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益母草（Leonurus japonicus Houtt.）作为传统中药，以往主要用于治疗妇产科疾病。近年来的研究发现，益母草中的主要化学成分为生物碱、类黄酮和二萜等[1]，其中，益母草碱（4-胍基-正丁基-丁香酸酯，又名SCM-198）是一种具有抗血小板聚集[2]、改善微循环、保护心肌[3-4]等多种生物活性的重要生物碱，有广泛的临床应用前景[5-7]。本研究采用SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验方法对益母草碱的致畸性进行评价；同时采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验这3个标准试验组合的方法，分别从体外到体内，从微生物、离体真核细胞到整体动物水平系统检测其致突变性[8-9]，旨在为临床安全用药提供参考。
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益母草碱（含量99.09%，复旦大学药学院，批号：20110329）。使用前以0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液，供试；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：F20100420，国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（批号：T20101110，国药集团化学试剂有限公司）；丝裂霉素C（批号：101202，浙江海正药业股份有限公司）；环磷酰胺（ 批号：10110621，江苏恒瑞药业股份有限公司）；敌克松（批号：PS-262）、甲基磺酸甲酯（批号：129925）、4-硝基喹啉-N-氧化物（批号：N8141）、2-氨基芴（批号：A5550-0）、1,8-二羟基蒽醌（批号：S52075-139）均购自Sigma公司；大鼠肝微粒体酶S9（批号：2715，美国Moltox公司）；组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌共5支，分别为TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由国家上海新药安全性评价中心赠予，储存于液氮中。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予,储存于液氮中。
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SD大鼠（SPF级），雌性100只，雄性80只。雌鼠5~6周龄，体重110~140 g；雄鼠6~7周龄，体重150~180 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001629237。ICR小鼠（SPF级），共46只，雌雄各半。雌鼠7~8周龄，体重21~23 g；雄鼠7~8周龄，体重23~25 g（上海西普尔－必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001610906。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2007-0003。
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按《药物生殖毒性研究技术指导原则》[10-11]的要求，将雌鼠与雄鼠1:1合笼，交配第2天起对雌鼠进行阴道涂片检查，若显微镜下查见精子则视为交配成功，成功当天即为妊娠GD0。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4组，每组20只。急性毒性试验结果提示SD大鼠经口灌胃给予益母草碱，最大耐受量（MTD）>5 000 mg/kg，因此，本试验设高、中、低剂量组（2 000、1 000和500 mg/kg体重），另设溶媒对照组，分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d（给药起止时间为GD6~GD15）。于GD0、GD5、GD6~GD15和GD20 时称取孕鼠的体重。在GD20时处死孕鼠，观察外观是否异常，同时记录其活胎数（区分雌雄）、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠，取其中约一半数量固定于Bouin液中作内脏检查，另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本，用于骨骼畸形检查。
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按《药物遗传毒性研究技术指导原则》[12-13]的要求，分别应用反映基因突变的Ames试验[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验（体外培养CHO细胞）[15]和小鼠微核试验（体内）[16]方法。
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应用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535这5支菌株，设5个剂量组（5 000、500、50、5、0.5 μg/皿），此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组，每个剂量组及对照组均设3个平行皿（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在有或无代谢活化系统S9的条件下接触受试物，并用最低极限的琼脂培养基培养48~72 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较[8, 17-18]。重复试验一次。
表 1 阳性对照品的名称及剂量
菌株 无代谢活化系统（−S9） 有代谢活化系统（+S9） 阳性对照品名称 加入量
(μl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)阳性对照品名称 加入量
(µl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)TA97 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA98 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA100 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA102 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 1,8-二羟基蒽醌 100 500.0 50.0 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 100 5.0 0.5 环磷酰胺 100 500.0 50.0 -
