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光热疗法（photothermal therapy，PTT）是近年来新兴的肿瘤治疗技术，相比传统的手术治疗、化疗和放疗，具有更小的副作用[1-4]。PTT包含2个要素，即近红外光和光敏剂。近红外光具有较强的组织穿透能力[5-6]，照射后肿瘤组织中的光敏剂可将光能转换为热能，当温度达到42 ℃以上时，可导致肿瘤细胞的凋亡或坏死[7]。
硫化铜（CuS）纳米粒是一种优良的光敏剂。相比广泛研究的金纳米粒，CuS纳米粒具有制备成本低的优点，特别是其具有稳定的光热效应。CuS纳米粒的近红外吸收主要源于Cu2+的d-d能级跃迁，因而其光热效应不受粒径、形状和生理环境的影响，可在肿瘤组织中维持稳定的光热效应[8]。CuS纳米粒具有良好的生物相容性，细胞毒性较低，但与其他多数无机或金属纳米粒同样存在体内发生蓄积的风险，长期使用的安全性未知。肾脏是处理纳米粒的主要器官之一，报道显示，直径小于6 nm的纳米粒可被肾脏滤过，从而使大部分纳米粒经尿液排出体外[9-10]。
因此，本文拟制备粒径小于6 nm的CuS纳米粒，通过深入分析各因素，获得最优的处方工艺，进一步通过光热曲线和细胞实验进行体外评价。
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Litesizer500纳米粒度及Zeta电位分析仪（奥地利Anton Paar公司）；JEOL 2010透射电子显微镜（日本电子株式会社）；MDL-H-980-5W上转换发光用激光器（长春新产业光电技术有限公司）；RX-300红外热成像仪（广东省东莞市不凡电子有限公司）；NVMT SPARTAN夜视仪（梅越电子商务有限公司）；DV215CD精密分析天平（美国Ohaus Discovery公司）；HWS 26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；明澈-D24UV纯水/超纯水一体化系统（德国Merck Millipore公司）
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二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）、九水合硫化钠（Na2S·9H2O）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚维酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，MW=10 000，默克生命科学有限公司）；细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8，北京索莱宝生物技术有限公司）；RPMI1640培养液，DMEM不完全高糖培养液，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（江苏凯基生物技术有限公司）；透析袋（MWCO 14000，美国Viskase公司）；去离子水（实验室自制）。
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参考文献确定CuS纳米粒基本处方[11]：取100 μl CuCl2溶液（300 mmol/L）加入10 ml PVP溶液（100 mg/ml）中，再加入30 μl Na2S溶液（1 mol/L），室温磁力搅拌5 min后，转入90 ℃水浴继续磁力搅拌15 min，测定其粒径和多分散指数（polydispersity index，PDI）。
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考察搅拌时间、水浴温度、水浴时间、PVP浓度、CuCl2与Na2S摩尔比（Cu:S）对CuS纳米粒粒径和PDI的影响。
表1结果显示，搅拌时间越长，水浴温度越低，Cu:S越小，则CuS纳米粒粒径呈减小趋势。水浴时间越长，PVP浓度越大，粒径显示了先增大后减小的趋势。综合各因素不同水平对应的纳米粒粒径，发现水浴温度、PVP浓度和Cu:S易产生较大的粒径波动，表明其可能是影响CuS纳米粒粒径的主要因素。另外，各因素不同水平对PDI的影响均不显著。因此，根据单因素考察结果，确定搅拌时间为5 min，水浴时间为15 min，以粒径为评价指标，采用星点设计-响应面法进一步优化水浴温度、PVP浓度、Cu:S三个因素。
表 1 CuS纳米粒单因素考察结果（n=3）
