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月腺大戟素A通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞增殖的研究

周瑾 李盛建 覃福礼 杨新颖 张晓琳 赵亮

温瑞睿, 许龙, 朱文静, 杨建伟. 浅谈国外药师主导开展戒烟服务的作用与挑战[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
引用本文: 周瑾, 李盛建, 覃福礼, 杨新颖, 张晓琳, 赵亮. 月腺大戟素A通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞增殖的研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 241-244, 276. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008
WEN Ruirui, XU Long, ZHU Wenjing, YANG Jianwei. A brief discussion on the development and challenges of smoking cessation services led by pharmacist abroad[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
Citation: ZHOU Jin, LI Chengjian, TAN Fuli, YANG Xinying, ZHANG Xiaolin, ZHAO Liang. Inhibition of ebracteolatain A in the proliferation of breast cancer cells by interfering with PKD1-mediated MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 241-244, 276. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008

月腺大戟素A通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞增殖的研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008
基金项目: 国家自然科学基金-青年项目(81303300)
详细信息
    作者简介:

    周 瑾,主管药师,Email:aglie@126.com

    通讯作者: 赵 亮,副教授,副主任药师,Tel:(021)66861212,Email:zhaoliangphar@163.com
  • 中图分类号: R285

Inhibition of ebracteolatain A in the proliferation of breast cancer cells by interfering with PKD1-mediated MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways

  • 摘要:   目的  乳腺癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一。月腺大戟素A(EA)是从中药月腺大戟中提取的乙酰间苯三酚类化合物。探讨EA抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的具体机制,以期为乳腺癌的临床治疗提供新的思路。  方法  在乳腺癌细胞MCF-7中添加不同浓度的EA药物,检测PKD1蛋白表达水平的变化。构建PKD1的过表达质粒体并转染至细胞,用实时荧光定量PCR技术和Western Blot实验检测PKD1的mRNA和蛋白表达水平。CCK-8实验用于检测细胞增殖能力的变化。Western Blot实验用于检测PKD1介导的相关信号通路中关键蛋白的表达水平。  结果  EA以剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞中PKD1蛋白的表达(P< 0.05)。当转染过表达质粒后,PKD1在mRNA和蛋白水平上显著升高(P< 0.001)。同时过表达PKD1显著逆转EA对MCF-7的增殖抑制作用(P<0.001)。信号通路分析证实EA通过抑制PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性影响乳腺癌细胞的增殖能力(P<0.05)。  结论  EA通过调控PKD1介导MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路,能够抑制乳腺癌细胞的增殖。
  • 烟草流行是世界有史以来面临的最大公共卫生威胁之一,全球每年有800多万人由于烟草而死亡[1],吸烟不仅是各种非传染性疾病常见的主要风险因素,尤其是慢性呼吸道疾病、心血管疾病、癌症和糖尿病,同时会影响周围人的健康,而且对个人和国家的经济及社会形象产生负面影响[2]。据估计,每年全球消耗治疗烟草相关疾病的费用约1.4万亿美元[1]

    戒烟是降低非传染性疾病风险的最重要有效的干预措施之一。随着公共卫生工作的防范与发展,60%的烟草使用者希望戒烟[3],但只有约35%能够获得全面的戒烟服务,患者的戒烟意愿突显了在医疗系统内扩大戒烟可及服务及优先开展戒烟治疗的重要性[4-5]

    由于尼古丁的成瘾性,依靠吸烟者以自我管理的方式戒烟实施困难。事实证明,医疗保健专业人员提供的戒烟干预措施比自助式戒烟更有效[6]。药师的工作职责是为公众调配处方、提供用药指导与建议、解答用药咨询等,被认为是为公众提供戒烟服务的最佳专业人员,不仅能够指导其正确使用戒烟替代药品及提供相关建议,同时也可以给予戒烟行为上的专业支持[6-7]

    药师及其药房团队提供的戒烟服务有助于帮助吸烟者戒烟 [8]。葡萄牙进行的一项研究发现,接受药师服务的患者相较于对照组会参加更多社区药房主导的用药咨询(χ2=59.994,P<0.001)、更多电话会议(χ2=17.845,P<0.0013),因此戒烟成功率更高[9]。新加坡一家三级转诊皮肤病中心进行的一项单中心回顾性研究评估了由药师领导的结构化戒烟诊所的疗效,表明药师及其药房团队主导的患者咨询服务能有效为戒烟者提供行为支持[10]