在有或无代谢活化系统S9的条件下，在体外培养的CHO细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品，反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1000、500和250 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml，另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液，继续培养至24 h，最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞，将细胞终止在有丝分裂中期，经0.75%氯化钾低渗、1∶3醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa染色后，在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变[8, 17-18]。
观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞，采用盲法读片，受试物及溶媒对照组每组观察200个细胞，阳性对照组观察100个细胞，计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目[8, 17-18]（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），计算畸变率。
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受试物采用经口灌胃的方式（与临床给药途径一致）给药，急性毒性试验结果提示ICR小鼠经口灌胃给予益母草碱，MTD>5 000 mg/kg，故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000和500 mg/kg体重，同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺（阳性对照），给药容量为10 ml/kg体重。溶媒对照组以10 ml/kg体重的容积经口灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。小鼠在给药24 h后处死，每只动物取其两侧股骨骨髓，制2张涂片，用甲醇固定，然后用pH6.8的Giemsa染液进行染色。
每只小鼠镜检1 000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE值，以评价受试物是否有骨髓毒性[8, 17-18]。
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使用分析软件SPSS11.0，计量指标采用（
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ ）表示，各组之间的比较采用方差分析，率的比较采用χ2检验。 -
比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在剂量-反应关系，则判断为阳性。
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染色体畸变细胞的发生率须与溶媒对照组进行比较分析后方可判定，>10%者判为阳性。
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采用χ2检验比较给药组与对照组之间的差异是否具有统计学意义。
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益母草碱各受试剂量作用下在给药期间（GD6~GD15）、停药后（GD15~GD20）以及整个孕期（GD0~GD20）孕鼠的增重与对照组相比，差异均无统计学意义；各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比，差异均无统计学意义；此外，各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示，益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。
由表2可见，受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。
表 2 益母草碱对胎鼠生长发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 184 174 160 168 性别比例（雄:雌） 93∶91 81∶93 80∶80 88∶80 活胎体重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 3.28±0.40 3.25±0.40 3.30±0.40 3.31±0.46 胎盘重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 0.56±0.08 0.55±0.09 0.56±0.08 0.55±0.09 活胎身长($ \bar x \pm {\rm{s}}$, cm) 3.60±0.18 3.57±0.20 3.57±0.21 3.61±0.22 由表3~5可见，受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。
表 3 益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 颈椎数 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 胸椎数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 腰椎数 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 尾椎 2.3±0.6 2.3±0.7 2.4±0.6 2.4±0.6 骶椎数 5.5±0.6 5.5±0.6 5.6±0.6 5.5±0.5 肋骨数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 掌骨数 7.3±1.0 7.3±1.0 7.5±0.9 7.0±1.0 近端指骨数 0.1±0.4 0.3±1.1 0.2±0.9 0.3±1.0 远端指骨数 9.9±0.4 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.2 跖骨数 8.0±0.2 8.0±0.2 7.9±0.4 8.0±0.0 近端跖骨数 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 远端跖骨数 10.0±0.3 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.0 表 4 益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响
