The content research on malonyl-ginsenoside Rb3 in different tissues of Panax ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng

CUI Xiaoxue; WANG Yingxia; ZHOU Guangxin; HUANG Xiaoyu; WANG Liuming; LIU Xiao

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202410049

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CUI Xiaoxue, WANG Yingxia, ZHOU Guangxin, HUANG Xiaoyu, WANG Liuming, LIU Xiao. The content research on malonyl-ginsenoside Rb3 in different tissues of Panax ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410049

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CUI Xiaoxue, WANG Yingxia, ZHOU Guangxin, HUANG Xiaoyu, WANG Liuming, LIU Xiao. The content research on malonyl-ginsenoside Rb3 in different tissues of Panax ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410049

The content research on malonyl-ginsenoside Rb3 in different tissues of Panax ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410049

CUI Xiaoxue^{1, 2
,},
WANG Yingxia^{1, 2},
ZHOU Guangxin^{1, 2},
HUANG Xiaoyu^{1, 2},
WANG Liuming^{1, 2},
LIU Xiao^{1
,
,}

1.
Modern Research Centre for Traditional Chinese Medicine, Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China
2.
School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

Received Date: 2024-10-28
Accepted Date: 2026-05-27
Rev Recd Date: 2025-07-23

Abstract

Objective To compare the contents of malonyl-ginsenosides Rb3 （MG-Rb3） in different parts, including roots, stems, leaves and flowers, of Panax ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng. To explore the effects of two drying methods, constant temperature drying and vacuum freeze drying on their contents. Methods The contents of MG-Rb3 in P. ginseng, P. quinquefolium and P. notoginseng were compared based on HPLC analysis, using enzymatically synthesized MG-Rb3 as the reference standard. Results The buds of P. ginseng and P. quinquefolium exhibited relatively high levels of MG-Rb3, which were approximately 7.3-18.1 times and 2.8-4.3 times higher than those found in the roots, respectively, and the lowest contents were detected in the stems. The content of MG-Rb3 in P. notoginseng flower buds was about 31.2 times higher than that in leaves. The content of MG-Rb3 in the buds treated by constant temperature drying was about 1-1.1 times that of using vacuum freeze drying. Conclusion The highest content of MG-Rb3 was detected in the flower buds of P. ginseng and P. notoginseng, and the content of MG-Rb3 in leaves of P. quinquefolium was the highest. Content of MG-Rb3 in the buds after constant temperature drying was slightly higher than that of using vacuum freeze drying.
- Panax ginseng,
- Panax quinquefolium,
- Panax notoginseng,
- malonyl-ginsenoside Rb3,
- content determination,
- treatment methods

References

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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人参（Panax ginseng C. A. Mey.）、西洋参（Panax quinquefolius L.）、三七（Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen）均为五加科人参属植物^[1]，具有心血管保护、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等作用^[2-3]，被广泛应用于药物、膳食补充剂、食品、化妆品等方面，具有很大的市场价值^[4-6]。人参皂苷（ginsenoside）为人参属植物主要活性成分，根据苷元结构主要分为4种类型：原人参二醇型皂苷（PPD型）、原人参三醇型皂苷（PPT型）、齐墩果酸型皂苷（OA型）和Ocotillol型皂苷（OT型）^[7]。根据人参皂苷的酸碱性可以分为酸性皂苷和中性皂苷，其中酸性皂苷主要为丙二酰人参皂苷（malonyl-ginsenoside, MG）。

在人参、西洋参及三七新鲜药材中，丙二酰人参皂苷的含量约能占总皂苷含量的35%~60%^[8-9]，是人参属植物中广泛存在、结构多样性丰富的一类天然原生苷。目前已从人参属植物中检测到百余个丙二酰人参皂苷类成分，以丙二酰人参皂苷MG-Rb1，MG-Rb2和MG-Rc为主要代表成分。近年来，围绕人参属植物中MG的检测方法、结构解析及提取工艺的研究已有报道^[10-12]，但一些稀有丙二酰人参皂苷在不同人参属植物中的含量还有待深入研究，如丙二酰人参皂苷Rb3（malonyl-ginsenoside Rb3，MG-Rb3）。MG-Rb3为人参皂苷Rb3在葡萄糖6位上发生丙二酰基化的产物，研究表明，其对DPPH自由基表现出良好的清除能力^[13]，也可通过肝脏与骨骼肌中IRS1/PI3K/Akt和GLUT4信号通路来降低小鼠的血糖水平^[14]，但由于该化合物在传统提取分离过程中易降解，来源途径受限，对照品缺乏，因此很大程度上限制了对其药理活性及其在人参属不同植物中分布等方面的深入研究。