    1.2.1   世界卫生组织的号召与行动

    1998年,世界卫生组织(WHO)首次认识到药师在帮助个人戒烟和防止潜在使用者方面的关键作用[11]。2003年为应对全球烟草流行,WHO成员国通过了《世界卫生组织烟草控制框架公约》(WHO FCTC)[12-13],要求缔约方采取有效措施促进戒烟。WHO FCTC是促进公众健康的一个里程碑,自2005年生效以来,WHO FCTC已有183个缔约方,涵盖90%以上的世界人口[14]

    为了扩大实施WHO FCTC中关于减少烟草需求的条款,WHO在2007年还启动了一项具有成本效益的实用行动MPOWER系列措施[15]。MPOWER措施中的策略与WHO FCTC相一致,已证明在挽救生命和降低医疗卫生费用方面卓有成效[1]。然而随着WHO FCTC的成功实施,一些中低收入国家也面临着来自烟草产业对其干扰的重大障碍[16-17]。药师可以在克服这些问题及现有制度和行业体系结构进行重大变革中发挥一定作用,为促进烟草控制和戒烟工作做出应有的贡献[18]。2019年WHO发布的全球烟草流行报告中,强调了药师为吸烟者戒烟提供帮助,并高度鼓励成员国就此采取行动[19]

    目前,151个国家至少实施了WHO FCTC及MPOWER措施中的一项,150个国家的烟草使用率正在下降。2000年,全世界大约1/3的成年人吸烟,然而,到2022年这一数字已大幅下降约1/5,这反映出各国在减少全球烟草消费方面取得了相当大的进展[20]

    1.2.2   国际药学会的响应与行动

    2003年,国际药学会(FIP)发布了关于药师在促进无烟未来中的作用的政策声明。2007年出版的《遏制烟草流行病:药学的全球作用》和2015年出版的《建立无烟社区:药师实用指南》均强调了药师在戒烟服务方面的重要贡献。

    2023年,FIP出版《支持戒烟和治疗烟草依赖:药师手册》强调药师在为寻求戒烟患者提供系统服务方面的关键作用,是药师支持个人戒烟过程中可参考的综合性实用资源。其涵盖了最新的循证实践、技术和策略,以帮助患者戒烟并减少复吸。该手册详细介绍了以药师为主导的支持戒烟所需的专业知识和实践技能,以及药师可干预的因素(包括非传染性疾病风险因素,如运动不足、不健康饮食习惯和过量饮酒等)及相关措施。随着近年来替代品电子烟使用的增多趋势,出于对电子烟安全性的担忧,同年FIP又发布了《关于电子烟使用对公众健康和经济的影响以及药房工作人员对消除电子烟贡献的声明》[21]

    2024年,WHO和FIP就药师在戒烟中的作用发表了一份新的联合声明,重申了药师在帮助吸烟者戒烟中发挥的关键作用。该声明中,WHO和FIP敦促各个国家烟草控制组织和国家药学协会制定并实施戒烟计划,同时在该计划和各国卫生系统服务的背景下,让药师参与到与烟草的斗争工作中[22]

    有研究表明患者更愿意社区药师参与戒烟服务[23],同时社区药师也有能力开展戒烟服务[24]。美国一家三级护理医院进行的一项研究表明,药师无论是在患者入院还是出院时,都可以对患者开展戒烟宣教与指导,在了解患者疾病与用药史、药物核对和出院咨询工作流程中与患者讨论吸烟问题,通过患者住院期间开展戒烟治疗并不断完善方案,达到有效戒烟的目的[25]

    英国在新型冠状病毒流行期间进行的一项研究表明,药师可以通过远程咨询为戒烟患者开具处方,提供有效的戒烟服务。目前,英国国家医疗服务体系(NHS)正在支持现有药师(包括社区药房药师)获得处方资格,根据患者需要开具戒烟药物从而促进戒烟服务开展。计划到2026年,在英国完成药学学位的毕业生将在监管机构注册为独立处方权药师, 进而扩大了可以提供戒烟服务药师的范围[26]

    美国药师有权根据合作处方协议或通过州范围的协议拥有自主处方权或授权开具处方。处方医生将开启、修改和停止药物治疗以及开具实验室检查的权利委托给药师。药师在完成继续教育课程后,可以根据国家法律法规授予的权限开具某些药物[27]