枕骨分级 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 Ⅰ级枕骨数[n (%)] 27（30.7） 25（29.4） 31（40.3） 29（37.2） Ⅱ级枕骨数[n (%)] 60（68.2） 59（69.4） 45（58.4） 49（62.8） Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1（1.1） 1（1.2） 1（1.3） 0（0） Ⅳ级枕骨数[n (%)] 0（0） 0（0） 0（0） 0（0） 表 5 益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 骨化不全数 0.7±0.8 0.5±0.6 0.7±0.7 0.8±0.7 未骨化数 1.4±1.1 1.4±1.1 1.0±1.2 1.3±1.0 -
受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染，并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6、表7，5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象[8, 17-19]。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9的条件下，对5支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量-反应关系（表8）。
表 6 益母草碱对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿,
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2 空白对照组 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3 溶媒对照组 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1 阳性对照组 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15 表 7 益母草碱对5支菌株的回变菌落数(个/皿，
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5 空白对照组 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1 溶媒对照组 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2 阳性对照组 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53 表 8 益母草碱对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果（加或不加S9系统）
组别（μg/ml） 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着
丝粒三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 250 +S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 500 +S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 −S9 200 8 0 0 0 0 0 0 0 3 1.5 1 000 +S9 200 5 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 −S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶媒对照组 +S9 200 2 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 溶媒对照组 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 +S9 100 20 0 0 2 0 0 0 0 17 17* 阳性对照组 −S9 100 18 3 0 0 1 0 0 0 18 18* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 -
阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h在有或无代谢活化系统S9的情况下，染色体畸变率分别为17%和18%，均>10%，为阳性结果；溶媒对照品以及250、500和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%；24 h、无S9组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%，综上，溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，为阴性结果[8, 17-18]。
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各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE微核发生率分别为4.09‰和2.94‰，阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为15.93‰和16.28‰，与溶媒对照组相比，差异均有统计学意义，受试物在500、1 000、2 000 mg/kg剂量下对雌性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰，对雄性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰，由上述结果可见，受试物各剂量组均未诱发ICR小鼠骨髓PCE微核率的明显增高[8, 17-18, 20]。
表 9 益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果