因子 水平 粒子大小 (nm) 多分散指数 搅拌时间 (min) 3 18.13±5.42 0.27±0.01 5 16.12±1.29 0.27±0.01 7 15.40±1.86 0.26±0.01 水浴温度 (℃) 80 14.61±4.35 0.27±0.01 90 16.12±1.29 0.27±0.01 100 22.85±1.71 0.26±0.01 水浴时间 (min) 10 18.12±6.31 0.25±0.02 15 16.12±1.29 0.27±0.01 20 21.30±5.71 0.24±0.01 PVP浓度 (mg/ml) 80 25.56±4.40 0.27±0.01 100 16.12±1.29 0.27±0.01 120 20.72±3.38 0.25±0.02 Cu:S 3:1 15.08±2.92 0.26±0.01 2:1 20.25±1.16 0.27±0.01 1:1 16.12±1.29 0.27±0.01 1:2 11.34±3.08 0.25±0.02 1:3 11.27±2.88 0.25±0.02 -
在单因素考察的基础上，采用中心复合响应面设计（central composite design, CCD），选择上述筛选出的三个因素：水浴温度（X1）、PVP浓度（X2）、Cu:S（X3）为考察因素，粒径（Y1）为评价指标，进行三因素五水平的星点设计。
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星点实验设计的因素、水平及代码值如表2所示，实验设计与结果如表3所示。
表 2 星点设计因素和水平
因子 水平 −1.682 −1 0 +1 +1.682 X1 (℃) 60.00 70 85 100 110.20 X2 (mg/ml) 66.36 80 100 120 133.64 X3 0.25 0.33 1.67 3 4 表 3 星点设计实验安排表和结果(n=3)
序号 X1 (℃) X2 (mg/ml) X3 Y1 (nm) 1 −1 −1 −1 13.04 2 +1 −1 −1 14.23 3 −1 +1 −1 14.48 4 +1 +1 −1 13.39 5 −1 −1 +1 24.37 6 +1 −1 +1 27.30 7 −1 +1 +1 18.62 8 +1 +1 +1 20.73 9 −1.682 0 0 18.87 10 +1.682 0 0 15.62 11 0 −1.682 0 24.01 12 0 +1.682 0 17.06 13 0 0 −1.682 13.92 14 0 0 +1.682 15.11 15 0 0 0 18.81 16 0 0 0 16.84 17 0 0 0 16.14 18 0 0 0 17.89 19 0 0 0 16.20 20 0 0 0 16.30 -
采用Design expert 8.0.6，将各影响因素（X1、X2、X3）和评价指标（Y1）进行二次多项式模型拟合，方程如下：
Y1=4.15−0.0086X1−0.18X2+0.42X3−0.045X1X2+0.064X1X3−0.17X2X3+0.043X12+0.17X22−0.22X32
此时二项式模型达显著水平（P=0.006 5），r=0.9129，说明该方程与实际情况拟合度良好。
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根据表3结果，绘制水浴温度（X1）、PVP浓度（X2）及Cu:S（X3）对粒径（Y1）的响应面。
根据图1的数据进行分析，确定最优参数为：水浴温度100 ℃，PVP浓度为100 mg/ml，Cu∶S为1∶3。按照最优处方工艺平行制备3份样品，粒径分别为9.37、12.39、9.84 nm，平均值为（10.53±1.63）nm，预测值为10.86 nm，根据公式：偏差=（预测值−实际值）/预测值×100%，得出实际值与预测值的偏差为3.04%，说明建立的数学模型较为可靠，预测性良好。
图 1 温度（X1）、PVP浓度（X2）、Cu:S（X3）对粒径值（Y1）的三维响应面图
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取CuS纳米粒适量，加去离子水稀释10倍，取5 μl稀释后的CuS纳米粒，滴于缚有碳支持膜的铜网上，铜网下铺滤纸，用于吸去多余的液体。自然晾干后，用透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察纳米粒形态。图2结果显示，CuS纳米粒形态圆整，分散性良好，经Image J软件测量，平均粒径为（3.10±0.81）nm。
图 2 CuS纳米粒TEM图