    药师的戒烟培训应包括基于行为支持的社区药师培训课程,通过戒烟服务个体化随访识别障碍并提供积极的强化措施,可以有效提高患者戒烟率,进而提高其生活质量[28]。El Hajj等[29]在卡塔尔进行的一项随机对照试验评估了戒烟培训计划对药师技能和能力的影响,共有86名社区药师(干预组54名,对照组32名)完成了6个目标结构化临床检查病例。研究结果表明,强化戒烟培训显著提高了社区药师提供戒烟服务的技能和能力。

    在一项评估埃塞俄比亚药师和药学学生对吸烟/戒烟的知识和态度的横断面调查中,与未接受过戒烟培训的人相比,接受过培训人员的平均知识和态度得分明显更高[30]。Greenhalgh等[31]通过定性和混合方法进行的描述性综合和真实世界调查表明,精心设计的戒烟培训课程将药师从生物医学和产品导向的角度,转变为以公共卫生和患者为中心的角度方面发挥至关重要的作用。

    促进戒烟的跨专业合作可以提高患者的戒烟率。一项探索医疗卫生保健专业人员与社区药师之间跨专业合作的研究表明,将社区药师为患者提供戒烟服务纳入患者护理项目是很有价值的,社区药房开展戒烟支持服务可以填补现有医院戒烟与家庭戒烟之间的空白。跨专业合作不仅为患者和医疗保健专业人员之间的有效沟通提供了途径,同时通过医疗保健专业人员汇总的患者电子健康记录,可以提高患者用药治疗的安全性[32]

    根据Greenhalgh等[31]的说法,增加药师和其他医疗从业者之间的跨专业互动是社区药房提供有效戒烟服务的先决条件。药师专业的能力增强了临床医生对药师的信任,因此,明确且精准的转诊途径,特别是当地全科医生将戒烟患者转诊给药师,对于跨专业开展戒烟服务是必要的。

    Bouchet-Benezech等[33]在法国进行的一项研究表明,与其他医疗保健专业人员的合作是发挥药师在戒烟服务中作用的关键之一。药师为戒烟者提供的尼古丁替代治疗处方没有得到社会医疗保险体系的支持,因此建议药师与具有尼古丁替代治疗处方权的其他医疗保健专业人员合作。

    吸烟是非传染性疾病的主要可变风险因素之一。药师主导的戒烟干预措施可以显著影响吸烟者的戒烟率,并在改善其健康状况方面发挥关键作用[34]

    Peletidi等[35]的调查研究表明,以社区药师主导的戒烟服务可以降低与吸烟相关慢病的发病率和病死率。Bouchet-Benezech等[33]为评估法国社区药房药师提供戒烟服务的可行性而进行的一项研究显示,在第6个月,23.3%的参与者参加了随访,其中75%的参与随访者自第一次随访以来一直保持戒烟状态,超过一半的参与者持续了90 d,从第二次随访开始,所有参与者的身心健康综合得分与基线相比都有所提高。

    药师作为一线医疗保健提供者,在戒烟工作中发挥着关键作用,可以在更大范围内对个体和公共健康产生重大影响。社区药房的戒烟服务应该被纳入国家公共卫生保健政策,这对于促进社区服务的健康有积极的促进作用[36]

    Peletidi等[35]在英国进行的一项系统综述强调了将药房主导的戒烟服务与对照组进行比较的研究,提供了强有力的证据证明药房主导的服务具有很高的成本效益。药房主导的服务要求每位戒烟者在为期4周的方案中支付772英镑的补充成本,而对照组基于集体小组的服务需要1 612英镑的戒烟补充成本。同时接受药房主导的戒烟服务,每周一对一的支持结合尼古丁替代疗法的治疗,与对照组接受集体戒烟治疗药物相比具有更高的有效戒烟率。此外,药房主导的服务每生命质量调整年的增量成本为2 600英镑,而对照组为4 800英镑。

    社区药师是提供戒烟服务的一种可获得的、未充分利用的但具有成本效益的资源[24,28,35]。一项随机试验旨在比较两个药师主导的戒烟计划(强化版与简化版)之间的戒烟率以及这些计划与基于文献的对照组之间的成本效益,揭示了强化版药师主导的戒烟计划是3种策略中最具成本效益的干预措施。强化版比简化版多花费了14 000美元(每100名参与者),但14人戒烟成功,取得10.8个生命年的获益额;强化版比对照组多花费35 300美元(每100名参与者),但29名戒烟者取得22.4个生命年的获益,每增加一名戒烟者多花费1 217美元,戒烟的增量成本效果比为1 576美元 [32]