组别（mg/kg体重） 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（$\bar x $±s） 微核率（$\bar x $±s,‰） 500 雌 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48 雄 5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81* 1 000 雌 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28 雄 5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30* 2 000 雌 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47 雄 5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43 溶媒对照组 雌 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88 雄 5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98 阳性对照组 雌 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50* 雄 5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 -
益母草作为传统中药，其应用广泛且历史悠久，主要用于治疗月经不调、痛经、恶露等妇科疾病，同时还用于消肿化瘀、排水利尿。而现代医学已证明益母草中的生物碱——益母草碱在其中发挥了主要功效，益母草碱具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制红细胞和血小板聚集[2]等多种功能，对改善微循环、抗自由基活性和减少细胞内钙超载[3-4]也有显著作用。上述功能有助于预防心血管疾病和脑血管疾病，抑制心肌纤维化[7]、改善认知、促进神经元修复[21]、抗炎[22]、防治糖尿病[23]等，因此，益母草碱在心脑血管、代谢病、肾病、生殖[24]等临床研究领域有相当广泛的应用前景[5-7]。进行安全性评价是药物研发和安全使用的重要环节，但目前对益母草碱的基础毒性和特殊毒性的研究尚未见相关文献报道。研究其遗传毒性和生殖毒性对于临床安全用药具有重要的指导意义。
本研究采用国际通用的研究方法，对益母草碱的生殖毒性和遗传毒性进行了系统的评价。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，自大鼠胚胎着床至硬腭闭合这个阶段孕鼠口服益母草碱，通过观察受试物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响检测其致畸性。药物遗传毒性的研究根据国家相关标准，必须遵循原核生物与真核生物、体内系统与体外系统相结合的原则进行，本研究采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三者标准组合方案，其检测范围涵盖了基因突变、染色体结构和数目畸变等多个遗传学终点。Ames试验用于检测DNA损伤引起的基因突变，组氨酸营养缺陷型（his-）鼠伤寒沙门菌在受到诱变剂作用后会发生大量回复突变，可自行合成组氨酸，形成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化后才具有致突变作用，因此，在测试系统中又设置了平行组加入哺乳动物微粒体酶，以弥补体外试验缺乏代谢活化系统的不足。染色体畸变试验常用于检测化合物是否引起细胞染色体结构和数目的改变。诱变因素在损伤染色体的同时也可能损伤纺锤体，从而导致染色体的丢失并形成微核，应用微核试验检测染色体或有丝分裂器的损伤，具有直观、简便等优势[9]。
研究结果显示，在本试验剂量条件下，益母草碱未观察到明显的胚胎-胎仔发育毒性以及遗传毒性，该结论可为益母草碱在临床上的安全使用提供参考和指导，有助于降低用药风险。
Evaluation for embryo-fetal developmental toxicity and genetic toxicity of leonurine
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摘要:
目的 检测益母草碱的发育毒性和遗传毒性。 方法 在SD孕鼠妊娠第6~15天经口灌胃给予500、1 000和2 000 mg/kg体重的益母草碱，同时设溶媒对照组，经口灌胃0.5% CMC-Na溶液。妊娠第20天剖杀孕鼠，分析其生殖毒性。分别采用反映基因突变的鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Ames试验）、反映染色体畸变的细胞染色体畸变试验（体外培养CHO）和ICR小鼠骨髓微核试验（体内）检测益母草碱的遗传毒性。 结果 在500、1 000和2 000 mg/kg剂量益母草碱的作用下孕鼠的增重与对照组相比，差异均无统计学意义；各受试剂量组孕鼠各项指标与对照组相比，差异均无统计学意义；各剂量组胎鼠各类指标与溶媒对照组相比，无明显差异。Ames试验结果提示：在0.5、5、50、500、5 000 μg/皿受试剂量下，在有或无代谢活化S9系统时，与溶媒对照组相比，受试物对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌（TA97、TA98、TA100、TA102及TA1535）所诱发的回复突变菌落数均相近。染色体畸变试验结果显示：250、500和1 000 μg/ml 3个剂量的受试物，对有或无代谢活化系统S9培养的CHO细胞的染色体畸变率无明显影响。微核试验显示100、500和2 000 mg/kg各个剂量组对ICR小鼠的微核诱发率与溶媒对照组比较均无显著差异（P>0.05）。 结论 益母草碱在500、1 000和2 000 mg/kg剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性、胎儿毒性和致畸作用。益母草碱对鼠伤寒沙门菌无致突变性，对哺乳动物培养细胞的染色体无致畸变作用，对ICR小鼠无诱发骨髓嗜多染红细胞微核的效应。上述结果表明在本试验条件下，益母草碱无发育和遗传毒性。 Abstract:Objective To evaluate the developmental toxicity and genotoxicity of leonurine. Methods Leonurine was given orally to SD pregnant rats on the 6th to 15th day of pregnancy at the dose of 500, 1 000 and 2 000 mg/kg body weight. The control group received 0.5% CMC-Na solution orally. Pregnant rats were sacrificed on the 20th day of pregnancy to analyze the reproductive toxicity. Ames test, in vitro chromosomal aberration test of CHO cell and in vivo micronucleus assay were performed to investigate the genotoxicity of leonurine. Results There was no difference statistically in weight gain of