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将CuS纳米粒分别放置在4 ℃与25 ℃条件下，定时测定粒径。经统计发现，20 d内CuS纳米粒的粒径变化没有明显差异，说明所制的CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性（图3）。
图 3 CuS纳米粒分别在4 ℃与25 ℃下的粒径变化曲线（n=3）
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⑴近红外光功率密度：考察CuS纳米粒浓度为50 μg /ml条件下，不同近红外光功率密度（0.5 、1、1.5、2 W/cm2）对CuS纳米粒光热效应的影响。采用980 nm的近红外激光器，红外热成像仪每隔30 s记录温度，记录10 min，平行测量3组，绘制升温曲线，同时，以水在相同条件下做对照。随着功率密度增大，CuS纳米粒升温加快（图4），而在相同条件下，去离子水的升温速率显著低于CuS纳米粒（图5）。
图 4 CuS纳米粒在不同功率密度下的升温曲线（n=3）
图 5 水在不同功率密度下的升温曲线（n=3）
⑵CuS纳米粒浓度：考察在1 W/cm2功率密度下，CuS纳米粒不同浓度（25 、50 、150 、200 μg/ml）对其光热效应的影响，并以去离子水为空白对照。采用980 nm的近红外激光器，红外热成像仪每隔30 s记录温度，记录10 min，平行3组，绘制升温曲线。结果显示，在相同功率密度条件下，CuS纳米粒浓度越大，升温速率越大（图6）。
图 6 CuS纳米粒在不同浓度下的升温曲线（n=3）
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采用980 nm近红外激光器，选取CuS浓度为50 μg /ml，激光功率密度为1 W/cm2，将激光器“开启-关闭”4个循环，即照射10 min后停止，温度恢复至室温后再次开启照射。如图7所示，CuS纳米粒经近红外光照射4个循环的温度变化曲线基本一致，即反复照射不影响CuS纳米粒的光热效应，表明其具有良好的光热稳定性。
图 7 CuS纳米粒经近红外光照射4个周期的温度曲线
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考察CuS纳米粒对正常人肾小管上皮细胞（HK2）以及乳腺癌细胞（4T1）的毒性。实验前，取适量CuS纳米粒放入透析袋（MWCO=14000）中，透析24 h以除去杂质。取对数生长期细胞，调整HK2细胞浓度为1×105 cells/ml，4T1细胞浓度为5×104 cells/ml，将100 μl/孔的细胞悬液接种于96孔细胞培养板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中。孵育24 h后，每孔加入10 μl不同浓度的CuS纳米粒，使终浓度分别为3.1、6.3、12.5、25、50、100、150及200 μg/ml，继续培养24 h后，去除96孔板中培养基，加PBS洗涤2次（以排除Cu2+对CCK-8试剂的影响），每孔加入100 μl培养基及10 μl CCK-8试剂，于培养箱中孵育4 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（A）。参照公式：
细胞活力（%）=(A加药−A空白)/(A0加药−A空白)×100%，
计算细胞活力百分率，其中A加药指具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度，A空白指具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A0加药指具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果显示（图8），CuS纳米粒分别在100 μg/ml及150 μg/ml浓度范围内，对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞均无显著的细胞毒性（细胞活力大于80%），表明CuS纳米粒具备良好的生物相容性。
图 8 CuS纳米粒浓度对细胞活力影响
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考察CuS纳米粒的光热效应对4T1细胞的杀伤作用。取对数生长期细胞，调整4T1细胞浓度为5×104 cells/ml，将200 μl/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，去除全部培养基，加入200 μl含CuS纳米粒的培养基（CuS纳米粒的浓度为50 μg /ml）。采用1 W/cm2的近红外光，照射不同时间（0、1、3、5、7、10 min），随后采用CCK-8试剂测定细胞活力百分率，参照“2.5.1”项下公式计算。结果显示（图9），近红外光照射1 min对4T1细胞的活力无明显影响，继续延长照射时间，细胞活力呈显著的降低趋势，照射10 min后的细胞活力仅为28.76 %。