    2000年,一项在英格兰进行的研究从提供者和NHS的角度比较了普通牙科诊所、普通医疗诊所(GMP)、社会药房和NHS戒烟服务(NHS SSS)中戒烟服务的成本效益,研究结果表明“成本效益高”的服务是在社区药房开展戒烟服务[37]

    由此可见,药师主导的戒烟服务不仅有效且极具成本效益,医疗卫生管理者及政策制定者可以基于此就最佳资源分配做出合理决策[24]

    然而,有证据表明,药师在承担戒烟服务提供者这一角色存在障碍,这影响了将全面戒烟服务纳入实践的可行性。障碍包括缺乏充分的培训、缺乏适当的转诊结构、社区药房环境中的时间限制、公众对药剂师提供戒烟服务缺乏认识、药房缺乏私人咨询区以及缺乏提供服务的报销[33]

    在许多国家,药师缺乏戒烟知识和技能以及缺乏培训被认为是药师在提供戒烟服务方面发挥作用的常见障碍[6,30,32,35,38-39]。Erku等[30]在埃塞俄比亚进行的一项由410名参与者(213名药学学生和197名药师)的横断面调查,提出药师在戒烟服务方面存在临床知识不足和实践技能差距。澳大利亚进行的另一项研究分析了250名大四药学专业学生、51名药师和20名戒烟教育工作者在当前基于证据的药房戒烟干预实践中的表现,得出了药学学生及药师与戒烟教育工作者之间存在较大的临床或药物治疗服务方面的差距[34]。药师由于缺乏戒烟相关教育与培训导致在戒烟服务中缺乏自信,从而阻碍了与患者的有效沟通,降低了提供的戒烟服务的质量[35,39]。在约旦,大多数药师认为,由于培训不到位导致对戒烟治疗的了解不足,致使药师无法提供足够的戒烟干预措施[40]

    缺乏戒烟计划或劳务报酬也是许多有意愿药师提供戒烟服务的一个障碍[31-33,39-40]。美国的一篇研究论文探讨了药师在护理过渡期间(住院到出院回家期间)如何衔接戒烟服务,得出支付报酬对维持任何医疗服务(包括药师提供的戒烟服务)至关重要。由于药师不被视为戒烟服务的提供者,因此美国大多数州的药师没有资格通过医疗补助获得提供戒烟服务的劳务报酬,通过商业保险获得报销的也很少见。缺乏鼓励药师向烟草使用者提供戒烟干预措施的计划和政策,药师没有戒烟药物处方权也大大阻碍了戒烟服务的开展[35]。研究表明,授予药师戒烟服务提供者身份或药师拥有戒烟药物处方权,并在医保政策中明确劳务报酬的支付标准,可能是解决该问题的最佳方式[40]

    社会药店缺乏相对私人空间为患者进行戒烟咨询服务也是障碍之一[6,33]。药店是否设有专门的可以为患者提供面对面戒烟服务咨询的区域,为患者咨询营造一个轻松舒适的环境,对于提高患者戒烟依从性是非常重要的影响因素[33]。药师实施戒烟服务与履行其他职责在时间上的矛盾也是限制戒烟服务工作开展的障碍之一[34-35]。根据Peletidi等[35]的系统调查结果显示,缺乏时间是所有参与戒烟服务者,包括患者在内的共性问题。日本对11家社区药房进行的一项随机研究显示,由于时间和精力有限,许多药房没有将戒烟服务纳入其日常运营范围[32]

    在法国、约旦和尼日利亚等一些国家,对戒烟服务的需求不足被视为药师开展戒烟服务的障碍[9,33,40]。由于缺乏戒烟服务,泰国的戒烟率很低,因此需要在药店开展戒烟服务,为药师提供机会[36]。为了解决这一问题,Bouchet等[33]评估了法国社区药房实施药师提供的戒烟方案的可行性,并建议向社区药房顾客有效推广戒烟服务,以解决需求不足的问题。