pregnant mice between two groups at the dose of 500, 1 000 and 2 000 mg/kg of motherwort alkaloids. In vitro CHO cell chromosomal aberration test indicated that there was no statistical difference between leonurine groups (doses of 250, 500 and 1 000 μg/ml) and the solvent control group with and without metabolic activation system S9. The number of micronuclei in ICR mice did not increase (P>0.05) in the mouse bone marrow micronucleus test at the doses of 100, 500 and 2 000 mg/kg. Conclusion No significant maternal toxicity, embryo toxicity, fetal toxicity and teratogenic effects were observed with leonurine at 500, 1 000 and 2 000 mg/kg doses. Leonurine was not genotoxic in Salmonella typhimurium reverse mutation test, in vitro CHO cells chromosome aberration test or mouse bone marrow micronucleus test. It showed that leonurine had no developmental toxicity and genotoxicity under the conditions of the experiment. -
Key words:
- leonurine /
- developmental toxicity /
- genotoxicity
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1. 电离辐射的危害
随着全球经济的高速发展和科技的不断进步，核工业在军事、医疗等领域得到全面发展，但伴随而来的是对从业人员和附近居民造成严重的辐射危害。
辐射是指能量以电磁波或粒子的形式向外传播的现象，可分为电离辐射和非电离辐射。拥有足够高能量而使原子电离的辐射为电离辐射，它包括X射线、α射线、β射线、γ射线等，具有潜在的致癌性。非电离辐射能量较低，不会电离物质而会使物质内粒子运动，包括红外线、紫外线和微波等[1]。
辐射可引起全身性的放射病，几乎所有系统、器官均可发生病理性改变，其中以神经系统、消化系统和造血器官的改变最为明显，会诱发心血管疾病、糖尿病甚至癌突变。辐射对机体的损伤可分为急性和慢性放射性损伤。短时间内接受高剂量的照射，可引起机体的急性损伤，常见于核事故和放射治疗患者。剂量低于1 Gy时少数会出现轻微症状，剂量在1~10 Gy时，会出现造血型急性放射病；剂量超过10 Gy，会出现高致死率[2]。而长期接受超剂量的全身或局部照射，可引起慢性放射病，如皮肤损伤、造血障碍、白细胞减少、生育功能受损等。此外，辐射还能直接导致视力下降、视网膜脱落，诱发孕妇流产、不育、畸胎、儿童发育不足等[3]。
2 抗辐射天然产物的作用机制[4]
抗辐射药物是指在辐射前或后给予药物预防或治疗，可减轻或修复辐射损伤的药物。现有的抗辐射化学合成药物主要包括细胞因子、含硫化合物和激素类药物[5]，因其毒副作用较大而应用受限，近年来天然产物因其毒副作用小、多成分多靶点的独特优势受到广泛的关注。目前认为抗辐射天然产物的作用机制主要有以下4个方面。
2.1 防护DNA损伤
辐射损伤可破坏DNA分子的结构与功能，导致DNA碱基破坏、DNA分子间交联、DNA双链或单链断裂、糖基破坏等。此外，辐射还可导致细胞周期改变以及DNA合成抑制，直接影响细胞增殖。抗辐射天然产物可通过减轻或抑制辐射致细胞周期的缩短，避免或修复DNA损伤而起辐射防护作用。
2.2 清除自由基
人体产生的80%自由基是由水分子组成的。辐射可引起水分子生成强活性的氧化自由基，主要包括·OH、
${\rm{O}}^-_2 $ 、H2O2、·NO等，其中，·OH氧化性最强，可导致组织细胞产生脂质过氧化物[6]。人体由于自由基的产生造成的破坏主要有3个方面：破坏细胞膜；使血清抗蛋白酶失去活性；损伤基因导致细胞变异，如自由基和生物大分子的结合，导致DNA主链断裂或碱基破坏，通过氧化性降解使得多糖链断裂，形成脱氢自由基，破坏细胞膜上的多糖结构[7]。现代研究表明，大多数抗辐射天然产物具有清除多种自由基作用，能降低氧化酶活性，抑制细胞过氧化物的产生。2.3 保护免疫系统
辐射主要损伤骨髓、胸腺和脾脏等免疫器官以及淋巴细胞等。崔玉芳等[8]发现辐射对免疫系统的损伤主要表现为两个特点——早期损伤严重和后期恢复缓慢。在辐射早期脾脏T、B淋巴细胞数量迅速减少，丝裂原反应明显降低，而在受照射1年后，小鼠的免疫组织和外周血淋巴细胞凋亡率与正常水平相比仍较高，小鼠T淋巴细胞免疫功能仍未恢复。促进淋巴细胞增殖，抑制胸腺和脾脏细胞凋亡等是抗辐射损伤的有效途径。
2.4 保护造血系统
造血组织是辐射的敏感组织，机体受到辐射后，造血细胞会出现功能低下甚至死亡现象，其中，造血干细胞、粒系祖细胞、红系祖细胞是辐射攻击的主要靶细胞，外周血细胞的数量随着照射剂量的增加而减少，其形态和功能也会随之发生改变[1]。因此，改善造血微环境，促进白细胞增殖，修复骨髓造血功能等有助于保护造血系统，修复辐射损伤。
3. 抗辐射天然产物
3.1 多糖类化合物
天然多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。它们是一类具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗炎、抗疲劳、抗衰老作用的生物大分子[9]。关于多糖的抗辐射作用的机制尚不清楚，一般认为与多糖的抗氧化，对造血系统的保护，引起免疫系统的效应增强以及诱导产生某些细胞因子等作用有关。
3.1.1 植物多糖
研究表明，大多数植物多糖有较为显著的抗辐射作用，能提高辐射诱导损伤的防护能力，改善辐射诱导的氧化损伤。其辅助保护辐射损伤的作用机制复杂，一般推测与其修复DNA损伤、消除自由基、增强免疫功能等有关[10]。张乃珣等[11]研究发现，酸性黑木耳多糖(AAP)和红松球果多酚的联合使用可以有效地清除体内自由基，降低自由基对体内DNA造成的损伤，显著提高对60Co γ射线诱导氧化损伤的防护能力。此外，白海娜等[12]发现原花青素与黑木耳多糖（AAP-4）同样有协同防护辐射诱导氧化损伤的作用。徐俊杰等[13]研究山药多糖对低强度连续微波辐射致小鼠免疫系统功能损伤的保护作用，发现正常动物组与辐射损伤组相比，不同剂量(200、400、800 mg/kg)的山药多糖可提高巨噬细胞的吞噬指数、T淋巴细胞的增殖刺激指数和血清IgG水平，并降低血清IL-4水平。表明山药多糖能明显改善低强度连续微波辐射对小鼠免疫系统的损害。胡淼等[14]报道，预先给药黑大蒜多糖（150~600 mg/kg）可减轻X射线辐射对小鼠免疫器官和全血白细胞、血小板的影响，提高脾脏的代偿性造血增殖能力，提高抗氧化酶水平，具有较好的辐射防护作用。Zhang等[15]发现大黄多糖(RTP)通过调控Nrf2及其下游蛋白HO-1，显著降低细胞凋亡和炎症因子，从而显著改善辐射诱导的肠道损伤。
