Preliminary study on the antibacterial material basis of Coptidis Rhizome extracts by diffierent methods based on spectrum-effect relationship

Agilent1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BSC-1300IIB2型生物安全柜（苏洁医疗器械有限公司）；InfiniteF50酶标仪（奥地利Untersbergstr公司）；LDZH-150KBS型立式自动电热蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；AUX220电子分析天平（日本岛津公司）；KQ-500B超声清洗机（昆山超声波仪器厂）；HWS-400型恒温恒湿箱（上海精宏实验设备有限公司）；101-2A型数显式电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司）；DG-2B多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；DKB-600电热恒温水槽（扬州慧科电子有限公司）。

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003，批号：5a32-1（274），来源：中国食品药品检定研究院]；胰酪大豆胨液体培养基（TBS，批号：1082451，广东环凯微生物科技有限公司）。

盐酸小檗碱（批号：110713-201212，含量按86.7%计）、盐酸药根碱（批号：110733-201609，含量按89.5%计））、阿魏酸（批号：110773-201313，含量按99.6%计）均来源于中国食品药品检定研究院；盐酸巴马汀（批号：171869-957，纯度≥98%）、盐酸表小檗碱（批号：889665-86-5，纯度≥98%）均来源于贵州迪大科技有限责任公司；黄连片（批号：20190403，产地：四川，广东汇群堂中药饮品股份有限公司）经联勤保障部队第九〇九医院/厦门大学附属东南医院（本院）中药师曹毅祥鉴定，均为毛茛科植物黄连的干燥根茎；乙腈（批号：21045061，色谱纯，安徽天地高纯溶剂有限公司）；盐酸、甲醇、无水乙醇、95%乙醇等均购自西陇化工股份有限公司，均为分析纯；水为纯化水。

取金黄色葡萄球菌冷冻管（2代）接种于TBS培养基中，于35℃条件下培养48 h；取培养液用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍逐级稀释，制成各稀释级的菌悬液。采用平板计数法，测定含菌量，选取浓度为10⁵～10⁶ cfu/ml的菌悬液，放置2～8℃冰箱备用。

取黄连片经105℃干燥，粉碎，过40~60目筛，称取黄连药材粉末9份，每份10 g。取药材粉末分别加入100 ml的水、1%盐酸甲醇、60%乙醇，每种溶剂各3份；各取一份，分别超声震荡（50 Hz）、水浴加热回流、50℃恒温水箱浸泡60 min，冷却至室温，滤过；滤渣加入相应溶剂80 ml，继续用相同提取方法处理40 min，滤过，合并滤液，并定容至200 ml，即得含药量为0.05 g/ml的提取物溶液，超声法提取物溶液A组、B组、C组；加热回流法提取物溶液D组、E组、F组；浸泡法提取物溶液G组、H组、I组，2～8℃冷藏备用。

色谱柱：依利特 Kromasil C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），其中每1 000 ml磷酸溶液中含500 µl三乙胺，梯度洗脱：0~20 min，95%~79% B；20~45 min，79%~74% B；45~50 min，74%~95% B；流速：1.0 ml/min；检测波长：278 nm；柱温30℃；进样量10 µl。

精密量取上述A~I 9组黄连提取物溶液1 ml，分别置10 ml容量瓶中，纯化水稀释至刻度，摇匀，即得A~I 9组黄连提取物供试品溶液。

称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸表小檗碱、盐酸药根碱以及阿魏酸对照品适量，精密称定，分别用甲醇溶解并定容，即得各对照品溶液储备液；分别精密量取各对照品储备液适量，置10 ml容量瓶中，甲醇稀释并定容，即得含量分别为0.046 2、0.019 6、0.014 8、0.019 2、0.065 2 mg/ml的混合对照品溶液。

取混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，以将盐酸小檗碱色谱峰为参照峰，计算各对照品峰相对保留时间及相对峰面积RSD值均<1.5%，表明仪器精密度良好。

取提取物溶液D组，按照“2.3.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件依次进样，各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%，表明该方法重复性良好。

取提取物溶液D组，按照“2.3.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进样，记录指纹图谱。各共有峰相对于参照峰的保留时间及峰面积的RSD值均<3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

取混合对照品溶液及9组提取物供试品溶液，按照上述色谱条件依次进样，记录色谱图。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）进行数据分析匹配，采取中位数法建立对照指纹图谱（R），见图1，通过与混合对照品溶液HPLC图谱（图2）比对，结合光谱图分析，确认4号峰为阿魏酸、6号峰为盐酸表小檗碱、7号峰为盐酸药根碱、8号峰为盐酸巴马汀、9号峰为盐酸小檗碱。计算各组黄连提取物溶液指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果表明，各指纹图谱相似度在0.990~1之间，相似度良好，结果见表1。

