Preparation and evaluation of folic acid-modified liposomal vaccines based on natural IgM adjuvant

R206D 旋转蒸发仪（上海申生）；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝）；Zetasizer nano 马尔文粒径仪（英国Malvern）；H2050R-1台式高速冷冻离心机（湖南湘仪）；FLAscent全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific）；Tanon-2500凝胶成像系统（上海Tanon）；MQD-A2R双层控温摇床（上海旻泉）；超纯水系统（德国Sartorius）；TCS SP5 Ⅱ激光共聚焦显微镜（德国leica）; DYY-6C凝胶电泳仪（六一仪器）。

氢化磷脂酰胆碱（HSPC），mPEG₂₀₀₀-DSPE（上海艾伟拓）；PBST干粉（上海泰坦）；胆固醇（CHOL）（上海麦克林）； FA-DSPE-mPEG₃₄₀₀（本实验室合成，HPLC检测纯度98.7%）；快速银染试剂盒，TMB显色液，封闭液，BCA蛋白浓度测定试剂盒，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG抗体，超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天）；HRP标记山羊抗小鼠IgM抗体（Abcam）；FITC标记驴抗小鼠IgM抗体（Jackson Immuno）；牛血清白蛋白（BSA），十二烷基硫酸钠（SDS）和Tris-base（国药集团）；DiD荧光素，卵清蛋白（OVA，大连美伦）；高结合力96孔酶联免疫吸附法(ELISA)板（Greiner）。

C57BL/6小鼠（雌性，6~8周龄，体重18~20 g，杭州子源实验动物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004）、BALB/c小鼠 [雌性，6~8周龄，体重18~20 g，上海必凯科翼生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2023-0009]，动物实验经过海军军医大学实验动物伦理委员会批准，并按照动物伦理学要求进行。

采用薄膜水化法制备叶酸脂质体疫苗。按照表1，精密称取处方量的HSPC，CHOL，DSPE-mPEG₂₀₀₀和FA-DSPE-mPEG₃₄₀₀，用适量的氯仿溶解混合。减压旋蒸后，加入OVA的生理盐水溶液，60 ℃水化1 h，160 W探头超声10 min。超声后置于液氮与37 ℃水浴反复冻融数次。冻融后采用10 000 r/min低温高速离心30 min，弃上清液，并用生理盐水重悬两次。过0.22 μm微孔滤膜，得到叶酸修饰的脂质体疫苗，命名为FA-sLip/OVA，4 ℃保存备用。以相同的方法制备未经叶酸修饰的脂质体疫苗，命名为sLip/OVA。马尔文粒径仪测定其粒径、多分散性指数（PDI）及Zeta电位。

以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定叶酸脂质体疫苗中OVA浓度。方法参考试剂盒说书，配制蛋白标准溶液和工作液，并加至96孔板中。取2 μl脂质体加至96孔板中，再用PBS稀释到20 μl，37 ℃孵育25 min，每个样品设置3个复孔。用酶标仪测定562 nm波长处的吸光度。以吸光度值（A）和标准溶液浓度绘制标准曲线，得到标准曲线方程，将样品吸光度值带入方程可得样品蛋白浓度，并通过以下公式计算OVA的包封率。

采用ELISA法检测叶酸脂质体疫苗与IgM的结合能力。50 μl脂质体铺于高结合力板中，4 ℃孵育过夜。弃去孔内液体，并用PBST洗涤。加入5 % BSA溶液于37 ℃孵育封闭1 h。加入梯度稀释的C57BL/6小鼠血清于 37 ℃孵育1 h。PBST洗涤后加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgM抗体， 37 ℃孵育1 h。PBST洗涤后，加入TMB显色液，室温避光反应，15 min后加入0.18 mol/L硫酸终止液。用酶标仪测450 nm处的吸光度值（A₄₅₀）。