3.1.2 动物多糖
国内外学者从动物体内提取出不同种类的多糖，尤其是海洋动物，如虾蟹动物的甲壳质、河蚌多糖、鲍鱼多糖等，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等生物活性[16]。
3.1.3 微生物多糖
研究发现微生物中，尤其生活在高压、高辐射环境中的藻类，其多糖有着较为特殊的结构与生理特性，大多有较好的抗辐射效果。Kim等[17]在探讨低分子量岩藻多糖（LMF）对中波紫外线诱导的光老化的保护作用时发现，持续15周的中高剂量（2.0、1.0 mg/cm2）LMF治疗可对受到中波紫外线照射的小鼠光老化起到明显的保护作用，可抑制皱纹形成，皮肤水肿以及中性粒细胞在光老化病灶上的聚集。杨凯业等[18]报道称铁皮石斛多糖、褐藻多糖、灵芝多糖、竹荪多糖在50 mg/L的质量浓度下的复合作用可抑制紫外线辐射诱导的皮肤细胞光老化作用。
3.2 多酚类化合物
植物多酚是广泛存在于植物体内的一类次生代谢产物，包括黄酮类、花色苷类和酚酸类。研究表明，多酚类化合物含有多个酚羟基，具有显著的清除自由基能力，能减轻自由基对机体的伤害，从而起到辐射防护作用[19]。
Lekmine[20]等评价用阿尔及利亚南部特有植物Astragalus gombiformis Pomel地上部分制备的丁醇提取物的药理活性，采用防晒系数(SPF)等评价Astragalus gombiformis Pomel的光保护作用和抗氧化能力，结果表明提取物（SPF=37.78±0.85，SPF值>30的皮肤保护产品被认为是有效的紫外线辐射过滤器）具有良好的紫外线吸收能力，推测主要与其中的黄酮类和酚酸类化合物（主要为水飞蓟素、迷迭香酸、槲皮苷和山柰酚）的紫外吸收能力和抗氧化防御能力有关，具有潜在的辐射防护能力。
3.2.1 黄酮类化合物
黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮。黄酮类化合物是一类从中草药中提取的天然产物，被认为是一种有效的抗氧化剂，可以调控炎症介质的调节酶或转录因子，通过与DNA的相互作用影响氧化应激，增强基因组稳定，具有神经保护和辐射保护作用[21]。
金银花素(5,7-二羟基黄酮)是从蜂胶、蜂蜜和几种植物中提取的一种黄酮类化合物。Mansour等[22]发现给药金银花素(50 mg/kg）可提高受5 Gy红外线照射雄性Wister大鼠大脑中丙二醛(MDA)水平和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性，这提示金银花素具有辐射致脑损伤的神经保护作用。Kale等[23]通过组织病理评估，显示槲皮素可显著减少辐射诱导的神经元变性和炎症浸润，揭示了槲皮素对辐射致脑损伤的神经保护作用。
Li等[24]证实芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）能够一定程度上修复UVB诱导的人表皮角质形成细胞(HEKs)的毛细血管扩张性共济失调的异常突变，从而抑制HEKs细胞凋亡和坏死，表明芹菜素对中波紫外线损伤的HEKs具有新型的保护作用。Prasad等[25]报道水飞蓟宾（silibinin）可以防止中波紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体的形成，通过增加抑癌基因p53水平进而促进DNA修复和（或）启动受损细胞的凋亡。
曲克芦丁（TRX）是一种黄酮类化合物，广泛存在于茶叶、咖啡、谷类食品、各种水果和蔬菜中，具有抗辐射作用，Panat[26]对其清除自由基的能力和抗细胞凋亡活性进行了系统的研究。TRX能清除超氧物、NO和其他模型稳定的自由基，从而保护受辐照的细胞。
有些英国科学家研究发现，每天喝两杯绿茶、吃一个橘子，就可以帮助“电脑族”们抵御计算机辐射[27]。而儿茶素类化合物作为茶叶中的主要功能成分，具有显著的抗辐射作用。茶树中儿茶素类化合物主要包括，儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯及表没食子儿茶素没食子酸酯8种单体。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯生理活性较为突出，具有抗氧化性和抗细胞凋亡活性，可预防不同刺激对组织的损伤。Korystova等[28]研究发现在对辐射诱导的大鼠主动脉损伤的预防作用中，发现红茶比绿茶更加有效，即使浓度低于1 g/100 ml的红茶也能够有效预防红外线对主动脉造成的损伤。红茶中的儿茶素含量明显低于绿茶，但两种茶中的黄酮醇含量几乎相等。儿茶素、表没食子儿茶素和表没食子儿茶素没食子酸酯可增加大鼠主动脉的氧化应激，而黄酮醇可降低辐射诱导的氧化应激。因此，红茶药效的提高是由于儿茶素含量的降低使黄酮醇的正向调节作用更大程度地得到发挥所致。
3.2.2 酚酸类化合物
酚酸类化合物系指具有多羟基的芳香羧酸类化合物，主要以糖、酯以及有机酸的形式存在于植物中，现代研究表明酚酸类化合物能够清除体内多种自由基，具有良好的抗氧化活性和潜在的辐射防护作用。
Milton等[29]报道，鱼腥草细胞培养物的甲醇提取物因细胞产生酚类次生代谢物而具有潜在的光保护作用，结果显示鱼腥草细胞的甲醇提取物(310～2500 g/ml)能够显著提高受紫外线照射的3T3-Swiss白化成纤维细胞活力。提取物的LC-MS化学分析表明，其总酚和总酚酸含量（主要为没食子酸和毛蕊花苷）较高，具有特征的紫外吸收峰(第一和第二波段的峰值分别为294和330 nm)，能够抵消紫外线对皮肤的有害影响。
Abozaid等[30]报道肉桂酸纳米颗粒可作为一种辐射诱导胰腺炎的氧化还原信号通路的调节剂，首先用I-精氨酸和γ射线诱导大鼠患急性胰腺炎，口服肉桂酸纳米颗粒(CA-NPs)后，急性胰腺炎的严重程度及血清淀粉酶和脂肪酶水平均降低。同时，胰腺组织的MDA水平显著降低，谷胱甘肽的消耗显著恢复，caspase-3水平降低，可明显改善胰腺组织损伤或凋亡。因此，肉桂酸纳米颗粒对辐射诱导的急性胰腺炎具有较好的治疗潜力。Liu等[31]研究发现姜黄素（Cur）对长波紫外线辐射诱导的人皮肤成纤维细胞（HDFs）光老化具有一定的保护作用。Zhang等[32]发现白藜芦醇通过激活Sirtuin1 (Sirt1，组蛋白去乙酰化酶家族成员之一，可减轻炎症损伤)减轻辐射诱导的小鼠肠道损伤。周瑞芳等[33]研究表明，丹酚酸B可减轻γ射线辐射诱导的造血系统损伤和骨髓细胞的DNA及蛋白质的减少，恢复小鼠免疫系统的辐射损伤，具有显著的抗γ射线辐射作用。
3.2.3 花色苷
花色苷是花青素和糖以糖苷键结合而成的一种化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，起到保护植物抗氧化的作用。其抗氧化和消除自由基能力可防护不同射线辐射，能够发挥独特的生理效应。