图 9 CuS纳米粒光热效应作用下的4T1乳腺癌细胞的存活率（n=5）
采用与上述相同的方法，改为6孔板，经980 nm近红外光（1 W/cm2）照射10 min后，加入0.2 %台盼蓝对死细胞进行染色（2 min）。去除染液并用PBS清洗2遍后，在倒置相差显微镜下进行观察。如图10所示，激光照射区域，细胞被染为蓝绿色，且显示了明显的边界，而对照组不加CuS纳米粒，仅给予近红外光照射，只有个别零散的细胞着色。图9与图10结果均表明CuS纳米粒对肿瘤细胞具有显著的光热杀伤效果。
图 10 4T1乳腺癌细胞光热杀伤台盼蓝染色图片
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目前光热治疗作为新型的肿瘤治疗技术，寻找合适的光敏剂是亟待解决的重要问题。光热稳定、价格低廉等是CuS纳米粒的主要优点，但目前文献所报道的CuS纳米粒粒径多在10 nm以上[12-13]，可能引起CuS纳米粒在体内的蓄积，将限制其在临床上的使用，而减小粒径可以有效解决这个问题。本研究经单因素考察和星点设计-响应面优化法，得到CuS纳米粒的最优处方工艺，成功制备实际粒径为（3.10±0.81）nm的CuS纳米粒，且制备方法简单，易于工业化生产。该处方中以PVP作为保护剂，使CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性，分散度高，不易发生聚集沉淀，单因素考察分析也可发现PVP浓度对CuS纳米粒粒径具有较大影响，PVP浓度低，CuS纳米粒容易发生聚集，粒径增大；浓度太高，保护层过厚，也会引起CuS纳米粒粒径增大，因此选择合适的PVP浓度，是控制CuS纳米粒粒径关键因素之一。
由于CuS纳米粒在近红外区域（700~1 400）nm具有强吸收，使其在近红外光照射下，具有较强的光热效应，所优选的CuS纳米粒在1 W/cm2的激光功率密度下，照射4 min，温度即可达到42 ℃以上，可引起肿瘤细胞的凋亡或坏死[14]。因CuS纳米粒的光热转换性能来源于Cu2+的d-d能级跃迁，不易受外界环境的影响，所优选的CuS纳米粒具有良好的光热稳定性。本实验所优选的CuS纳米粒生物相容性好，且对肿瘤细胞具有显著的光热杀伤作用，这与多数文献报道相一致[15-16]。
综上，本研究所制备的CuS纳米粒粒径有望解决CuS纳米粒体内蓄积的问题，使其更好地应用于肿瘤光热治疗。本课题将进一步研究所制硫化铜纳米粒在体内的代谢情况以及对肿瘤组织的光热杀伤效果。
Optimization of formulation process and in vitro evaluation of copper sulfide nanoparticles
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摘要:
目的 为避免硫化铜（CuS）纳米粒体内蓄积，制备并优化CuS纳米粒，分析粒径影响因素并评价其光热性能。 方法 在单因素考察基础上，采用星点设计-响应面法进一步分析各因素对CuS纳米粒粒径的影响，获得最佳处方工艺。考察优选的纳米粒的理化性质，包括形态、粒径稳定性、光热转换性能及光热稳定性。采用CCK-8法评价CuS纳米粒对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞的毒性，并考察其光热效应对4T1乳腺癌细胞的杀伤效果。 结果 CuS纳米粒优选处方工艺的水合粒径为（10.53±1.63）nm；透射电镜下显示其粒径为（3.10±0.81）nm；所优选的CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性，良好的光热转换性能与光热稳定性。细胞毒研究显示，所优选的CuS纳米粒分别在100 μg/ml及150 μg/ml浓度范围内，对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞均无显著的细胞毒性，且其对4T1乳腺癌细胞具有显著的光热杀伤效果。 结论 所制备的CuS纳米粒实际粒径小于6 nm且具有良好的光热效应，有望解决CuS纳米粒体内蓄积的问题，使其更好地应用于抗肿瘤治疗。 