    社会药房在烟草控制政策中的参与度较低[9],原因是医疗机构与社会药房缺乏统一的转诊系统来保障提供安全、有效的戒烟服务[23,28]。社会药房药师在无法全面、详细获得患者医疗护理、处方记录的前提下,也就意味着无法了解到患者准确的疾病史与用药史,提供戒烟药物及相关指导可能会增加用药错误的可能性[26]。其他阻碍戒烟服务工作开展的因素还包括性别、年龄、民族、文化等不同所带来的戒烟者个性化差异及沟通交流障碍[23]

    全面了解药师主导的戒烟服务及其在不同地区和医疗保健环境中的影响,对于世界各国药师参与戒烟服务至关重要。基于药师缺乏戒烟知识、技能和培训有关的问题,政策制定者和教育工作者需要做更多的工作,以确保戒烟服务对患者的最大益处。有必要针对不同地区和国家的具体需求采取全面的能力建设措施,包括制定标准化的培训计划,采用线下结合远程学习方式助力药师实践技能发展,促进全球药师专业的持续深入发展。

    医药卫生政策制定应适时考虑将药师主导的戒烟服务纳入国家和地区医疗卫生服务指南,并开展宣传工作,提高人们对药师在戒烟方面发挥作用的认识。立法明确和药师薪酬补偿将有利于公众获得经许可的戒烟服务的机会,扩大药师在提供戒烟服务中的作用也有利于增强公众戒烟信心,同时在不同的医疗保健环境中实施和扩大这些服务争取足够的资源与支持。未来应促进药师、医师、护师、公共卫生专业人员及其他参与烟草控制工作的利益相关者之间更紧密的合作,激发出药师主导戒烟干预措施的全部潜力,提高戒烟的有效性和可持续性。

    随着医药卫生体制的改革及药师进一步以患者为中心的角色转变,药师的可及性被视为开展戒烟服务的最重要驱动因素之一。药师和社会药房团队能够通过结合药理学和行为学方法持续提供成本效益高的个体化戒烟服务,提高戒烟率,最终达到减轻烟草和尼古丁依赖以及烟草相关疾病的负担,促进医疗卫生系统的发展、改善全球卫生状况。

  • 图  1  EA对MCF7细胞中PKD1的调控作用

    *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001,与对照组比较。

    图  2  PKD1 mRNA和蛋白表达水平及对增殖的影响

    **P<0.01,***P<0.001,与对照组比较; #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,与EA组比较。

    图  3  EA通过干扰PKD1介导的信号通路抑制细胞增殖的机制研究

    *P<0.05,**P<0.01,与对照组比较; ##P<0.01,与EA组比较。

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-03
  • 修回日期:  2019-12-27
  • 网络出版日期:  2020-05-20
  • 刊出日期:  2020-05-01

月腺大戟素A通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞增殖的研究

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008
    基金项目:  国家自然科学基金-青年项目(81303300)
    作者简介:

    周 瑾,主管药师,Email:aglie@126.com

    通讯作者: 赵 亮,副教授,副主任药师,Tel:(021)66861212,Email:zhaoliangphar@163.com
  • 中图分类号: R285

摘要:   目的  乳腺癌是世界上最致命的恶性肿瘤之一。月腺大戟素A(EA)是从中药月腺大戟中提取的乙酰间苯三酚类化合物。探讨EA抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的具体机制,以期为乳腺癌的临床治疗提供新的思路。  方法  在乳腺癌细胞MCF-7中添加不同浓度的EA药物,检测PKD1蛋白表达水平的变化。构建PKD1的过表达质粒体并转染至细胞,用实时荧光定量PCR技术和Western Blot实验检测PKD1的mRNA和蛋白表达水平。CCK-8实验用于检测细胞增殖能力的变化。Western Blot实验用于检测PKD1介导的相关信号通路中关键蛋白的表达水平。  结果  EA以剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞中PKD1蛋白的表达(P< 0.05)。当转染过表达质粒后,PKD1在mRNA和蛋白水平上显著升高(P< 0.001)。同时过表达PKD1显著逆转EA对MCF-7的增殖抑制作用(P<0.001)。信号通路分析证实EA通过抑制PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性影响乳腺癌细胞的增殖能力(P<0.05)。  结论  EA通过调控PKD1介导MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路,能够抑制乳腺癌细胞的增殖。