Fernandes等[34]发现花色苷家族成员（矢车菊色苷、锦葵色苷及其衍生色素）具有促进皮肤维持健康的活性，研究表明大部分化合物能够抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌菌株的生长繁殖，减少HEKs和HDF活性氧的产生，抑制皮肤降解酶的活性且无细胞毒性作用，具有一定的紫外线过滤作用。
Targhi等[35]研究黑桑花色苷对大鼠肝组织和骨髓细胞的辐射防护作用，以 60Co γ射线远距放射（3 Gy和6 Gy）建立大鼠辐射损伤模型，随后腹腔注射200 mg/kg的黑桑花色苷，结果显示黑桑花色苷可降低大鼠肝脏MDA和SOD的水平，降低γ射线照射对大鼠骨髓细胞和肝脏的遗传毒性和细胞毒性，有潜在的辐射保护作用。
3.3 皂苷类化合物
皂苷（saponin）类化合物是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，存在于人参、桔梗、刺五加等许多中草药中，在增强免疫、抗肿瘤、抗炎等方面具有显著的生物活性。研究表明人参皂苷的抗辐射机制与清除自由基、抗氧化活性，与其对心血管系统、免疫系统的保护作用以及对细胞凋亡的抑制作用有关[36]。
Wen[37]等研究黄芪甲苷对中波紫外线诱导的大鼠真皮成纤维细胞早衰的抗光老化作用，结果显示黄芪甲苷不仅能通过激活细胞外调解蛋白激酶ERK和丝裂原活化蛋白激酶p38信号抑制中波紫外线诱导的胶原-I的降解，还通过激活细胞自噬增加胶原-I的积累，从而保护中波紫外线诱导的光老化细胞，表明黄芪甲苷在抗光老化治疗中的潜在优势。
Wang等[38]分析柴胡皂苷-d (SSd)对肝癌细胞自噬活性和放射敏感性的影响，SSd通过抑制mTOR磷酸化促进肝癌细胞自噬，增加辐射诱导的肝癌细胞凋亡并且抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的放射增敏治疗提供了一种可能的途径。
Kim等[39]研究知母皂苷A-III（TA-III）对中波紫外线诱导的HEKs和HDF侵袭效应的保护作用时发现，TA-III在非细胞毒性剂量下（50 nmol/L）以剂量依赖的方式抑制中波紫外线诱导的环氧合酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）转录和蛋白表达水平，降低中波紫外线诱导的原代皮肤细胞的侵袭，组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和COX-2在HEKs中的过度表达，表明其具有光保护剂的开发潜力。
3.4 其他
除了上述多糖类、多酚类以及皂苷类化合物，天然产物中的许多其他化合物同样具有良好的辐射防护作用，包括维生素类、蛋白类、无机成分、稀有元素等。
Rostami等[40]研究发现预先摄入硒和维生素E能够对X射线辐射引起的遗传损害起到一定的防护作用。段一凡等[41]报道茶叶籽不饱和脂肪酸对中波紫外线诱导的HEKs损伤具有保护作用。Jaisin等[42]研究发现胡椒碱（10～40 µmol/L）预处理可抑制中波紫外线诱导的炎症信号通路，减弱HEKs的细胞毒性并且抑制其凋亡。这提示胡椒碱的抗炎作用能保护HEKs免受中波紫外线辐射的损伤，可作为一种紫外线辐射诱导皮肤炎症的有效治疗手段。
4. 结语
近年来，国内外越来越重视辐射损伤的防护，抗辐射药物的寻找也变得十分紧迫。而与传统的化学合成药物相比，天然来源的药物具有活性高、选择性强、毒副作用小等优点，作为抗辐射药物有着广阔的开发前景。但是抗辐射天然产物的筛选方法耗时耗力，因此建立高通量、高专属性的抗辐射天然产物筛选方法意义重大。此外，对已有的天然产物进行结构改造，以期获得抗辐射活性更高或毒副作用更小的衍生物以及提高抗辐射天然产物的提取纯化效率等皆是未来抗辐射天然产物研究的重点和难点。
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表 1 阳性对照品的名称及剂量
菌株 无代谢活化系统（−S9） 有代谢活化系统（+S9） 阳性对照品名称 加入量
(μl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)阳性对照品名称 加入量
(µl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)TA97 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA98 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA100 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA102 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 1,8-二羟基蒽醌 100 500.0 50.0 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 100 5.0 0.5 环磷酰胺 100 500.0 50.0 
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表 2 益母草碱对胎鼠生长发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 184 174 160 168 性别比例（雄:雌） 93∶91 81∶93 80∶80 88∶80 活胎体重( $ \bar x \pm {\rm{s}}$ , g)3.28±0.40 3.25±0.40 3.30±0.40 3.31±0.46 胎盘重( $ \bar x \pm {\rm{s}}$ , g)0.56±0.08 0.55±0.09 0.56±0.08 0.55±0.09 活胎身长( $ \bar x \pm {\rm{s}}$ , cm)3.60±0.18 3.57±0.20 3.57±0.21 3.61±0.22
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表 3 益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 颈椎数 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 胸椎数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 腰椎数 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 尾椎 2.3±0.6 2.3±0.7 2.4±0.6 2.4±0.6 骶椎数 5.5±0.6 5.5±0.6 5.6±0.6 5.5±0.5 肋骨数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 掌骨数 7.3±1.0 7.3±1.0 7.5±0.9 7.0±1.0 近端指骨数 0.1±0.4 0.3±1.1 0.2±0.9 0.3±1.0 远端指骨数 9.9±0.4 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.2 跖骨数 8.0±0.2 8.0±0.2 7.9±0.4 8.0±0.0 近端跖骨数 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 远端跖骨数 10.0±0.3 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.0