Abstract:Objective To avoid the accumulation of copper sulfide (CuS) nanoparticles, prepare and optimize CuS nanoparticles, analyze the factors affecting the particle size and evaluate their photothermal properties. Methods Based on the single factor study, central composite design-response surface methodology was used to optimize the CuS nanoparticle formulation process. The morphology, particle size stability, photothermal conversion efficiency, photothermal stability of optimized CuS nanoparticles were characterized. The toxicity of CuS nanoparticles on 4T1 breast cancer cells and HK2 kidney cells was evaluated by CCK-8 method. In vitro photothermal experiment was used to investigate the ability of CuS nanoparticles on killing 4T1 breast cancer cells. Results The average hydration dynamic diameter of optimized CuS nanoparticles was (10.53±1.63)nm, the actual particle size of CuS nanoparticles showed by TEM image was (3.10±0.81)nm. It had good particle size stability, good photothermal conversion efficiency and photothermal stability. Within the concentration range of 100 μg/ml and 150 μg/ml, it showed no significant toxicity on 4T1 breast cancer cells and HK2 kidney cells, indicating the good stability of CuS nanoparticles. In vitro photothermal therapy showed that CuS nanoparticles had good ability to kill 4T1 breast cancer cells by photothermal. Conclusion The prepared CuS nanoparticles have a small particle size (less than 6nm) and a good photothermal effect, which is expected to solve the problem of CuS nanoparticles accumulation in vivo and make it better for tumor treatment. -
皮肤是人体最大的器官，日常生活中难免受到损伤形成伤口，如轻微的皮肤擦伤、割伤和烧伤等。对于日常的小伤口，一般可以任其自愈，但若稍不注意沾水或接触外界细菌，则容易造成感染，影响伤口愈合，甚至造成溃烂。我们常用的创面处理方法有：使用创可贴覆盖；双氧水或碘伏消毒处理；纱布包扎等。这些处理方法存在着防水透气性差、撕除时疼痛和使用不便等问题。20世纪60年代，Winter博士的研究证实了湿润的伤口环境有助于上皮组织更快的形成，并以此为依据提出了“湿性愈合”的概念[1]。这一研究提高了人们对伤口护理的认识，也为研发封闭敷料奠定了基础。由于传统的敷料不能在伤口处使用较长时间，也不能为伤口愈合提供一个湿润的环境，因此，各种高科技的湿性疗法的伤口护理产品层出不穷。在日本及美国等发达国家，出现以硝化纤维为主要材料的新型创伤敷料[2-4]，可用于密封小型伤口甚至保护烧伤创面。此类创伤敷料在使用前为液体形态，涂抹在伤口后有机溶剂迅速挥发，短时间覆盖伤口形成保护膜，具有防水、杀菌、预防伤口感染等优点[5-7]。本研究拟以市售小林液体创可贴为基础，以硝化纤维为膜材，优化处方，制备一种性能更为优良的液体创伤敷料。