English Abstract

温瑞睿, 许龙, 朱文静, 杨建伟. 浅谈国外药师主导开展戒烟服务的作用与挑战[J]. 药学实践与服务, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
引用本文: 周瑾, 李盛建, 覃福礼, 杨新颖, 张晓琳, 赵亮. 月腺大戟素A通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞增殖的研究[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(3): 241-244, 276. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008
WEN Ruirui, XU Long, ZHU Wenjing, YANG Jianwei. A brief discussion on the development and challenges of smoking cessation services led by pharmacist abroad[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(12): 537-541, 548. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202408054
Citation: ZHOU Jin, LI Chengjian, TAN Fuli, YANG Xinying, ZHANG Xiaolin, ZHAO Liang. Inhibition of ebracteolatain A in the proliferation of breast cancer cells by interfering with PKD1-mediated MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(3): 241-244, 276. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.201912008
  • 乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一,近年来已经成为致女性死亡的第二大原因[1]。虽然临床研究人员和基础科学家对乳腺癌进行了广泛研究,同时手术切除、放射性同位素治疗、化学药物治疗、自体免疫细胞治疗、靶向治疗等技术也已经成功应用于乳腺癌患者的治疗[2]。然而,这些传统的治疗方法大多存在副作用,因此有必要寻找新方法来改善患者预后和生活质量。由于中药中含有复杂的化合物,且在多种人体疾病中发挥作用,因此,中药在癌症患者的康复及术后放/化疗的辅助治疗等方面越来越引起人们的关注。

    月腺大戟(Euphorbia ebracteolata Hayata)为金虎尾目大戟科大戟属的多年生草本植物,多分布在土坡、草地或者林下。在我国的安徽、河南、江苏、山东、湖北省常见。月腺大戟作为传统中药最早记载于《神农本草经》,到目前为止已经有2 000多年历史,它以根入药,具有逐水祛痰、散结杀虫的功效,可治疗水肿、哮喘、消化不良、皮癣等疾病。近来发现研究中药月腺大戟中的提取物具有抗肿瘤活性。月腺大戟中含有多种化学成分,包括萜类、脂类、酚类、苯乙酮类、黄酮类以及鞣质类。本课题组前期实验中,从月腺大戟中提取了一种乙酰间苯三酚类化合物月腺大戟素A(EA),并证实它能抑制乳腺癌细胞的增殖能力[3-4]。蛋白激酶D1(PKD1)是一种新型的丝氨酸/苏氨酸激酶,在多种癌症组织中异常表达,可以通过作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路,调控乳腺癌细胞的增殖能力[5]。但是EA如何影响乳腺癌细胞增殖能力的具体机制,以及是否通过影响PKD1从而影响乳腺癌的增殖能力均不明确。

    本研究根据前期实验对EA影响乳腺癌的具体机制的研究,结果表明EA具有通过干扰PKD1介导MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路以抑制乳腺癌细胞的增殖能力。

    • 人乳腺癌MCF-7细胞(美国模式菌种收集中心,ATCC);DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗溶液(Gibco公司);转染试剂脂质体2000和TRIzol(Invitrogen公司);RNA抽提、反转录、qRT-PCR试剂盒以及BCA蛋白定量试剂盒(北京康为世纪公司);CCK-8试剂(MedChemExpress公司);RIPA裂解液(碧云天公司);PKD1抗体(Santa Cruz Biotechnology公司),P-ERK1/2,ERK1/2,P-AKTAKT,GAPDH抗体(Cell Signaling公司);Western Blot增强化学发光试剂盒(Millipore公司)。PKD1过表达质粒pcDNA3.1-PKD1由Genescript公司构建,载体为pcDNA3.1。中药月腺大戟饮片购自安徽(产地:山东),其中,月腺大戟素A的制备采用课题组前期实验中的方法[4]

    • 人乳腺癌细胞系MCF-7细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素溶液的DMEM培养液中,置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中进行贴壁培养。细胞转染时将处于对数生长期的细胞接种至6孔板中,提前混匀好转染试剂脂质体2000和质粒pcDNA3.1-PKD1或者对照质粒pcDNA3.1,添加至细胞培养板中,混匀后放置培养箱中培养6 h,换正常培养基继续培养。EA药物处理时,首先将处于对数生长期的MCF-7细胞按照1×105个/孔的数目接种到6孔板中,待细胞贴壁后加入不同浓度的EA药物(1、5、10、15、20 μmol/L)处理细胞,待进行后续试验。