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表 4 益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响
枕骨分级 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 Ⅰ级枕骨数[n (%)] 27（30.7） 25（29.4） 31（40.3） 29（37.2） Ⅱ级枕骨数[n (%)] 60（68.2） 59（69.4） 45（58.4） 49（62.8） Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1（1.1） 1（1.2） 1（1.3） 0（0） Ⅳ级枕骨数[n (%)] 0（0） 0（0） 0（0） 0（0）
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表 5 益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响
观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 骨化不全数 0.7±0.8 0.5±0.6 0.7±0.7 0.8±0.7 未骨化数 1.4±1.1 1.4±1.1 1.0±1.2 1.3±1.0
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表 6 益母草碱对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿,
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2 空白对照组 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3 溶媒对照组 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1 阳性对照组 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15
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表 7 益母草碱对5支菌株的回变菌落数(个/皿，
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5 空白对照组 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1 溶媒对照组 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2 阳性对照组 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53
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表 8 益母草碱对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果（加或不加S9系统）
组别（μg/ml） 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着
丝粒三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 250 +S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 500 +S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 −S9 200 8 0 0 0 0 0 0 0 3 1.5 1 000 +S9 200 5 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 −S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶媒对照组 +S9 200 2 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 溶媒对照组 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 +S9 100 20 0 0 2 0 0 0 0 17 17* 阳性对照组 −S9 100 18 3 0 0 1 0 0 0 18 18* *P<0.05，与溶媒对照组比较。
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表 9 益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果
组别（mg/kg体重） 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（ $\bar x $ ±s）微核率（ $\bar x $ ±s,‰）500 雌 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48 雄 5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81* 1 000 雌 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28 雄 5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30* 2 000 雌 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47 雄 5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43 溶媒对照组 雌 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88 雄 5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98 阳性对照组 雌 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50* 雄 5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80* *P<0.05，与溶媒对照组比较。
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