1. 材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Shimadzu HS-20气相色谱仪（日本Shimadzu公司）；拉力试验机（上海和晟仪器有限公司）；AL204型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；D2400型纯水/超纯水一体机（美国明澈公司）；25型无极调速电动搅拌机（江苏江阴科技器械厂）。
1.2 试药
小林液体创可贴（日本小林制药株式会社）；硝化纤维（衡水东方化工有限公司）；蓖麻油、樟脑、苯甲醇、乙酸丁酯、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（均为国药集团化学试剂有限公司）；棕榈酸异丙酯（IPP，青岛优索化学科技有限公司）；乙酸乙酯（上海联试试剂有限公司）。
2. 方法与结果
2.1 市售产品小林液体创可贴中苯甲醇含量及溶剂组成的测定
2.1.1 苯甲醇的含量测定
采用高效液相色谱法测定，色谱条件：采用Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱：ODS-C18色谱柱；流动相：甲醇-水（50∶50 V/V）；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：40 ℃；检测波长：257 nm。
标准曲线的绘制：精密称定苯甲醇对照品151.3 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度；精密量取上述溶液1、2、2.5、3、4 ml于25 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定244.3 mg市售产品于50 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，苯甲醇对照品及市售产品均在5.87 min附近有峰且峰型良好。标准曲线回归方程为：Y = 13040X + 212.7 (r=0.999)；经计算得市售产品苯甲醇的使用量为4.0%。
2.1.2 溶剂组成的测定
采用气相色谱法测定，色谱条件：采用 HS-20气相色谱仪；色谱柱：DB-624毛细管柱；载气：H2 50 ml/min；空气450 ml/min；进样量：1 μl；柱温：40 ℃/min持续3 min，10 ℃程序升温至200 ℃，持续1 min；检测器温度：250 ℃；气化室温度：220 ℃；FID检测器。
标准曲线的绘制：精密称定异丙醇1.0077 g，乙酸乙酯0.9933 g，乙酸丁酯1.0014 g于100 ml容量瓶中，加入适量N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合均匀，用DMF稀释至刻度。分别取上述溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 ml置于25 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
市售产品（供试品）溶液的配制：精密称定1.186 0 g市售产品于100 ml容量品中，加入适量的DMF超声溶解，用DMF稀释至刻度，精密量取1 ml上述液体于10 ml容量瓶中，用DMF稀释至刻度。
实验结果：色谱图良好，异丙醇对照品及市售产品均在6.84 min附近有峰且峰型良好，乙酸乙酯对照品及市售产品均在9.25 min附近有峰且峰型良好，乙酸丁酯对照品及市售产品均在14.07 min附近有峰且峰型良好；苯甲醇标准曲线、乙酸乙酯标准曲线和乙酸丁酯标准曲线的回归方程分别为：
Y = 20152X + 2.692， r=1.000
Y = 15311X + 33.45 ，r=0.999
Y = 24428X – 17.33， r=0.999
经计算得市售产品中异丙醇的使用量为35.1%，乙酸乙酯的使用量为21.4%，乙酸丁酯的使用量为5.3%。即三者使用比例为：6.6∶4∶1。
2.2 液体创伤敷料及敷料薄膜的制备
2.2.1 液体创伤敷料的制备方法
采用硝化纤维（4%~8%）作为成膜材料，蓖麻油（1%~9%）为增塑剂，苯甲醇（4%）为抑菌剂，棕榈酸异丙酯（IPP，2%）为皮肤柔润剂，樟脑（0.3%）为芳香剂，以异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯（三者比例为6.6∶4∶1）作为溶剂制备创伤敷料。制备方法如下：于50 ml烧杯中精密称定处方量蓖麻油、苯甲醇、IPP、樟脑，加入上述3种混合溶剂使混合均匀，加入处方量硝化纤维，密封静置过夜待硝化纤维充分溶解，过夜后搅拌使硝化纤维混合均匀，超声除气泡即得。