    • 通过CCK-8实验检测乳腺癌细胞增殖能力的变化。首先,将转染或加药处理的细胞按照每孔接种104/100 μl的浓度接种至96孔板中,每隔24 h检测一次,连续检测3 d,同时每个处理组在每个时间点均设置3个复孔,便于统计分析。每次检测前向96孔板中添加10 μl CCK-8试剂,在培养箱中孵育1 h后,放置酶标仪中震荡1 min,检测其在450 nm处的吸光值(OD)。统计3 d的OD值评估细胞增殖能力的变化。

    • 通过qRT-PCR实验检测乳腺癌细胞中mRNA的表达。在转染或加药处理的孔板中添加TRIzol试剂,放置4 ℃摇床震荡5 min保证细胞充分裂解。利用抽提试剂盒提取细胞中的总RNA,并将其反转录为cDNA,根据qRT-PCR试剂盒说明书在ABI 7300实时PCR系统上进行qRT-PCR检测。反应过程中以GAPDH作为内参,计算PKD1的相对表达量。反应中的引物序列为:PKD1,reverse, 5’-CCCACGTGATGGACTCAAAGA-3’ forward, 5’-AAGGGTACGGGCCTCTCAAA-3’;GAPDH,reverse, 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’和forward: 5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3’。

    • 通过Western Blot检测细胞加药或转染后相关蛋白的表达。将加药或者转染处理好的细胞加入RIPA裂解液裂解提取总蛋白。收集细胞裂解液,按照BCA蛋白定量试剂盒的说明书检测蛋白浓度。垂直电泳槽上样的每孔中加25 μg蛋白进行凝胶电泳分离,电压设置为80 V;待分离完成后将蛋白从凝胶中转至PVDF膜,电压设置为110 V,时间为120 min。转膜结束后将PVDF膜放置5%脱脂牛奶中进行封闭2 h;在4 ℃摇床中孵育一抗过夜(GAPDH以1:5 000稀释,PKD1以1:500稀释,其他抗体均按照1:1 000稀释),用TBST洗膜3次,每次10 min;室温摇床中用带有HRP标记的二抗(羊抗兔IgG或者羊抗鼠IgG均按照1:10 000稀释)孵育1 h,用TBST洗膜3次,每次10 min;用ECL显影液进行显影。

    • 数据统计和分析均采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0软件进行,数据以(${{\overline x} \pm s} $)表示。采用Student’s t test和单因素方差分析进行组间差异的比较。检验水准(α)为0.05。

    • 根据前期实验以及报道,推测EA通过调控PKD1的表达影响乳腺癌细胞的增殖能力,因此,在本研究中首先分析经不同浓度EA处理的乳腺癌细胞中PKD1蛋白水平的变化。结果如图1所示,EA显著抑制乳腺癌细胞中PKD1蛋白的表达水平(P< 0.05),且这种抑制呈剂量依赖性。同时,根据此实验结果EA在15 μmol/L时能显著降低PKD1的表达,故采用此浓度进行后续研究。

      图  1  EA对MCF7细胞中PKD1的调控作用

    • 为了进一步研究EA是否通过PKD1调控乳腺癌细胞的增殖能力,课题组首先检测了EA的加药效果及过表达PKD1质粒是否转染成功。结果如图2A图2B所示:乳腺癌细胞转染过表达质粒后PKD1的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.001)。结果证实过表达PKD1的转染效率较高。研究还发现EA干预处理后PKD1在mRNA和蛋白水平上均受到抑制(P<0.001),但是此抑制作用在转染过表达PKD1后被显著逆转(P< 0.001)。即PKD1能逆转EA对乳腺癌细胞中PKD1表达的抑制作用。通过CCK-8实验进一步验证EA是否通过PKD1影响乳腺癌细胞的增殖能力。结果如图2C所示,过表达PKD1后细胞的增殖能力显著升高。而EA药物干预后乳腺癌细胞的增殖能力显著被抑制(P< 0.01),当转染过表达质粒PKD1后,EA对乳腺癌细胞的增殖抑制作用被显著逆转(P<0.01)。