依照美国临床和实验室标准协会（CLSI）所发布要求规范，采用微量肉汤稀释法^[16-17]进行黄连提取物的体外抑菌试验，分别设置试验组、阴性对照组、阳性对照组、空白对照组。取无菌96孔板：于A1~A10孔中分别加入药材浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.098 g/L的提取物溶液100 µl，再加入浓度为10⁵～10⁶ cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬液100 µl，作为实验组；B1~B10孔依次加入系列提取浓度物溶液（同A1~A10）100 µl，再加入TBS培养基，作为阴性；A12孔加入经灭菌的纯化水与菌悬液各100 µl，作为阳性对照组；B12孔中加入经灭菌的纯化水与TBS培养基各100 µl，作为空白对照组；每组平行3次，于405 nm波长下的酶标仪测定吸光度值（A），抑菌率使用以下公式计算：

以各共有峰的峰面积作为各组提取物指纹图谱的数据表达，以药材浓度为0.781 g/L的供试品溶液抑菌率作为黄连抑菌效果的表达（该药物浓度下，9组提取物供试品溶液抑菌率具有明显差异，0.781 g/L为药材抑制金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度），结果见表2。

本实验考察不同提取工艺以及不同提取溶剂的黄连提取物溶液中化学组分对金黄色葡萄球菌抑菌率的影响程度，以抑菌率为母序列（参考序列），记作X₀（k），k=1、2、3…9；以9个标志峰的峰面积作为子序列（比较序列），记作X_i（k），i=1、2…9，k=1、2、3…9。

本实验采用均值化法数据，即取各个序列的元素与相应序列的平均值的比值，计算公式为${{X}}'_{{i}} $（k）=X_i（k）/X_i，其中i=1、2…9，k=1、2、3…9。其中X_i为序列i中样本数据的平均值，X_i（k）为原数据，${{X}}'_{{i}} $（k）为无纲量化处理后的数据，从而得到序列[${{X}}'_{{i}} $（k）]。计算母序列与子序列差值的绝对值ΔX_i（k）=|${{X}}'_{{i}} $（k）−${{X}}'_{\mathrm{0}} $（k）|。

灰色关联系数ζ_i（k）表示参考序列X₀和比较序列X_i在序列k时的关联程度，使用以下公式计算：

其中，i=1、2…9，k=1、2、3…9，$ \left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $为序列与序列在k点差值的绝对值；$ \underset{{i}}{\rm{min}}\underset{{k}}{\mathrm{min}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $为在各序列差值最小值的基础上，进一步得出所有序列的差值最小值，$ \underset{{i}}{\mathrm{max}}\underset{{k}}{\mathrm{max}}\left|{{X}}_{0}({k})-{{X}}_{{i}}({k})\right| $为在各序列差值最大值的基础上，进一步得出所有序列的最大值，$ \mathrm{\rho } $为分辨系数，0≤$ \mathrm{\rho } $≤1，本实验取$ \mathrm{\rho } $=0.5。

灰色关联度$ {\mathrm{\gamma }}_{0} $i=$ \dfrac{1}{{n}}\displaystyle\sum\nolimits_{{k}=1}^{9}\mathrm{\zeta }\mathrm{i}\left(\mathrm{k}\right)$，式中n为任一序列i下的样本数，本实验中n=9。序列${{X}}'_{{i}} $（k）与${{X}}'_{\mathrm{0}} $（k）之间的关联极性$ {\mathrm{\sigma }}_{{i}} $计算如下：

其中i=1、2…9，k=1、2、3…9，n=9；若sgn（$ {\mathrm{\sigma }}_{{i}} $）= −sgn（$ {\mathrm{\sigma }}_{0} $），则表示X_i与X₀负相关，即前者对后者起到减弱作用，sgn（X）为符号函数，即sgn（X）=$ \left\{\begin{array}{l}1,X > 1\\ 0,X=1\\ -1,X < 1\end{array}\right. $。

通过灰色关联分析方法对黄连提取物谱-效关系进行分析，结果见表3。由结果可知，组分3、8、9对抑菌起到增强作用外，关联度最高的是峰9（盐酸小檗碱），其关联度为0.803 3。

试验前期，分别考察甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-0.1~0.5%磷酸、甲醇-冰醋酸等流动相体系；考察不同厂家、不同粒径色谱柱对黄连提取物的分离效果，综合考虑分离效果、基线平稳与多数色谱峰峰形等因素，最终选用依利特Kromasil C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱、选择用乙腈-0.1%磷酸作为流动相，同时在每1000 ml磷酸溶液中加入500 µl三乙胺来改善峰型，梯度洗脱达到更好的分离效果。采用DAD全波长范围扫描，结合三维光谱图分析，最终选择色谱峰数量较多，反映信息较全面的278 nm作为检测波长。抑菌试验时，考虑到提取溶剂甲醇、盐酸对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，在预实验阶段尝试采用水浴蒸干、纯化水复溶的方法来考察溶剂对于实验结果的影响，结果表明溶剂对抑菌效果的影响不明显。

本试验采用谱-效结合方法，建立HPLC对不同提取溶剂、不同提取方法的9 种黄连提取物进行指纹图谱分析，标定共有特征峰；通过酶标仪测定吸光度法，计算提取物抑菌率；运用灰色关联分析方法对提取物的指纹图谱与抑菌率进行关联分析。但3号共有峰不能标定，且抑菌试验仅以金黄色葡萄球菌为代表，存在一定局限性，因此试验仍需进一步深入研究，为探索黄连抑菌的质量标志物及黄连药材质量控制的建立等方面的研究提供参考。