2.2.2 敷料薄膜的制备方法
精密称定2 g按“2.2.1”项制备的液体创伤敷料，加入20 ml乙酸乙酯稀释使之混合均匀、黏度下降并充分溶解。将此液体置于90 mm培养皿中待溶剂挥干后可见均一透明无色薄膜。所制薄膜外观如图1所示。
2.3 评价指标的确立
按照中华人民共和国医药行业标准YY/T 0471-2004对直接接触类创伤敷料，进行舒适性、防水性、透气性的考察。舒适性考察主要为考察敷料薄膜的抗张强度及断点伸长百分率[8-9]；防水性考察薄膜的防水能力；透气性考察薄膜的水蒸气透过率（MVTR）[10]。抗张强度及断点伸长百分率的考察运用拉伸试验机，并采用公式1、公式2进行计算；防水性的考察采用倒杯法，记录24 h后的重量差异，如图2所示，以公式3进行计算；MVTR的考察方法：在西林瓶中加入蒸馏水，用薄膜覆盖密封，使水液面距薄膜（5±1）mm，置干燥器中，记录24 h后的重量差异，以公式4进行计算。
$$ {\text{抗张强度}}= {\rm{F}}/{\rm{S}}\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\;\;\;\;\; $$ (1) $$ {\text{断点伸长百分率}} = {{\rm{L}}_{{\rm{max}}}}/{{\rm{L}}_{\rm{o}}} \times 100 {\text%} $$ (2) $$ {\text{水分损失率}}= \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/{{\rm{M}}_{\rm{W}}}\quad\;\;\; $$ (3) $$ {\text{水蒸气透过率}} = \left( {{{\rm{M}}_{\rm{0}}} - {{\rm{M}}_{24{\rm{h}}}}} \right)/\left( {{\rm{s}} \times t} \right) $$ (4) 式中，F为拉伸力；S为薄膜面积；Lmax为拉伸最大距离；L0为初始膜长；M0为初始西林瓶重量；M24h为24 h后西林瓶重量；MW为西林瓶内水重量；s为瓶口面积；t为时间24 h。
2.4 硝化纤维用量的考察
分别采用4%、6%、8%的硝化纤维制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，其断点伸长百分率、防水性能考察的水透过率及MVTR值随着硝化纤维用量的增加呈下降趋势，抗张强度随着硝化纤维用量的增加呈上升趋势。其考察结果如图3~图6所示：
由图3、图4可知，硝化纤维的用量为4%、6%时，断点伸长百分率在170%以上，可认为薄膜韧性较好，在伤口表面有较好的舒适性，而硝化纤维用量为8%时，其断点伸长百分率较低，不足150%；在硝化纤维用量为4%时，所制薄膜过薄，导致其抗张强度较差，不及2.0 MPa。从图5可知，MVTR值在0.3~0.6 mg/(cm2·h)之间，随硝化纤维用量增加而减小，但均具有一定的透气性；由图6可知，三个不同梯度的硝化纤维在24 h内其水损失率均在2.5%以下，可认为防水性良好。综上考察结果，本次采用的硝化纤维用量为6%。
2.5 蓖麻油用量的考察
确定硝化纤维使用量为6%后，分别采用1%、5%、9%用量的蓖麻油制备液体创伤敷料，对所制的薄膜进行评价，由图7、图8可知，其断点伸长百分率随蓖麻油用量增加呈上升趋势，在蓖麻油使用量为1%时断点伸长百分率较差，不及150%，在5%~9%上升趋势明显且在蓖麻油用量为9%时达到190%，断点伸长百分率值数据较为理想；抗张强度随蓖麻油用量未呈明显下降趋势，反而是在蓖麻油使用量为5%时具有最大的抗张强度，而伸长率较好的9%用量蓖麻油处方抗张强度明显较小，在2.5 MPa左右，故蓖麻油用量选用浓度为5%。
关于蓖麻油对防水性能和透气性能的影响如图9、图10所示，蓖麻油用量为1%时其MVTR值明显高于5%和9%时，且其水损失率也高于5%和9%时，由于5%与9%的防水性没有太大的差异。由此可以得出的结论是，随着蓖麻油的加入，创伤敷料的透气性变差，同时其防水性能却有所增强，1%用量蓖麻油透气性能极佳，但机械性能及防水性相对较差，又因其水损失率24 h也没有达到5%，也可以认为其防水性能良好。所以下一步的考察尽量满足透气性的需求。
综合断点伸长百分率、抗张强度、MVTR值、水损失率，在保证机械强度的同时尽量满足其透气性的要求。拟在1%~5%之间再另设梯度进行考察。拟定蓖麻油使用量为2%、3%、4%时对上述指标再行考察。
由图11、图12可知处方断点伸长百分率及抗张强度在1%~5%范围内随蓖麻油用量的增加总体上均有一定的上升趋势。断点伸长百分率在蓖麻油用量为1%、2%时相差不大，在2%~5%时有明显的上升趋势；抗张强度在蓖麻油用量1%、2%时和4%、5%时相差不大，在蓖麻油用量从2%~4%时有明显的上升趋势。
