Quality evaluation of Jianggui granules by HPLC fingerprint combined with chemometrics

LC-16型高效液相色谱仪、AUW120D型电子分析天平（十万分之一）、AEL-160型电子分析天平（万分之一）（岛津公司）；KQ3200型超声波清洗机（杭州微米派科技有限公司）。

葛根素对照品（批号：110752-201615，纯度：95.4%）、甘草苷对照品（批号：111610-201607，纯度：93.1%）、肉桂酸对照品（批号：110786-200503，纯度：98.8%）、桂皮醛对照品（批号：110710-202022，纯度：99.5%）均购自中国食品药品检定研究院；甘草酸铵对照品（批号：wkq21021808，纯度≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈（均为色谱纯，Sigma公司），其余均为分析纯。姜桂颗粒共14批（编号依次为S1~S14），均由解放军北部战区总医院制剂室生产。

色谱柱：Agilent C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）系统，梯度洗脱（0~18 min，10%~8% B；18~100 min，8%~33% B；100~115 min，33%~40% B；115~116 min，40%~10% B；116~125 min，10%~10% B）^[5-6]；流速：1.0 ml/min；检测波长：265 nm；柱温为30℃；进样量为10 µl。

取本品1 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇30 ml，称定重量，超声波处理30 min，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量^[7-9]，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

精密称取葛根素、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵5种对照品适量，分别置量瓶中，加甲醇配制成浓度为630、80、20、240、170 μg/ml的储备液，然后分别精密量取5种对照品各1 ml，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成葛根素、甘草苷、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵混合对照品溶液，对照品浓度分别为63、8、2、24、17 μg/ml。

取“2.2.1”项下的供试品溶液（编号S1），按照“2.1”项下的色谱条件，连续进样6次^[10]，记录HPLC图。以桂皮醛为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果其RSD分别≤1.22%、≤3.90%（n=6），表明该仪器精密度良好。

取样品（编号S1）适量，共6份，按照“2.2.1”项下的方法制备6份供试品溶液，再按照“2.1”项下的色谱条件进样测定。以桂皮醛为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果其RSD分别≤0.93%、≤4.63%（n=6），表明该试验方法重复性好^[11]。

取“2.2.1”项下供试品溶液，分别在室温条件下下放置0、4、8、12、16、20、24 h，再按照“2.1”项下的色谱条件进行测定。以桂皮醛为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果其RSD分别≤0.44%、≤1.50%（n=7），表明此供试品溶液在室温下放置24 h基本稳定。

取14批姜桂颗粒（编号依次为 S1～S14）样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。将得到的所有图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，以各成分色谱响应均较强的S1样品为参照，采用中位数法，时间窗宽度为0.3 min，选择多点校正的方法，并选择Mark峰匹配^[12-14]，生成姜桂颗粒的HPLC叠加指纹图谱和对照图谱（R）。结果显示，姜桂颗粒的14批样品中，有18个共有峰。结果见图1。

分别取“2.2.2”项下混合对照品溶液和“2.2.1”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录HPLC图（图2）。通过供试品溶液与混合对照品溶液的比对，共指认出了 5个共有峰，分别为葛根素（8号峰）、甘草苷（14号峰）、肉桂酸（16号峰）、桂皮醛（17号峰）、甘草酸铵（18号峰）。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》，对14 批姜桂颗粒指纹图谱的相似度进行评价^[14-17]。结果显示，14批姜桂颗粒的指纹图谱与对照图谱的相似度均>0.9，表明这14批姜桂颗粒制剂工艺较稳定，不同批次间化学成分组成差异较小，结果见表1。

以18个共有峰的峰面积为变量，以平方欧氏距离为度量标准，采用SPSS 25.0软件进行聚类分析^[18-19]。结果显示，当类间距离为10时，14批样品可聚为两类，其中，S1和S4为一类，剩下的样品为一类，表明这14批次样品的成分含量存在一定的差异，这可能与药材来源、采收和生产加工工艺有关，结果见图3。

以18个共有峰峰面积为原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，采用SPSS 25.0软件进行主成分分析^[20]。结果显示，前2个主成分的特征值>1，累计方差贡献率为96.61%，结果见表2。主成分载荷矩阵见表3，它反映了各变量对主成分的贡献程度。由表3可知，主成分1主要反映了1~4、7~15及18 号峰的信息；主成分2主要反映了 5、6、16、17 号峰的信息。通过成分得分系数矩阵计算综合得分可以评价姜桂颗粒的整体质量。计算各样本综合得分并进行排序，初步对 14 批样品进行分析，综合得分高者为优，14 批样品中以 S4 批次为最优，结果见表4。

以18个共有峰的峰面积为变量，采用 SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法-判别分析。变量重要性投影（VIP）值可用来衡量各共有峰的表达模式对样本分类判别的影响强度和解释能力，以辅助筛选质量标志性差异物^[21-22]，若VIP值>1，表明该色谱峰为具有统计学意义的差异标志物^[23]。不同批次的姜桂颗粒样品之间存在一定差异，同时结果也显示有11个共有峰VIP值>1，包括葛根素（8号峰）、甘草苷（14号峰）、桂皮醛（17号峰）、甘草酸铵（18号峰）。以上结果表明这11种成分对不同批次姜桂颗粒的质量一致性有一定的影响，可作为姜桂颗粒质量差异的特征成分，在生产过程的质量控制中可重点关注它们的变化情况，结果见图4。

本课题通过指纹图谱得出，14批姜桂颗粒有18个共有峰，并指认出了葛根素（8号峰）、甘草苷（14号峰）、肉桂酸（16号峰）、桂皮醛（17号峰）和甘草酸铵（18号峰）5个成分，其中，葛根标定了1个成分，甘草标定了2个成分，肉桂标定了2个成分。进一步采用化学计量分析方法考察了姜桂颗粒的整体性和差异性，主成分分析发现，前 2个主成分的特征值> 1，表明这2 个成分能够概括样品中的绝大部分信息。聚类分析结果显示，当类间距离为10时，14批样品可聚为2类，其中S1和S4为一类，剩下的样品为一类，表明这14批次样品中含有的成分含量有所不同，进一步说明不同原药材厂家及不同批次原药材对制剂质量的均一稳定性产生了一定影响。其中，14批原药材或者采自不同厂家，或者采自相同厂家不同批次，S1至S4为不同厂家提供的原药材，S1、S5、S9、S13为同一厂家不同批次，S2、S6、S10、S14为同一厂家不同批次，S3、S7、S11为同一厂家不同批次，S4、S8、S12为同一厂家不同批次。正交偏最小二乘法-判别分析结果显示，有11个共有峰VIP值>1，表明这11个成分可能是影响姜桂颗粒质量的差异标志物，这种差异跟原药材的质量、制剂的提取和制备工艺均有关。

综上所述，本研究所建立的指纹图谱分析方法稳定可靠、简便易行、高效快速，能够进一步结合化学计量法对指纹图谱进行综合评价，能够较全面地反映制剂的整体信息和特征信息^[24]，为姜桂颗粒的质量控制提供了科学依据。