序列（5′→3′） NLRP3 F: AGAAGAGACCACGGCAGAAG R: CCTTGGACCAGGTTCAGTGT ASC F: TGGATGCTCTGTACGGGAAG R: CCAGGCTGGTGTGAAACTGAA caspase-1 F: CTTGGAAATAGCTCCCAGAA R: CATTTGGGAACTTCTCATCC TNF-α F: CCAATGGCAGAGTGGGTATG R: TGAAGAGGACCTGGGAGTAG iNOS F: GGGAATCTTGGAGCGAGTTG R: GTGAGGGCTTGGCTGAGTGA CD206 F: CAGGTGTGGGCTCAGGTAGT R: TGGTGAGCTGAAAGGTGA Arg-1 F: TTGCTGTGCTCCATAGTTTCCA R: CCATGCAAGTTTCCACTTGT GAPDH F: GGAGAAACCTGCCAAGTATG R: TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG 
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