      图  2  PKD1 mRNA和蛋白表达水平及对增殖的影响

    • 为了进一步阐明EA如何通过干扰PKD1影响乳腺癌细胞的体外增殖能力,课题组研究了PKD1调控的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的变化。如图3所示:乳腺癌细胞过表达PKD1后,p-ERK1/2、p-AKT表达水平显著升高(P<0.01);当EA药物处理后p-ERK1/2、p-AKT表达水平显著降低(P< 0.05)。然而对PKD1过表达的细胞给予EA药物处理后,PKD1能显著恢复EA药物处理对MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路中关键蛋白表达水平的影响。实验结果证实了EA可能通过调控PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路来影响乳腺细胞的增殖能力。

      图  3  EA通过干扰PKD1介导的信号通路抑制细胞增殖的机制研究

    • 虽然近年来在乳腺癌的早期发现和治疗中取得了重大进展,但是乳腺癌患者的5年生存率仍然较低。基于中药的中医治疗在过去几十年中已得到越来越多的应用,并因其在增强化疗过程中的功效和降低毒性方面的重要作用而被关注,并且在多种癌症的预防和治疗方面具有一定作用[6-7]。据估计,美国国家癌症研究所(NCI)每年在中医相关研究项目上花费约1.2亿美元[8]。乳腺癌患者的治疗除了手术、放射疗法、化学疗法以外,还经常将中药治疗视为一种治疗方法[9]

      EA是从中药月腺大戟中提取的乙酰间苯三酚类化合物。在前期研究结果中证实EA可以抑制乳腺癌细胞的增殖能力。蛋白激酶D(PKD)是一个进化保守的蛋白激酶家族,具有不同PKC家族成员的结构酶学和调控特性。PKD1是其中研究最多的家族成员。研究发现PKD1可以通过作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌细胞的增殖能力[5]。因此,在本研究中首先验证了EA是否会影响PKD1的表达。结果显示EA呈剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞中PKD1蛋白表达。为了进一步证实EA是否通过影响PKD1的表达来调控乳腺癌细胞的增殖能力,课题组体外构建了PKD1过表达质粒转染乳腺癌细胞。在证实转染效率较高后,发现PKD1过表达能够逆转EA在mRNA和蛋白水平上对PKD1的抑制作用。同时,EA能显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力,这与前期研究结果一致。然而,原本受EA干预而降低的细胞增殖能力在PKD1过表达的情况下被显著逆转,证实PKD1能逆转EA对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。

        最后,课题组对EA如何通过干扰PKD1影响乳腺癌细胞增殖能力的机制进一步研究。既往的研究已经证明PKD1可以通过作用于MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌细胞的增殖能力[10]。因此,我们分析了MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的变化。实验结果证实EA药物作用于乳腺癌细胞时p-ERK1/2、p-AKT表达水平显著降低,说明EA能抑制MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性。但是,当EA药物和PKD1过表达同时处理时,PKD1过表达能显著恢复EA对p-ERK1/2、p-AKT的抑制作用。实验结果证实EA可能通过干扰PKD1介导MAPK和PI3K/AKT信号通路活性,从而抑制了乳腺癌细胞增殖。

      此外,肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程,本研究证实PKD1能显著促进乳腺癌细胞的增殖能力,这与已有的文献报道中PKD1会促进乳腺癌细胞增殖能力的结果是吻合的。但是在其他文献中报道过表达PKD1会显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭过程[11]。也就是说在肿瘤发生转移和侵袭前,肿瘤细胞大量增殖的阶段可以通过药物抑制PKD1的表达和活性,从而抑制肿瘤细胞的增殖。因此,在乳腺癌发生转移和侵袭前,使用EA抑制PKD1的表达和活性,可能具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能但是,如果肿瘤发生转移和侵袭后,药物抑制PKD1的表达,可能会产生促进肿瘤转移和侵袭的结果,使得肿瘤疾病向更加恶化的方向发展。因此,EA在乳腺癌中的应用应该严格注意肿瘤病理状态,在未发生转移和侵袭的患者中EA可通过抑制PKD1发挥抗肿瘤作用,而在已发生肿瘤转移和侵袭的患者中则应该谨慎使用调控PKD1的药物。

      综上所述,经过一系列研究证实EA以剂量依赖的方式抑制乳腺癌细胞中PKD1的表达,而PKD1过表达能恢复EA对乳腺癌细胞增殖能力的抑制作用。同时,EA可能通过干扰PKD1介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的活性抑制乳腺癌细胞的增殖能力。总之,本研究首次揭示了EA药物通过抑制PKD1的表达及其介导的MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路发挥抑制乳腺癌细胞的增殖作用。

参考文献 (11)

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