课题组前期从植物中克隆鉴定了一个丙二酰基转移酶CtMaT1^[15]，并成功构建可原位循环利用丙二酰辅酶A的“一锅法”反应体系^[16]，该体系可催化人参皂苷Rb3生成对应的丙二酰基化产物MG-Rb3，为针对性研究MG-Rb3在不同人参属植物样本中的含量提供了对照。本实验在此基础上通过HPLC法比较三种人参属植株的根、茎、叶和花蕾四个部位中MG-Rb3的含量差异，并进一步比较恒温干燥和真空冷冻干燥两种干燥处理方式对花蕾中MG-Rb3含量的影响，以期为不同部位MG-Rb3的含量差异以及人参属植物的前期处理方式提供理论依据。

1. 仪器、材料与试剂

1.1. 仪器

Agilent 1260分析型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；LCMS-IT-TOF液质联用仪（Shimadazu）；超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司）；Talpha 2-4 LD plus 冷冻干燥机（Chris）；EZ-2真空离心浓缩仪（Christ LCG）；电热恒温鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；电子天平（Mettler Toledo）；旋转蒸发器（BUCHI）。

1.2. 材料与试剂

MG-Rb3对照品为实验室自制（HPLC≥98%）；乙腈、甲酸为色谱纯（Fisher Scientific）；纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲醇为分析纯（天津市致远化学试剂有限公司）。

人参和西洋参均为四年生栽培植株，于2024年6月采自中国吉林省抚顺市抚松县，三七为两年生栽培植株，于2024年7月采自中国云南省文山州文山县，经北京中医药大学中药现代研究中心刘晓研究员鉴定为五加科人参属植物人参（P. ginseng）、西洋参（P. quinquefolius）、三七（P. notoginseng）。

2. 方法

2.1. 样品的制备

2.1.1. 植物样本处理

将新鲜采摘的人参、西洋参和三七植株分为根、茎、叶和花4个部分，用纯净水洗净表面泥土，吸干水分，作为新鲜植物样本。将3种植株4个部位的新鲜植物样本于50℃条件下恒温干燥后，研钵研磨至粉末状，作为恒温干燥处理后的植物样本。将3种植株4个部位的新鲜植物样本于–64℃冷冻干燥后，研钵研磨至粉末状，作为真空冷冻干燥处理后的植物样本。

2.1.2. 供试品溶液的制备

称取上述不同处理方式的植物样本，按照质量（g）/体积（ml）=1∶20的比例加入80%甲醇冷浸20 h后常温超声30 min，重复提取3次，高速离心后获得提取液，将提取液于37℃下减压蒸干，残渣按0.2 g/ml浓度比例用80%甲醇复溶，所得溶液经0.45 μm有机滤膜过滤，用于检测。

2.1.3. 色谱条件

采用HPLC法比较3种人参属植物测定四个部位中MG-Rb3的含量差异。使用Agilent 1260 HPLC进行检测，色谱条件如下：色谱柱CAPCELL PAK C18 COLUMN（4.6 mm× 250 mm，MG III，5 µm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序为0～5 min，5%～20% B；5～8 min，20%～30% B；8～38 min，30%～34% B；38～58 min，34%～43% B；58～68 min，43%～100% B；68～77 min，100% B。检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度设置为80℃，雾化器载气为高纯氮，载气流速为1.6 ml/min，增益值为4，流量体积为1.0 ml/min，柱温30℃，进样量为10 μl。

利用岛津离子阱飞行时间质谱仪LCMS-IT-TOF进行高分辨质谱分析确定产物。色谱柱、液相条件及进样体积同上。质谱为电喷雾离子源（ESI），质谱分析条件参数分别为：正、负离子模式，自动多级MS¹、MS²、MS³全扫描；干燥气体为N₂，压力为100 MPa；雾化气体为N₂，流速为1.5 ml/min；检测器电压为1.58 kV；离子阱真空度为1.9×10⁻² Pa；曲线脱溶剂管（CDL）温度为200 °C；加热器温度为200 °C；冷却气体和碰撞诱导解离（CID）的碰撞气体为高纯氩气。CID碰撞能量设为50%；离子积累时间为100 ms。用软件LCMS solution Version 3（Shimadzu）进行数据处理。

2.2. 酶催化MG-Rb3的生成

CtMaT1基因的异源表达及重组蛋白分离纯化步骤参考文献^[15]。酶促反应体系如下：0.4 mmol/L人参皂苷Rb3，1.5 mmol/L辅酶A，3 mmol/L丙二酸，3 mmol/L ATP，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl₂，60 μg CtMaT1，60 μg AtMatB，K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液（pH 6.0）补充至100 μl，30℃反应过夜，加200 μl甲醇终止反应，4℃，14 000 r/min离心30 min，取上清液按照“2.1.3”项色谱条件进行检测。