麻醉C57BL/6小鼠，眼眶取血，收集血清。分别取等体积的叶酸脂质体疫苗与血清至低蛋白吸附管中，37 ℃孵育1 h。加入预冷的PBS稀释至800 μl，14 000×g低温高速离心30 min，收集沉淀。将所得蛋白金属浴10 min，取出冷却至室温，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，取出胶板。一方面按照银染试剂盒操作说明进行蛋白银染。另一方面，继续恒流400 mA转膜25 min。电泳完毕取出PVDF膜，将膜置于封闭液中，再置于摇床上室温缓慢封闭1 h。倒尽封闭液，加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgM抗体，置于摇床上37 ℃孵育1 h。抗体孵育完后，用PBST快速洗涤。洗涤完成后加入ECL发光显色液，避光反应后用成像仪曝光显色。

按表1的处方并加入适量的DiD荧光素，氯仿溶解并成膜。并照“2.1”项下方法制备负载DiD的脂质体，命名为sLip/DiD和FA-sLip/DiD。经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内，并于给药4 h后收集脾脏。脾脏冷冻切片，DAPI染核，FITC标记的IgM抗体标记小鼠脾脏边缘B细胞，利用激光共聚焦观察脂质体在脾脏中的分布。

C57BL/6小鼠随机分为3组，每组5只，分别为Free OVA、sLip/OVA和FA-sLip/OVA。通过静脉免疫，按20 μg OVA/只的剂量给药，7 d给药1次，共免疫3次。小鼠末次免疫接种完成后第7天取血，3 500 r/min低温离心15 min，获得血清。ELISA法测定小鼠血清中的特异性IgG抗体滴度。

制得未经叶酸修饰的脂质体疫苗（sLip/OVA），溶液呈白色乳光，平均粒径约103.7 nm，分布良好。叶酸修饰的脂质体疫苗（FA-sLip/OVA），溶液呈现淡黄色乳光，粒径稍有增大，约117.2 nm（表2）。叶酸脂质体疫苗的粒径分布见图1。

通过BCA试剂盒测得的标准曲线方程Y=0.221 2X+0.110 8，线性关系良好（r=0.997 4）。经计算可得，FA-sLip/OVA的OVA含量为1.35 mg/ml，包封率为26.94%。sLip/OVA的OVA含量为1.39 mg/ml，包封率为27.76%。

脂质体疫苗与血清中IgM相互作用结果如图2所示，脂质体通过叶酸修饰，显著增强了与IgM的结合力。

SDS-PAGE分析脂质体疫苗与血清孵育得到的蛋白冠，在分子量约为72 000处可见明显的蛋白条带。且FA-sLip/OVA组的IgM吸附量多于sLip/OVA的IgM吸附量（图3A）。Western Blot同样证实FA-sLip/OVA组的IgM吸附量多于sLip/OVA组的IgM吸附量（图3B）。

图4显示了脂质体疫苗在体内对脾脏B细胞的初步靶向性。通过激光共聚焦观察小鼠脾脏冷冻切片，观察叶酸脂质体的脾脏内分布，结果显示，叶酸脂质体更多地分布在脾脏的边缘区域（图4B），与IgM抗体标记的脾脏边缘B细胞（图4C）具有较好的重叠（图4D）。以上结果提示，叶酸脂质体具有良好的脾脏边缘B细胞靶向性。

通过间接酶联免疫吸附测定法检测小鼠血中特异性IgG抗体，结果显示如图5。结果表明脂质体疫苗给药后，能在一定时间内保持较高的抗体滴度。其中，叶酸修饰的脂质体疫苗可以刺激机体产生更高的抗体滴度水平。

本实验采用经典的薄膜水化法制备叶酸修饰脂质体疫苗，工艺简便，技术成熟，并采用反复冻融法增加了模型抗原的包封率^[22]。静脉给药后，叶酸脂质体疫苗在血浆中能够特异性结合天然IgM，并将其吸附于表面形成“蛋白冠”，发挥IgM天然佐剂的作用，通过补体受体和FcμR途径^[1,11–13]，增强了叶酸脂质体疫苗对脾脏B细胞的靶向能力，能刺激小鼠产生较为持久的、较高水平的抗体滴度。因此，本文提出的基于天然IgM佐剂的叶酸脂质体疫苗，可在IgM的靶向赋能下提高机体免疫应答，为纳米疫苗研究提供一种新思路。