由图13、图14可知在蓖麻油用量为1%~5%范围内MVTR值及水损失率随处方中蓖麻油用量的增加而呈下降趋势。
综合以上几个因素对处方中的蓖麻油用量进行考察，从所制薄膜的机械性能来看，在蓖麻油用量为1%~3%时，断点伸长百分率不及160%，抗张强度较差，不及3.60 MPa，故此用量不予考虑，从所制薄膜的防水透气效果来看，4%、5%用量均有一定的透气效果，且防水性测试结果显示二者水损失率均不超过2.50%。综上考虑，确定蓖麻油的使用量为4%。
3. 讨论
本文对市售产品的抑菌剂含量及溶剂组成进行了分析，以此作为基础对自制的液体创伤敷料进行单因素考察，确定了硝化纤维的最终用量为6%，蓖麻油的使用量为4%，所成薄膜具有良好的机械性能，具有透气性的同时又有着良好的防水效果。硝化纤维为主要的成膜材料，其用量对几个评价指标均有影响，其主要原因是其使用量的不同可造成所成薄膜的厚度不同，即创伤敷料薄膜厚度与硝化纤维用量成正比，其膜的厚度必然影响各项指标性能。蓖麻油作为增塑剂，对处方的影响主要在于：蓖麻油的加入能改变硝化纤维聚合物链之间的结构，使链与链之间的作用力产生变化从而在一定程度上影响薄膜的塑性。其次，蓖麻油的加入，可能堵塞了硝化纤维薄膜的纳米孔道，故呈现出其用量增加透气性能下降的趋势。
皮肤创伤，在临床和日常生活中都较为常见，伤口愈合的速度一定程度上取决于创伤表面环境，创伤表面环境需保持一定的潮湿性，即湿润表面可以加速伤口愈合，因此良好的创伤敷料，应具有一定的透气性，对于日常伤口来说，由于伤口表面的复杂，使用在创伤表面的敷料也应具有一定的机械性能。本实验主要探讨了硝化纤维和蓖麻油的用量对创伤敷料性能的影响，为下一步制备性能更加优良的创伤敷料提供研究基础。
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表 1 CuS纳米粒单因素考察结果（n=3）
因子 水平 粒子大小 (nm) 多分散指数 搅拌时间 (min) 3 18.13±5.42 0.27±0.01 5 16.12±1.29 0.27±0.01 7 15.40±1.86 0.26±0.01 水浴温度 (℃) 80 14.61±4.35 0.27±0.01 90 16.12±1.29 0.27±0.01 100 22.85±1.71 0.26±0.01 水浴时间 (min) 10 18.12±6.31 0.25±0.02 15 16.12±1.29 0.27±0.01 20 21.30±5.71 0.24±0.01 PVP浓度 (mg/ml) 80 25.56±4.40 0.27±0.01 100 16.12±1.29 0.27±0.01 120 20.72±3.38 0.25±0.02 Cu:S 3:1 15.08±2.92 0.26±0.01 2:1 20.25±1.16 0.27±0.01 1:1 16.12±1.29 0.27±0.01 1:2 11.34±3.08 0.25±0.02 1:3 11.27±2.88 0.25±0.02 
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表 2 星点设计因素和水平
因子 水平 −1.682 −1 0 +1 +1.682 X1 (℃) 60.00 70 85 100 110.20 X2 (mg/ml) 66.36 80 100 120 133.64 X3 0.25 0.33 1.67 3 4
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表 3 星点设计实验安排表和结果(n=3)
序号 X1 (℃) X2 (mg/ml) X3 Y1 (nm) 1 −1 −1 −1 13.04 2 +1 −1 −1 14.23 3 −1 +1 −1 14.48 4 +1 +1 −1 13.39 5 −1 −1 +1 24.37 6 +1 −1 +1 27.30 7 −1 +1 +1 18.62 8 +1 +1 +1 20.73 9 −1.682 0 0 18.87 10 +1.682 0 0 15.62 11 0 −1.682 0 24.01 12 0 +1.682 0 17.06 13 0 0 −1.682 13.92 14 0 0 +1.682 15.11 15 0 0 0 18.81 16 0 0 0 16.84 17 0 0 0 16.14 18 0 0 0 17.89 19 0 0 0 16.20 20 0 0 0 16.30
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