2.3. 方法学考察

2.3.1. 线性关系考察

精密称取MG-Rb3对照品少许，并用DMSO配制成对照品溶液，依次稀释成含量分别为72.81、145.63、291.25、582.50、1 165.00、2 330.00、4 660.00 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件测定，记录数据。

2.3.2. 精密度实验

配制浓度为447.00 μg/ml的对照品溶液，按“2.1.3”项色谱条件连续进样6次测定MG-Rb3的含量，并记录数据。

2.3.3. 重复性实验

取同产地同一批人参新鲜花蕾0.8 g，按“2.1.2”项方法制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件测定MG-Rb3的含量，记录数据。

2.3.4. 稳定性实验

取人参新鲜花蕾约0.8 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、16、24 h按“2.1.3”项色谱条件检测24 h内MG-Rb3的含量。

2.3.5. 加样回收率实验

按照称样量减半称取同产地同一批人参新鲜花蕾约0.4 g，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，以1:1的比例加入定量MG-Rb3对照品溶液后，按“2.1.3”项色谱条件测定MG-Rb3的含量，记录数据。

4. 讨论

人参、西洋参和三七均为常用中药中的重要药材，对心血管系统、中枢神经系统、代谢和免疫系统方面的疾病均有积极的治疗作用^[18]，其主要成分为中性皂苷和酸性皂苷，酸性皂苷主要为丙二酰人参皂苷。丙二酰人参皂苷可激活Ⅱ型糖尿病的新靶点AMPKα2β1γ1^[18]，是一种具有潜在抗糖尿病活性的化合物^[19]。做为丙二酰人参皂苷的代表之一，MG-Rb3具有抗氧化和降糖活性，但由于天然来源的丙二酰人参皂苷在传统提取分离过程中易降解，因此其分析可用对照品缺乏。本研究利用酶催化Rb3丙二酰基化产物作为对照色谱峰，比较分析了人参、西洋参和三七的根、茎、叶和花蕾4个部位中MG-Rb3的含量，发现西洋参中MG-Rb3分别在叶和花中含量较高；而在人参和三七两种植物的花蕾中，MG-Rb3的含量均较高，叶次之，根和茎中最少。然而由于花蕾并非传统入药部位，在应用方面，它被广泛用于冲泡代茶饮等保健品中；在研究方面，关于其化学成分以及药理活性的研究也远远不如其他部位，忽视了其药用价值，造成了资源浪费。因此，加深人参属植物花蕾的化学成分及药理活性研究对全面认识人参属植物的药效物质基础也会有重要意义。

丙二酰人参皂苷在高温、酸碱条件下易发生降解，转变为乙酰基人参皂苷或中性人参皂苷，这也就导致人参属植物药材的不同加工品中丙二酰人参皂苷的含量变化较大，因此研究适合人参属植物的加工处理方式是十分必要的。Xu等^[17]发现高山栽培人参经冻干处理后丙二酰人参皂苷的含量高于自然风干的含量；张单丽等^[20]发现当丙二酰人参皂苷水溶液以100℃的温度加热至8 h时，丙二酰人参皂苷全部降解；当丙二酰人参皂苷粉末以微波加热或120℃高温蒸制时，短时间内均有降解为中性皂苷或稀有皂苷的现象；当丙二酰人参皂苷粉末以烘焙的形式加热时，即使是高温也未发生降解。李芳等^[21]发现丙二酰人参皂苷的降解率随着烘干温度的升高而升高。由此可见，丙二酰人参皂苷不同的存在形式也会影响其自身的降解，当以水溶液形式存在时，降解率随着温度的升高而升高，但人参属药材入药及提取分离过程中不可避免地会以水溶液及混合物的形式存在，所以对于人参属药材中丙二酰人参皂苷降解因素的研究应以药材本身为材料以及以药材的前期处理方式为内容。本研究以MG-Rb3的含量占比为考察指标，比较恒温干燥和真空冷冻干燥两种干燥处理方式对3种植株的花蕾中MG-Rb3含量的影响，发现恒温干燥的效果略高于真空冷冻干燥，后续针对人参属植物中丙二酰人参皂苷提取分离或成分分析的研究可以花蕾为材料，采用温度为50℃的恒温干燥处理方式。本研究以丙二酰人参皂苷代表成分MG-Rb3为研究对象，围绕其在人参、西洋参及三七不同部位（根、茎、叶、花）中的含量差异及恒温干燥和真空冷冻干燥两种干燥处理方式对该化合物的提取含量进行了分析，为后续围绕MG-Rb3的相关研究提供了有益借鉴。

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